袁棟波,陳 瑤,龍兆釔,鐘 源,謝 爽,黃俊瓊

(遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 輸血科,貴州 遵義 563000)

流感病毒是流行性感冒的病原體,每年引起300～500萬重癥病例,導(dǎo)致30～60萬人死亡[1]。血凝素(hemagglutinin,HA)是流感病毒表面一種重要的抗原,分布多種B細(xì)胞表位和T細(xì)胞表位。B細(xì)胞表位是病毒中和抗體的靶標(biāo)[2]。T細(xì)胞表位可刺激T細(xì)胞,促進(jìn)輔助性T細(xì)胞(Helper T cell,Th)分化。不同亞型流感病毒HA上存在數(shù)量不等的保守表位。由保守Th表位誘導(dǎo)產(chǎn)生的CD4+記憶T細(xì)胞受其他亞型流感病毒刺激后能迅速被激活,輔助B細(xì)胞或記憶B細(xì)胞產(chǎn)生抗體,在不同亞型流感病毒感染中提供保護(hù)[3]。H3N2流感病毒自1968年以來長期流行,每年冬春季節(jié)引起流行,以H3N2為主的流感季節(jié)有更多的住院病人和死亡人數(shù)[4-5]。本研究采用生物信息學(xué)預(yù)測和篩選H3N2病毒HA中保守Th表位,鑒定其免疫原性,探討保守Th表位對CD4+T細(xì)胞活化及分化的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 淋巴細(xì)胞分離液購自天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司;RPMI1640培養(yǎng)基為Gibco公司產(chǎn)品;抗人CD4-FITC、CD3- PE-Cy5抗體購自Biotech公司;Brefeldin A、抗人CD69-PE-Cy7、IFN-γ-PE-Cy7和IL-4-APC抗體購自BD公司;表位由上海楚肽生物科技有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 HLA-DRB1表位預(yù)測 從全球共享流感數(shù)據(jù)倡議組織(Global initiative on sharing all influenza data,GISAID)數(shù)據(jù)庫中下載以下流感病毒株的HA氨基酸序列:H7N9 A/Anhui/1/2013、2019～2020年度H3N2疫苗株A/Kansas/14/2017以及其他已發(fā)布的人源H7N9和H3N2病毒株,剔除相同序列和不完整序列。以HLA-DRB1為目標(biāo)基因型,使用在線分析工具NetMHCⅡpan-4.0預(yù)測A/Kansas/14/2017HA的Th表位,以IC50小于500 nmol/L為標(biāo)準(zhǔn)篩選陽性預(yù)測表位[6-7]。

1.2.2 保守Th表位的篩選 利用IEDB-AR的Epitope Conservancy Analysis在線工具將陽性預(yù)測表位與62 304個H3N2 HA氨基酸序列進(jìn)行比對,篩選保守的Th細(xì)胞表位,需滿足以下條件:每個保守表位中至少有90%的氨基酸序列在H3N2 HA中是保守的,即15個氨基酸至少有14個氨基酸序列是相同的。

1.2.3 同源建模 以蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中已有的H3N2 A/Victoria/361/2011 HA蛋白晶體結(jié)構(gòu)(PDB ID:4WE8)為模板,采用同源建模軟件SWISS-MODLE構(gòu)建A/Kansas/14/2017HA的3D結(jié)構(gòu)模型。2株H3N2病毒HA氨基酸序列同源性為97.2%。用PROCHECK、ERRAT和Verify-3D對建模質(zhì)量進(jìn)行評估,并使用SWISS-Pdb Viewer在3D模型中標(biāo)識保守Th表位。利用Epitope Conservancy Analysis分析工具將保守Th表位與1 387個H7N9HA氨基酸序列進(jìn)行比對,分析H3N2 HA中保守Th表位與H7N9 HA的同源性。

1.2.4 保守Th表位潛在免疫原性分析 下載并整理IEDB-AR中已發(fā)布的H3N2 HA Th表位,對數(shù)據(jù)集進(jìn)行保守表位序列同源性搜索。根據(jù)IEDB數(shù)據(jù)庫中已有的經(jīng)實驗證實的Th表位對篩選到的保守表位的潛在免疫原性進(jìn)行評估。人工合成篩選得到的高保守表位,表位純度均大于95%。

1.2.5 Th表位對T細(xì)胞活化的影響 納入近3個月內(nèi)未感染流感病毒或接種流感疫苗的健康志愿者。采集志愿者外周血10 mL,分離PBMC,調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個/mL,接種于24孔板。實驗組分為6個組,分別加入IL-2和6種不同的Th表位(E1～E6),對照組加入IL-2,每組設(shè)4個重復(fù)。IL-2和表位多肽的工作濃度分別為50 ng/mL、10 μg/mL。于37 ℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。收集細(xì)胞,加入熒光素標(biāo)記的抗人CD3、CD4、CD69、IFN-γ和IL-4抗體進(jìn)行染色,Beckman coulter公司流式細(xì)胞儀分析熒光強度。研究方案獲得遵義醫(yī)科大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn),志愿者已簽署書面知情同意書。

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)分析 使用Graphad Prism 8軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。采用秩和檢驗分析組間差異,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 H3N2 Th表位預(yù)測 以HLA-DRB1為目標(biāo)基因型,通過在線MHC Ⅱ類抗原表位分析軟件從A/Kansas/14/2017 病毒HA上共篩選出48個Th表位。48個Th表位在H3N2病毒間的保守性為28%～99%(表1)。

表1 H3N2 HA Th表位預(yù)測

2.2 保守Th表位的篩選 48個陽性預(yù)測表位中33個在H3N2中同源性大于90%,為保守表位。同源建模分析見紅色核心區(qū)域(A、B、L)占88.3%,亮黃色額外允許區(qū)(a、b、l、p)占10.5%,超過99.5%的氨基酸處于合理區(qū)域(圖1);HA模型的ERRAT得分為96.260 4,88.28%的氨基酸的Verify-3D得分大于0.2,表明A/Kansas/14/2017 HA模型是高質(zhì)量的。33個保守Th表位中27個位于HA頭部(圖2A)。進(jìn)一步根據(jù)表位在H3N2病毒中的同源性及IC50選擇6個高度保守、高親和力的Th表位(圖2B),此6個保守表位目前尚未見報道。6個高度保守表位與IEDB庫中的Th表位同源(表2),提示所有6個保守表位具有潛在免疫原性。

Psi、Phi:3D結(jié)構(gòu)中肽鍵內(nèi)α碳原子和羰基碳原子間鍵的旋轉(zhuǎn)度及α碳原子和氮原子間的鍵的旋轉(zhuǎn)度;■▲ :氨基酸殘基;紅色、亮黃色、淡黃色和白色區(qū)域分別代表氨基酸殘基分布的核心區(qū)、額外允許區(qū)、大致允許區(qū)、不允許區(qū)。圖1 A/Kansas/14/2017 HA模型的Ramachandran

A:保守表位;藍(lán)色為HA頭部,紅色為HA桿部,黃色為保守表位;B:6個高保守表位;每種顏色代表一個表位。圖2 保守Th表位在 HA的定位

表2 6個高保守Th表位的特征

2.3 保守Th表位與H7N9 HA的同源性 通過在線工具分析6個高保守表位與GISAID庫中的1 387個H7N9 HA氨基酸序列的同源性,發(fā)現(xiàn)位于HA頭部的4個表位(E1～ E4)與H7N9的同源僅為26.67%～40.00%,4個頭部表位與A/Anhui/1/2013 HA的同源性為26.67%～33.33%;位于桿部的2個表位(E5、E6)與A/Anhui/1/2013的同源性分別為80.00%、66.67%,表明H3N2保守Th表位與H7N9同源性較差。

2.4 保守Th表位對CD4+T細(xì)胞活化及分化的影響 PBMC經(jīng)6條保守Th表位(E1～E6)單獨刺激24 h后,流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示,各實驗組CD4+CD69+T細(xì)胞比例明顯高于IL-2對照組,表明來源于H3N2病毒HA的6條保守Th表位均能激活CD4+T細(xì)胞,具有免疫原性。與IL-2對照組比較,保守表位刺激后各實驗組CD4+IFN-γ+T細(xì)胞和CD4+IL-4+T細(xì)胞比例明顯增加,表明6條保守的H3Th表位均能誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞分化為Th1和Th2細(xì)胞,后者分泌IFN-γ或IL-4(圖3)。

*、**、***:與IL-2對照組比較,P< 0.05, P< 0.01 ,P< 0.001。 圖3 保守Th表位誘導(dǎo)CD4+ T細(xì)胞活化與分化

3 討論

CD4+T細(xì)胞抗原表位(Th表位)通常由13～17個氨基酸殘基組成。CD4+T細(xì)胞識別與主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex,MHC)Ⅱ類分子結(jié)合的表位。直接參與結(jié)合MHC-Ⅱ類分子的核心肽序列通常由9個氨基酸殘基組成。HLA-DRB1為已知的人類最常見的與流感病毒HA結(jié)合的MHC-Ⅱ類分子[8-9]。本實驗采用在人群中覆蓋率較高的11個HLA-DRB1基因型,通過表位預(yù)測軟件從2019-2020年度H3N2疫苗株A/Kansas/14/2017HA共篩選出48個陽性預(yù)測表位。利用保守表位在線分析軟件從48個陽性預(yù)測表位中篩選到33個保守表位,大多數(shù)保守Th表位位于HA頭部。

CD4+T細(xì)胞受抗原刺激后分化為效應(yīng)性Th細(xì)胞,分泌IL-4、IL-21等細(xì)胞因子,輔助B細(xì)胞產(chǎn)生抗體。Wilkinson等[10]研究發(fā)現(xiàn),H3N2病毒感染后第7天,人外周血中流感特異性T細(xì)胞數(shù)量大大增加,流感病毒反應(yīng)性CD4+T細(xì)胞與病毒減少、癥狀減輕有關(guān)。Nienen等[11]報道,流感疫苗接種后第7天,外周血CD4+記憶T細(xì)胞數(shù)量明顯增多,且記憶T細(xì)胞數(shù)量與疫苗誘導(dǎo)的抗體滴度的增加呈正相關(guān)。HA是流感病毒的主要抗原,不同亞型流感病毒之間HA的差異較大。Duvvuri等[12]報道,H7N9病毒HA的氨基酸序列與其他甲型流感病毒如H1N1、H2N2、H3N2等的相似性僅為39.2%～41.6%,遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于內(nèi)部蛋白PB1、PB2、PA、M1(相似性>90%),導(dǎo)致其抗原性出現(xiàn)較大差異。本研究發(fā)現(xiàn)H3N2病毒A/Kansas/14/2017 HA上33個保守Th表位中僅1個存在于A/Anhui/1/2013 H7N9病毒,與Duvvuri等[12]報道一致。這可能與H7N9免疫原性較弱有關(guān)。

反復(fù)流感病毒暴露或疫苗接種導(dǎo)致機(jī)體存在HA特異性記憶T細(xì)胞,選擇性激活HA特異性CD4+記憶T細(xì)胞可增強機(jī)體對弱免疫原性HA的抗體應(yīng)答[13]。因此,在接種H7N9或H3桿部疫苗時引入保守H3 Th表位激活CD4+記憶T細(xì)胞有助于抗體的產(chǎn)生。本研究根據(jù)Th表位親和力、保守性以及核心序列的位置,最后篩選出6個高保守Th表位,其中桿部表位E5(QTRGIFGAIAGFIEN)在H7-HA中同源性最好,推測可能是因為包含融合肽序列,融合肽序列在HA蛋白中高度保守。經(jīng)體外刺激實驗證實,6個保守Th表位單獨使用均可刺激健康人外周血CD4+T細(xì)胞活化及分化,細(xì)胞表面CD69分子表達(dá)增高,細(xì)胞因子IFN-γ和IL-4分泌增加。IL-4主要由Th2細(xì)胞分泌,可促進(jìn)B細(xì)胞活化、增殖及產(chǎn)生抗體[14-16]。

本研究通過生物信息學(xué)的方法從H3N2病毒HA篩選到33個保守Th表位,人工合成6 個無重疊的高保守表位,經(jīng)體外實驗證實6個保守表位均可刺激Th細(xì)胞活化及分化,表明本研究篩選得到的保守H3Th表位可作為抗原誘導(dǎo)體內(nèi)預(yù)先存在的CD4+記憶T細(xì)胞分化為Th細(xì)胞,為后續(xù)新型通用流感疫苗的研究提供思路與方向。