郭瑞珍，蘇冰倩，王 棋，王 一，于朋偉，孟潔潔，齊艷麗，楊國宇，褚貝貝

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)部動物生化與營養(yǎng)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450002)

禽腺病毒 (fowl adenovirus,FAdV)屬于腺病毒科Adenovirudae，是一種無囊膜的雙鏈DNA病毒[1]，根據(jù)分子生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)可將FAdV屬分成A～E 5個群，每個群內(nèi)的病毒株依據(jù)血清交叉中和試驗(yàn)又進(jìn)一步分為不同的血清型[2]。流行病學(xué)研究表明，雞群主要FAdV流行毒株為高致病性血清4型禽腺病毒 (fowl adenovirus serotype 4,FAdV-4)，可引起一種高度傳染性雞肝炎心包積液綜合征[3](hepatitis-hydropericardium syndrome,HHS)，該病毒呈世界性分布，危害嚴(yán)重[4]。自2015年以來，由FAdV-4引起的HHS不僅發(fā)生于3～4周齡肉雞，還發(fā)生于10～20周齡蛋雞[5]，主要以垂直傳播方式傳給下一代，也可通過糞口途徑進(jìn)行水平傳播，死亡率高達(dá)80%，給國內(nèi)養(yǎng)雞業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[6]。此外，測序分析顯示，與其他國家和地區(qū)的FAdV-4分離株相比，國內(nèi)近期的FAdV-4分離株具有獨(dú)特的突變，其基因組存在明顯的缺失[7]。然而，關(guān)于FAdV-4的感染和發(fā)病機(jī)制的分子機(jī)制卻知之甚少，且對全球家禽業(yè)造成了嚴(yán)重的影響。

FAdV-4的核衣殼由五鄰體 (penton)、六鄰體 (hexon)和纖突蛋白 (Fiber)等主要結(jié)構(gòu)蛋白構(gòu)成[8-9]。Fiber蛋白分為一條長纖維 (Fiber 1)和一條短纖維 (Fiber 2)，其中Fiber 2蛋白可通過識別宿主細(xì)胞上的特異受體而幫助病毒吸附結(jié)合在宿主細(xì)胞上，在病毒增殖或組裝的某些過程中是必需的[10]。此外，F(xiàn)iber2蛋白還具有型和亞群特異性抗原決定簇，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生主要的型特異性中和抗體[11]。因此，F(xiàn)iber2對FAdV-4的感染、致病及診斷有重要意義[12]。國內(nèi)流行的FAdV-4基因型與國外早期的FAdV-4株相比，F(xiàn)iber2基因發(fā)生了較大的變異[13]。流行病學(xué)調(diào)查顯示，相同血清型的不同F(xiàn)AdV株的致病性也存在很大差異[14]。因此，推測FAdV-4在傳播過程中的變異導(dǎo)致毒力的變化。此外，有研究表明，F(xiàn)iber2基因在FAdV-4毒力中起關(guān)鍵作用[14-16]，所以，有必要對其進(jìn)行分析。目前，國內(nèi)研究表達(dá)的Fiber2蛋白多為包涵體，而且缺乏相關(guān)Fiber2單抗的研究[17]。由于缺乏針對FAdV-4纖維蛋白的單克隆抗體 (MAb)，此類研究的進(jìn)展受到嚴(yán)重限制。因此，本研究以國內(nèi)的1株FAdV-4的Fiber2基因?yàn)槟０?，通過對Fiber2基因密碼子優(yōu)化后進(jìn)行原核表達(dá)，獲得可溶性蛋白，并免疫小鼠，制備了一種新的針對Fiber2蛋白的單克隆抗體 (命名為MAb 2G5)，并對其表位進(jìn)行了鑒定。MAb 2G5進(jìn)行純化，經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)具有良好的反應(yīng)性和特異性，為研發(fā)FAdV-4相關(guān)的診斷試劑及疫苗提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

FAdV-4 (分離自河南某養(yǎng)雞場)、SP2/0骨髓瘤細(xì)胞 (ATCC)、雞肝癌細(xì)胞 (LMH,ATCC)。FAdV-4Fiber2基因由上海金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行密碼子優(yōu)化并合成。帶有不同促溶標(biāo)簽的原核表達(dá)載體pET21b-His6-Grifin-TEV (276-2)、pET21b-His6-GST-TEV (276-3)、pET21b-His6-NusA-TEV (276-5)、pET21b-His6-SUMO-TEV (276-6)、pET21b-His6-Thioredoxin-TEV (276-7)、pET21b-His6-ArsC-TEV (276-9)、pET21b-His6-γ-crystallin-TEV (276-16)、pET21b-His6-PpiB-TEV (276-21)以及大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞均由本實(shí)驗(yàn)室保存。表達(dá)FAdV-4 Fiber2的pCAGGS-HA-Fiber2真核表達(dá)質(zhì)粒為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建、保存。6～8周齡的雌性SPF級BALB/c小鼠購自鄭州大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室。Ni-NTA Agarose購自QIAGEN；雜交瘤細(xì)胞無血清培養(yǎng)基Ⅲ購自上海源培生物有限公司；小鼠抗His單抗購自中杉金橋公司；AEC酶底物顯色試劑盒購自北京中杉金橋；FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG以及HAT、HT貯存液、融合劑PEG1450均購自Sigma公司；DAPI染色試劑購自Servicebio (G1012)；小鼠IgG干粉購自Solarbio；小鼠單克隆抗體亞類鑒定試劑盒購自Sino Biological；Protein G Resin購自TRAN；HRP-偶聯(lián)試劑盒 (過碘鹽酸法)購自酶免生物科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及驗(yàn)證 基于FAdV-4纖突蛋白Fiber2基因序列，引入BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)，對序列中大腸桿菌稀有密碼子進(jìn)行分析，然后由金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行優(yōu)化合成，再亞克隆到帶有不同促溶標(biāo)簽的原核表達(dá)載體上，經(jīng)過酶切鑒定，得到帶有不同促溶標(biāo)簽的Fiber2重組質(zhì)粒。

1.2.2 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和可溶性分析 通過熱激法將鑒定正確的不同重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至表達(dá)菌株BL21中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，挑取單克隆菌株，在37 ℃、220 r·min-1下振蕩培養(yǎng)至OD600 nm為0.6左右，加入終濃度為0.5 mmol·L-1的IPTG于18 ℃、180 r·min-1誘導(dǎo)12 h，收集菌體進(jìn)行超聲破碎，10 000 r·min-1離心10 min后收集上清液和沉淀，通過SDS-PAGE電泳后利用考馬斯亮藍(lán)染色檢測重組蛋白的表達(dá)量及可溶性。

1.2.3 重組蛋白的純化及Western blot鑒定 選取可溶性最好的重組蛋白NusA-Fiber2，按照“1.2.2”中方法大量誘導(dǎo)表達(dá)，參照QIAGEN生物科技有限公司Ni-NTA Agarose操作技術(shù)手冊純化Fiber2蛋白，同時以此方法純化促溶標(biāo)簽NusA蛋白，通過SDS-PAGE電泳后檢測蛋白純度。利用聚氰基丙烯酸正丁酯法(bicinchoninic acid,BCA)測定純化的蛋白濃度，定量至1 mg·mL-1后于-80 ℃ 保存。純化后的NusA-Fiber2蛋白和NusA蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后濕轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride,PVDF)，室溫條件下，用5%脫脂奶封閉2 h，再分別以His單抗(1∶1 000 稀釋)和FAdV-4鼠源多克隆血清 (1∶1 000稀釋)為一抗，于4 ℃孵育12 h，TBST (0.1% Tween-20 phosphate buffer saline)洗3遍。二抗為HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG (1∶5 000稀釋)，室溫條件下孵育1 h；TBST洗滌3次，顯影曝光分析純化的Fiber2蛋白的免疫原性。

1.2.4 間接ELISA檢測方法的建立 采用方陣滴定法確定抗原 (NusA-Fiber2蛋白)最佳包被濃度和陽性血清的最佳稀釋度，HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG作1∶5 000稀釋。其他步驟按照常規(guī)ELISA程序[12,17-19]，以此確定抗原最佳包被濃度和血清最適稀釋度。

1.2.5 免疫過氧化物酶單層細(xì)胞試驗(yàn)(immunoperoxidase monolayer assay,IPMA) 將LMH細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待形成約90%細(xì)胞單層時，F(xiàn)AdV-4以MOI等于0.01接種細(xì)胞，置于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,用含3% H2O2甲醇固定，該板可立即使用也可凍存于-40 ℃?zhèn)溆?，用封閉液于37 ℃封閉1 h，PBST洗1次，加入一抗，同時設(shè)置不接種病毒的陰性對照和不加一抗的空白對照，37 ℃孵育1.5 h，PBST洗4次，加入酶標(biāo)二抗，37 ℃孵育1 h，PBST洗4次，加入AEC顯色液，室溫避光作用10 min后，于倒置顯微鏡下觀察結(jié)果，陰性對照和空白對照均無著色，細(xì)胞特異性染色成紅棕色即為陽性，否則為陰性。

1.2.6 小鼠免疫 將純化的NusA-Fiber2蛋白按100 μg·只-1的劑量與弗氏佐劑1∶1乳化后免疫6周齡BALB/c雌鼠，第3次免疫后，對免疫小鼠進(jìn)行尾靜脈采血，用已建立的間接ELISA方法和 IPMA方法鑒定其抗體分泌水平，抗體水平高的小鼠加強(qiáng)沖擊1次。

1.2.7 細(xì)胞融合及陽性雜交瘤細(xì)胞篩選 取加強(qiáng)免疫后的小鼠脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞進(jìn)行融合。用間接ELISA及IPMA法篩選分泌抗FAdV-4 Fiber2抗體的陽性雜交瘤細(xì)胞，對篩選出的陽性雜交瘤細(xì)胞采用有限稀釋法進(jìn)行4次亞克隆以建立穩(wěn)定細(xì)胞株。雜交瘤細(xì)胞建株后進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)、凍存保種。

1.2.8 腹水的制備、MAb的純化和標(biāo)記 向12周齡的BALB/c雌鼠腹腔注射0.3 mL不完全弗氏佐劑，1周后，取2×106～5×106個對數(shù)増殖期的單克隆細(xì)胞2G5進(jìn)行腹腔注射，當(dāng)小鼠腹腔明顯脹大時，使用注射器收集腹水。收獲的腹水用Protein G柱子進(jìn)行純化，參照Protein G柱子說明書進(jìn)行。純化后的腹水通過SDS-PAGE分析，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色鑒定其純度。通過BCA法測定純化的抗體濃度后，使用HRP-偶聯(lián)試劑盒 (過碘鹽酸法)對抗體進(jìn)行HRP標(biāo)記。

1.2.9 單克隆抗體生物學(xué)特性分析 單克隆細(xì)胞染色體數(shù)目分析：取對數(shù)增殖期的單克隆細(xì)胞以及SP2/0細(xì)胞，加入0.3 mg·mL-1的秋水仙素液，37 ℃培養(yǎng)6 h后收集細(xì)胞，低滲處理、固定、制片、吉姆薩染色、脫色、鏡檢并拍照，最后進(jìn)行染色體計數(shù)并分析。單克隆細(xì)胞分泌抗體的穩(wěn)定性分析：將雜交瘤細(xì)胞連續(xù)傳代培養(yǎng)3個月，用“1.2.4”建立的間接ELISA方法和“1.2.5”中IPMA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中的抗體分泌水平，分析雜交瘤細(xì)胞分泌抗體的穩(wěn)定性；MAb的腹水效價測定及亞類鑒定：將“1.2.8”中純化的腹水進(jìn)行2倍倍比稀釋，按照“1.2.4”建立的間接ELISA方法和“1.2.5”中IPMA檢測方法進(jìn)行效價測定。同時采用Sino Biological小鼠單克隆抗體亞類鑒定試劑盒進(jìn)行抗體亞類鑒定。

1.2.10 單克隆抗體的間接免疫熒光 (IFA)檢測 將雞肝癌細(xì)胞LMH鋪于24孔板，待LMH單層生長至80%～90%后，用MOI為0.01 的FAdV-4進(jìn)行感染，同時設(shè)立正常細(xì)胞為陰性對照。感染24 h后，棄上清液，用預(yù)冷的4%多聚甲醛于室溫下固定細(xì)胞20 min，PBS洗滌3次；用0.1%TritonX-100于室溫通透細(xì)胞膜10 min，PBS洗滌3次；使用含10%胎牛血清的PBS于室溫下封閉1 h，PBS洗滌3次；將適當(dāng)稀釋的小鼠IgG (mouse IgG)和制備的Fiber2單克隆抗體 (mAb 2G5)與固定的細(xì)胞于37 ℃共孵育1 h，PBS洗滌3次，加入稀釋后的FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG (1∶1 000)，于37 ℃避光孵育1 h后，PBS洗3次；加入DAPI染色試劑于室溫避光孵育10 min，PBS洗滌3次、雙蒸水洗滌3次；加入封片劑封片后置于熒光顯微鏡下觀察、分析并采集圖像。

1.2.11 單克隆抗體的Western blot鑒定 用MOI為0.01的FAdV-4感染LMH細(xì)胞，或轉(zhuǎn)染pCAGGS-HA-Fiber2質(zhì)粒的LMH細(xì)胞，收取細(xì)胞蛋白后，經(jīng)SDS-PAGE 電泳后濕轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯膜 (polyvinylidene fluoride，PVDF)，室溫條件下，用5%脫脂奶封閉2 h，PBST洗滌3次后，加入制備的Fiber2單克隆抗體 (1∶1 000稀釋)于4 ℃孵育12 h；PBST洗滌3次后，加入HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG (用5%脫脂奶按1∶5 000稀釋)；PBST洗滌3次后，顯影曝光并分析試驗(yàn)結(jié)果。

1.2.12 單克隆抗體的體外中和試驗(yàn) 在96孔板內(nèi)，將系列稀釋的MAb 2G5 50 μL與MOI等于0.001的FAdV-4病毒液等體積混勻，放置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育1 h。隨后接種LMH細(xì)胞，100 μL·孔-1，同時設(shè)置Mouse IgG 陰性對照和LMH細(xì)胞空白對照，37 ℃孵育2 h后，用PBS洗滌1次，隨即加入含1%胎牛血清的DME/F-12培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，3 d后在倒置顯微鏡下觀察病毒的復(fù)制情況。

1.2.14 抗原表位篩選 為篩選出MAb 2G5所識別的抗原表位，首先將Fiber2蛋白截為兩段，命名為N1、C2，根據(jù)Fiber2蛋白的基因序列設(shè)計合成引物，并以其為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物N1、C2部分重疊，將其分別克隆于pCAGGS-HA載體中，將構(gòu)建的兩個重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染LMH細(xì)胞后分別以MAb Flag (1∶800)和純化的MAb 2G5 (1∶1 000)作為一抗，辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG (1∶5 000)為二抗對獲得的MAb 2G5進(jìn)行Western blot鑒定，初步確定MAb 2G5所識別的抗原區(qū)域，根據(jù)鑒定結(jié)果，再將N1的基因片段從5′端采用逐步截短法分成N3、N4、N5、N6、N7、N8、N9、N10、N11和N12，以上述Western blot方法進(jìn)一步鑒定MAb 2G5識別的抗原表位區(qū)域。

2 結(jié) 果

2.1 重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定

將公司合成大腸桿菌偏好密碼子的Fiber2基因序列 (1 440 bp)及帶有不同促溶標(biāo)簽的表達(dá)載體進(jìn)行BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切，使用T4連接酶連接雙酶切產(chǎn)物。提取重組質(zhì)粒后進(jìn)行NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切驗(yàn)證，酶切結(jié)果與預(yù)期大小相符，重組質(zhì)粒命名為276-2-Fiber2、276-3-Fiber2、276-5-Fiber2、276-6-Fiber2、276-7-Fiber2、276-9-Fiber2、276-16-Fiber2、276-21-Fiber2 (圖1)。

A.載體BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定；B.目的片段BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定；C.重組質(zhì)粒酶切鑒定；M.DL5000 DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1～8.276-2、276-3、276-5、276-6、276-7、276-9、276-16、276-21雙酶切片段；9.FAdV-4 Fiber2雙酶切片段(1 440 bp)；10～17.Grifin-Fiber2、GST-Fiber2、NusA-Fiber2、SUMO-Fiber2、Thioredoxin-Fiber2、ArsC-Fiber2、γ-crystallin-Fiber2、PpiB-Fiber2A.Restriction enzyme digestion of vectors;B.Restriction enzyme digestion of target fragment;C.Restriction enzyme digestion of recombinant plasmids;M.DL5000 DNA marker;1-8.276-2,276-3,276-5,276-6,276-7,276-9,276-16,276-21;9.FAdV-4 Fiber2 (1 440 bp);10-17.Grifin-Fiber2,GST-Fiber2,NusA-Fiber2,SUMO-Fiber2,Thioredoxin-Fiber2,ArsC-Fiber2,γ-crystallin-Fiber2,PpiB-Fiber2圖1 載體、目的片段雙酶切及重組質(zhì)粒酶切鑒定Fig.1 Restriction enzyme digestion of vectors and target fragment and restriction enzyme digestion of recombinant plasmids

2.2 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及可溶性分析

將鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株BL21中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE電泳分析表達(dá)蛋白，如圖2所示，帶有不同促溶標(biāo)簽的重組蛋白經(jīng)誘導(dǎo)后均出現(xiàn)預(yù)期大小的目的蛋白，其中重組蛋白Grifin-Fiber2、GST-Fiber2、NusA-Fiber2、SUMO-Fiber2、ArsC-Fiber2、γ-crystallin-Fiber2、PpiB-Fiber2表達(dá)產(chǎn)物以可溶性的形式存在于上清液中，重組蛋白Thioredoxin-Fiber2表達(dá)產(chǎn)物以包涵體的形式存在于沉淀中。綜合結(jié)果，選取可溶性最好的NusA-Fiber2進(jìn)行后續(xù)研究。

圖2 重組蛋白的可溶性分析Fig.2 The solubility analysis of the recombinant protein

2.3 重組蛋白的純化及Western blot鑒定

誘導(dǎo)表達(dá)的重組蛋白NusA-Fiber2及標(biāo)簽蛋白NusA使用Ni-NTA Agarose純化，如圖3A、B所示，以不同濃度咪唑洗脫，摸索蛋白純化最佳條件，各步驟樣品分別做SDS-PAGE電泳分析，NusA蛋白和NusA-Fiber2蛋白的咪唑洗脫緩沖液濃度分別為100、500 mmol·L-1，純化后的蛋白用BCA法測定蛋白濃度分別為1.125、2.364 mg·mL-1，均定量為1 mg·mL-1后保存于-80 ℃?zhèn)溆?。將純化的NusA-Fiber2及NusA蛋白進(jìn)行Western blot鑒定，如圖4A、B所示，純化的NusA-Fiber2蛋白和NusA蛋白均能與His單克隆抗體特異性結(jié)合，但只有NusA-Fiber2蛋白能與FAdV-4鼠源多克隆血清特異性結(jié)合。

A.標(biāo)簽蛋白NusA純化結(jié)果；B.重組蛋白NusA-Fiber2純化結(jié)果；M.PageRuler預(yù)染蛋白相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)A.Purification results of label protein NusA;B.Purification of recombinant NusA-Fiber2;M.PageRuler prestaining protein marker圖3 蛋白純化結(jié)果Fig.3 Protein purification results

A.His單克隆抗體；B.FAdV-4鼠源多克隆血清；M.PageRuler預(yù)染蛋白相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)A.His monoclonal antibody;B.Mouse polyclonal serum to FADV-4;M.PageRuler prestaining protein marker圖4 Western blot鑒定結(jié)果Fig.4 Identification of Western blot of NusA and NusA-Fiber2

2.4 間接ELISA方法的建立

NusA-Fiber2蛋白稀釋濃度為100 ng·μL-1，4 ℃ 過夜或37 ℃ 2 h；封閉條件：5%脫脂奶粉37 ℃封閉1 h；待檢血清稀釋度為1∶640，37 ℃孵育1.5 h；酶標(biāo)二抗山羊抗小鼠IgG的稀釋度為1∶5 000，37 ℃孵育1 h。陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)為待檢血清OD450 nm大于0.234，小于0.234為陰性。

2.5 間接ELISA、IPMA檢測免疫小鼠血清中fiber2抗體

將免疫3周后的小鼠經(jīng)尾靜脈取血后進(jìn)行間接ELISA方法、IPMA方法檢測其抗體分泌水平，如圖5A所示ELISA檢測結(jié)果，2只免疫后小鼠血清中Fiber2抗體分泌水平均較高，且血清稀釋1 280 倍后仍可以檢測到Fiber2抗體，但免疫小鼠血清不與標(biāo)簽蛋白NusA發(fā)生特異性反應(yīng)；IPMA檢測結(jié)果如圖5B所示，經(jīng)AEC顯色后，免疫后小鼠血清稀釋1280倍后，同樣可與FAdV-4發(fā)生特異性反應(yīng)，而對照小鼠血清不與FAdV-4發(fā)生特異性反應(yīng)。

A.間接ELISA檢測免疫3周后Fiber2抗體分泌水平；B.IPMA檢測免疫3周后Fiber2抗體分泌水平A.Indirect ELISA was used to detect Fiber2 antibody secretion 3 weeks after immunization;B.IPMA was used to detect Fiber2 antibody secretion 3 weeks after immunization圖5 間接ELISA、IPMA檢測免疫小鼠血清中fiber2抗體Fig.5 Fiber2 antibody in serum of immunized mice was detected by indirect ELISA and IPMA

2.6 雜交瘤細(xì)胞株的篩選

取加強(qiáng)免疫后小鼠的脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞融合，通過間接ELISA檢測獲得7株陽性雜交瘤細(xì)胞 (圖6)，4次亞克隆后，通過IPMA檢測，挑選出3株能穩(wěn)定分泌抗FAdV-4 Fiber2蛋白MAb的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為2G5、2G8、4C2 (圖7)。

圖6 間接ELISA法篩選陽性雜交瘤細(xì)胞株Fig.6 Indirect ELISA was used to screen positive hybridomas

挑選出3株陽性雜交瘤細(xì)胞株2G5、2G8、4C2 (38-3為本實(shí)驗(yàn)室制備的PRV N蛋白單克隆抗體，其與陰性對照一樣均不能與FAdV-4有特異性反應(yīng))Three positive hybridomas 2G5,2G8 and 4C2 were selected (38-3 was monoclonal antibody of PRV N protein purified in our laboratory,which,like the negative control,cannot react specifically with FAdV-4)圖7 雜交瘤細(xì)胞的IPMA篩選Fig 7 Screening of hybridomas by IPMA

2.7 抗FAdV-4 Fiber2單克隆抗體的獲得

對MAb 2G5腹水進(jìn)行純化，SDS-PAGE電泳分析表明，純化后的單克隆抗體可見1條大小為55 ku的重鏈，以及1條大小為25 ku輕鏈，而未見其他雜帶 (圖8)。

圖8 SDS-PAGE電泳分析純化的2G5Fig.8 SDA-PAGE analysis of the purified 2G5

2.8 單克隆抗體生物學(xué)特性分析

對所獲得的50個2G5、50個2G8以及50個4C2陽性雜交瘤細(xì)胞的染色體數(shù)目進(jìn)行計數(shù)，平均為104條，是兩種親本細(xì)胞的染色體數(shù)目之和，染色體核型主要為端著絲粒，少數(shù)為中著絲粒(圖9A)。

通過IPMA檢測雜交瘤細(xì)胞分泌抗體的穩(wěn)定性，結(jié)果顯示，3株單克隆細(xì)胞株均能穩(wěn)定的分泌抗Fiber2抗體 (圖9B)。利用試劑盒進(jìn)行亞型檢測發(fā)現(xiàn)，2G5、2G8、4C2均為典型IgG 1型抗體 (圖9C)。制備的MAb 2G5，用間接ELISA方法和IPMA方法進(jìn)行效價測定，其效價分別大于1∶220和1∶218。

A.雜交瘤細(xì)胞染色體數(shù)目檢測；B.雜交瘤細(xì)胞株分泌Fiber2抗體的穩(wěn)定性檢測；C.單克隆抗體亞型鑒定A.Check the number of chromosomes in the hybridoma cells;B.The stability of the secretion of Fiber2 antibody by hybrid tumor cell lines was determined;C.Identification of monoclonal antibody subtypes圖9 單克隆抗體生物學(xué)分析Fig.9 Biological analysis of monoclonal antibodies

2.9 抗FAdV-4 Fiber2單克隆抗體特異性分析

為進(jìn)一步驗(yàn)證獲得的MAb 2G5的特異性，對感染FAdV-4的雞肝細(xì)胞進(jìn)行IFA及Western blot分析。檢測結(jié)果顯示，MAb 2G5與感染FAdV-4的雞肝細(xì)胞呈現(xiàn)出特異性免疫反應(yīng)，熒光顯微鏡下可見綠色熒光，而Mouse IgG不與感染FAdV-4的雞肝細(xì)胞呈現(xiàn)出特異性免疫反應(yīng) (圖10A)，Western blot檢測結(jié)果顯示MAb 2G5能特異性檢測到FAdV-4(圖10B、C)。結(jié)果表明，獲得的MAb 2G5具有針對FAdV-4 Fiber2的良好特異性，并且是具有良好IFA和Western blot反應(yīng)原性的單克隆抗體，為研制針對FAdV-4的快速血清學(xué)診斷方法提供一定的試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

2.10 單克隆抗體的體外中和試驗(yàn)

由于Fiber2蛋白位于FAdV-4病毒表面，可能在介導(dǎo)病毒感染中發(fā)揮重要作用。在中和試驗(yàn)中，通過顯微鏡觀察病變孔，檢測到MAb 2G5最高可在1∶ 50稀釋條件下有效阻斷FAdV-4感染。而在小鼠IgG處理或不進(jìn)行任何抗體處理的FAdV-4感染細(xì)胞中可以看到明顯的病毒蝕斑。

2.11 雙抗體夾心法ELISA分析

捕獲抗體與檢測抗體進(jìn)行交叉配對試驗(yàn)，選擇OD450 nm平均值最高的一組作為夾心ELISA抗體組合。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，選取4C2作為捕獲抗體，最佳工作濃度為5 μg·mL-1，酶標(biāo)抗體2G5-HRP作為檢測抗體，最佳稀釋比為1∶1 000。通過計算，得出20份SPF雞的泄殖腔棉拭子樣品的平均值為0.13，標(biāo)準(zhǔn)差為0.014。因此，確定該方法的臨界值為0.172。利用已建立好的夾心ELISA方法檢測IBDV的NF8株以及B87株弱毒疫苗，NDV的LaSota株、Clone30株以及CS2株感染的細(xì)胞上清均無交叉反應(yīng)，可知該方法特異性良好 (圖10)。該方法對Fiber2蛋白的最低檢出濃度為0.039 μg，對FAdV-4的最低檢出量為104個TCID50。該方法的批間、批內(nèi)的變異系數(shù)(CV)均小于10%，證明本試驗(yàn)建立的雙抗體夾心ELISA檢測方法具有良好的重復(fù)性。

2.12 MAb 2G5的抗原表位鑒定

將FAdV-4 Fiber2蛋白以及各截短質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到LMH細(xì)胞中后，Western blot結(jié)果顯示MAb 2G5僅與N端的片段N1 (aa1—286)發(fā)生特異性結(jié)合，不與C端的片段C2 (aa233—480)發(fā)生特異性結(jié)合；再將N1片段從5′端采用二分之一截短法分成N3 (aa1—150)、N4 (aa124—286)、N5 (aa1—92)、N6 (aa75—150)、N7 (aa1—58)、N8 (aa41—92)、N9 (aa1—39)、N10 (aa22—58)、N11 (aa1—33)和N12 (aa16—39)，結(jié)果顯示，MAb 2G5能夠與N3、N5、N7、N9、N11片段發(fā)生特異性反應(yīng)，而均不與N4、N6、N8、N10、N12片段發(fā)生特異性反應(yīng) (圖10)，表明MAb 2G5識別的氨基酸序列范圍是N端aa1-aa33：1MLRAPKRRHSENGKPETEAGPSPAP IKRAKRMV33。

A.IFA檢測單克隆抗體特異性；B.感染FAdV-4 (MOI=0.01)的LMH細(xì)胞后Western blot鑒定MAb 2G5特異性；C.轉(zhuǎn)染pCAGGS-HA-Fiber2質(zhì)粒的LMH細(xì)胞后Western blot鑒定MAb 2G5特異性A.IFA identifies the specificity of monoclonal antibodies;B.The specificity of MAb 2G5 was determined by Western blot after infected with FAdV-4 at an MOI of 0.01;C.The specificity of MAb 2G5 was determined by Western blot after transfection of LMH cells with pCAGGS-HA-Fiber2 plasmid圖10 單克隆抗體的特異性檢測Fig.10 Test the specificity of monoclonal antibodies

圖11 交叉反應(yīng)性試驗(yàn)Fig.11 Cross reaction assay

3 討 論

自2015年6月起，HHS在全國范圍內(nèi)開始暴發(fā)。Niu等[14]對我國2015—2016年期間分離出的105株FAdV進(jìn)行序列分析發(fā)現(xiàn)，其中93%為FAdV-4，說明FAdV-4是引起我國HHS的主要病原。2015年，對河南地區(qū)12個規(guī)模化養(yǎng)殖場40份疑似HHS感染的組織進(jìn)行病原檢測，F(xiàn)AdV-4陽性率高達(dá)87.5%[20]。目前國內(nèi)對于FAdV-4的研究多集中于病毒的分離鑒定及生物學(xué)特性研究，對其蛋白的結(jié)構(gòu)與功能的研究多集中于Hexon[21]。Fiber2作為FAdV-4的結(jié)構(gòu)蛋白，其抗原表位具有主要的型特異性和亞屬特異性，能有效刺激中和抗體產(chǎn)生[22]。Zhang等[21]最近報道，F(xiàn)iber2是中國高致病性流行FAdV-4毒力的關(guān)鍵毒力因子。Schachner等[23]之前的一份報告表明，F(xiàn)iber2可以對FAdV-4的高致病性感染提供有效的保護(hù)。劉超等[16]為了研究Fiber2蛋白免疫保護(hù)性，原核表達(dá)了FAdV-4 Fiber2和鼠傷寒沙門菌 (Salmonellaty phimurium)鞭毛的融合蛋白，Western blot試驗(yàn)表明重組蛋白能與FAdV-4陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)，具有良好反應(yīng)原性。

國內(nèi)文獻(xiàn)報道的Fiber2表達(dá)蛋白多為包涵體[17]，在大腸桿菌中表達(dá)的蛋白由于缺少修飾和糖基化、磷酸化等翻譯后加工，常形成包涵體而影響表達(dá)蛋白的生物學(xué)活性及構(gòu)象，在進(jìn)行純化時需要經(jīng)過變性與復(fù)性后才能變成具有一定活性的蛋白，且純化操作繁瑣。獲得可溶性的Fiber2蛋白會增加蛋白的生物學(xué)活性，有利于FAdV-4的檢測和FAdV-4疫苗的研發(fā)[10,23-28]。本試驗(yàn)構(gòu)建了帶有不同促溶標(biāo)簽的原核表達(dá)載體，通過低溫誘導(dǎo)大大降低蛋白錯誤折疊的概率，提高了蛋白的可溶性表達(dá)效率，利用鎳柱進(jìn)行純化，得到大量且純度較高的具有生物學(xué)活性的Fiber2蛋白，制備了針對該單抗的MAb，并初步建立了具有較好特異性、敏感性和重復(fù)性的雙抗體夾心ELISA檢測方法，為FAdV-4的臨床診斷提供了檢測工具。

圖12 MAb 2G5對FAdV-4識別抗原表位的鑒定Fig.12 Identification of FAdV-4 antigenic epitopes by MAb 2G5

本試驗(yàn)中通過構(gòu)建截短的Fiber2真核表達(dá)載體，鑒定出MAb 2G5識別的表位位于FAdV-4的Fiber2蛋白N端aa1—33之間。通過中和試驗(yàn)，檢測到該抗體具有一定的中和活性。Wang等[11]制備的針對Fiber2蛋白的MAb 3C2識別的表位可能是構(gòu)象表位，進(jìn)一步研究中發(fā)現(xiàn)MAb 3C2識別的是具有較高中和活性的表位，位于FAdV-4的Fiber2蛋白aa416—448之間。在本研究中，制備的MAb 2G5能與Fiber2原核表達(dá)蛋白特異性反應(yīng)，說明該蛋白至少有一個能被該抗體試體識別的線性表位[29-31]。同時，利用IFA和Western blot方法均可檢測到MAb 2G5與FAdV-4特異性反應(yīng)，證明該抗體既針對Fiber2蛋白的線性表位又針對其構(gòu)象表位，可用于IFA和Western blot研究Fiber2在雞細(xì)胞中的分布定位、表達(dá)變化等，為進(jìn)一步研究Fiber2在禽疫病發(fā)病機(jī)制中的作用提供了一定基礎(chǔ)。本研究鑒定出該單抗的表位，也為針對FAdV-4的表位疫苗的研制提供了基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

本研究成功制備了可溶性的FAdV-4 Fiber2蛋白，且制備的MAb 2G5具有良好IFA和Western blot反應(yīng)原性，同時具有一定的中和活性。初步建立了雙抗體夾心ELISA檢測方法，該方法具有較好特異性、敏感性和重復(fù)性，可以用于FAdV-4的檢測。成功篩選出MAb 2G5在FAdV-4 Fiber2上的抗原表位識別區(qū)域：aa1—33，為進(jìn)一步研究Fiber2在禽疫病發(fā)病機(jī)制中的作用提供了一定基礎(chǔ)，也為針對FAdV-4的表位疫苗的研制提供了基礎(chǔ)。