蘇 艷,孫 倩,張雅蘭,李曉琳

(保定市第二醫(yī)院 1.心血管內一科,2.特需診療科,河北 保定 071051)

ST段抬高型心肌梗死(STEMI)其臨床特征為有典型的缺血性胸痛,持續(xù)超過20 min,血清心肌壞死標記物濃度升高并有動態(tài)演變,心電圖具有典型的ST段抬高[1-2]。STEMI的先兆癥狀主要包括心絞痛發(fā)作較以往頻繁、程度較劇、持續(xù)較久、硝酸甘油療效差,其誘發(fā)因素及發(fā)病分子機制尚不明確[3-4]。有研究表明通過對STEMI患者冠狀動脈內炎癥的評估,證實多種炎癥因子的釋放與STEMI具有顯著的相關性[5],另有針對199名STEMI患者的臨床隊列研究,通過使用炎癥因子IL-6受體的抑制劑治療,證實IL-6受體抑制劑可以顯著的提高患者心肌挽救率[6]。PTX3是一種可溶性識別分子,在炎癥因子和外源刺激下由多種細胞如成纖維細胞、活化的內皮細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞以及其他組織細胞產生[7-8],與心衰及冠狀動脈粥樣硬化斑塊的易損性密切相關,在破裂的冠狀動脈斑塊中也檢測到PTX3的高表達,可見PTX3是參與心肌損傷過程的重要分子[9-10],但其在STEMI患者中的表達水平尚不明確,同時PTX3是否可以影響炎癥因子的分泌同時參與心肌細胞的凋亡,進而影響臨床心肌挽救率尚不明確。因此,本研究將通過STEMI患者探究外周血PTX3的表達水平,分析患者血清中炎癥因子的表達水平,同時通過人心肌細胞過表達PTX3,探究PTX3是否通過影響炎癥因子釋放干預心肌細胞凋亡,為PTX3在STEMI中的作用及其分子機制提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本來源 人心肌細胞細胞系HCM購于中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫(上海);2020年1月-2022 年1月在保定市第二醫(yī)院獲得的臨床資料完整的STEMI患者93例以及183例健康對照,年齡(56.45±8.40)歲。入選標準:①符合中華醫(yī)學會心血管分會制定的急性心肌梗死診斷和治療指南提出的STEMI的診斷標準;②發(fā)病時間小于12 h。排除標準:①心源性休克;②既往有出血性腦卒中或中重度肝病的患者;③大出血活動期患者;④6個月內有重大手術或外傷、腦血管疾病者;⑤凝血疾病和血小板減少癥者。本篩查研究中所有參與者均簽署知情同意書并通過保定市第二醫(yī)院倫理委員會審核。

1.1.2 試劑和設備 DMEM(Gibco,貨號:11995040),FBS(Gibco貨號: 16000-044),P/S(Gibco,貨號15140-022);細胞培養(yǎng)皿、離心管、EP管等試驗耗材購于美國Corning公司;PTX3質粒及NC質粒等購于廣州Ribobio公司;引物由生工生物工程(上海)股份有限公司設計并合成;330全自動生化分析儀購于上?？迫A卓越有限公司,FACSVia流式細胞儀購于美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1 血液生化指標檢測 所有患者及健康對照用抗凝管采集5 mL外周血,室溫靜置30 min,3 500 r/min 離心10 min,分離血清,檢測血清TC、TG、HDL-C、Non-HDL-C、Tnl admission、Tnl max、AOPP、TOS、PAB、SH、TAS、SOD 各指標。

1.2.2 細胞培養(yǎng)及質粒轉染 HCM細胞培養(yǎng)條件:5%,CO2;37 ℃,培養(yǎng)密度:1×106cells/培養(yǎng)皿;換液及傳代:每隔1 d更換培養(yǎng)液,2～3 d傳代,傳代比例為1∶3～4。轉染條件:按照Lipofectamine TM 3000說明書對細胞進行轉染NC質粒和PTX3質粒,轉染6～8 h后更換完全培養(yǎng)基,5 % CO2,37 ℃培養(yǎng)。

1.2.3 qPCR檢測PTX3、IL-1β、IL-6、TNF-α表達水平 通過qPCR檢測細胞中的PTX3、IL-1β、IL-6、TNF-α表達水平。將適量的細胞加入1 mL TRIZOL法提取總RNA,后反轉錄合成cDNA,進行PCR擴增。95 ℃預變性10 min,95 ℃變性15 s, 55 ℃退火15 s,共40個循環(huán)。引物序列見表1。每個樣品重復3次檢測,利用2-ΔΔCT相對定量法計算各個指標的相對表達量,用內參β-actin對其標準化處理。

表1 引物序列

1.2.4 細胞凋亡實驗 將各組細胞用不含EDTA的胰酶消化后, 800 r/min 4 ℃離心5 min收集細胞。用預冷的PBS洗滌細胞2次,800 r/min 4 ℃離心5 min。收集細胞加入100 μL 1×Binding Buffer重懸細胞。嚴格按照試劑盒要求加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI Staining Solution,輕輕混勻;反應條件為:避光、室溫10～15 min;加入400 μL 1×Binding Buffer,混勻后放置于冰上;樣品在1 h內用流式細胞儀檢測。

2 結果

2.1 兩組患者一般資料比較 如表2所示,與對照組相比,STEMI組患者的收縮壓和舒張壓、血糖、TG濃度高于對照組,而TC和HDL-C濃度低于對照組。氧化應激參數(shù)中STEMI組的PAB值較高,而STEMI患者的AOPP濃度低于對照組。STEMI患者的抗氧化酶SOD顯著升高,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。

表2 STEMI患者和對照組的一般資料比較

2.2 兩組患者PTX3 mRNA表達水平的比較 通過qPCR檢測兩組患者外周血PTX3 mRNA表達水平,圖1結果表明,與對照組相比,STEMI組患者PTX3 mRNA表達水平顯著增加,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

圖1 兩組患者PTX3表達水平比較

2.3 兩組患者血清炎癥因子表達水平的比較 兩組患者外周血血清炎癥因子表達水平,如表3所示。結果表明,與對照組患者相比,STEMI組患者外周血炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α表達水平均顯著升高,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

表3 兩組患者外周血炎癥因子水平比較

2.4 轉染PTX3對人心肌細胞炎癥因子表達的影響 通過qPCR檢測轉染PTX3對炎癥因子mRNA表達水平的影響,結果表明與對照組和NC組相比,試驗組細胞IL-1β、IL-6、TNF-α表達水平顯著升高,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01),NC組和對照組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05,表4)。

表4 轉染PTX3對人心肌細胞炎癥因子表達的影響

2.5 轉染PTX3對人心肌細胞凋亡表達的影響 通過流式細胞分析轉染PTX3對人心肌細胞炎癥因子表達的影響,如圖2所示,結果表明與對照組和NC組比較,試驗組細胞凋亡比例顯著升高,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01),NC組和對照組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

*:與對照組比較, P<0.01。圖2 轉染PTX3對人心肌細胞凋亡表達的影響

3 討論

ST段抬高型心肌梗死由于心臟的供應血管有急性血栓形成,導致相應的區(qū)域出現(xiàn)透壁性心肌梗死[11]。STEMI容易造成患者心律失常、室壁瘤,甚至心臟破裂,導致患者猝死,因此應盡早的給予溶栓或者應用PCI進行治療,救治及時大多數(shù)患者都能獲得較好的臨床預后,如果患者發(fā)病時間過長,錯過最佳救治時間不能逆轉心臟損傷,會造成患者后期活動耐量下降、呼吸困難、生活質量下降的不良癥狀[12-13]。

炎癥因子釋放對STEMI病理生理學中起著重要干預作用[14],研究表明STEMI患者的炎癥生物標志物IL-6、IL-1β和丙二醛(Malondialdehyde,MDA)水平顯著升高,IL-6、IL-1β和MDA之間以及STEMI患者TIMI評分與IL-1β之間存在正相關關系[15],也有研究證實系統(tǒng)免疫炎癥指數(shù)可以作為預測ST段抬高型心肌梗死患者引發(fā)的腎病的炎癥標志物[16],本研究通過臨床STEMI患者及健康者血清,發(fā)現(xiàn)STEMI患者炎癥因子IL-1β、IL-6及TNF-α顯著高表達,這與當前心肌梗死研究結果相一致,提示炎癥因子大量釋放可能是STEMI發(fā)病的結果之一;同時,本研究通過qPCR證實了PTX3在STEMI患者中顯著高表達。有研究表明,PTX3在炎癥、止血反應、組織修復和纖維化消退的調節(jié)中發(fā)揮重要功能,這種可溶性模式識別分子屬于體液固有免疫系統(tǒng)的重要分子,通常由吞噬細胞和基質細胞在炎癥部位迅速產生,在感染或組織器官損傷中發(fā)揮作用[17]。這提示在STEMI發(fā)生發(fā)展過程中,PTX3可能通過影響炎癥因子干預心肌損傷的修復及心肌細胞功能。有研究通過小鼠及細胞學實驗證實PTX3參與了多種類型細胞的增殖、分化、凋亡,并且這些過程伴隨著炎癥因子的調控,PTX3通過JNK信號通路促進小鼠胚胎干細胞心臟分化,PTX3增強了JNK的磷酸化,促進了Nkx2 Mef2c、Tbx5、dHand和αMHC的轉錄,發(fā)揮了小鼠胚胎干細胞向心肌細胞分化中的調節(jié)作用[18];PTX3調節(jié)脂多糖誘導炎癥期間棕色脂肪細胞中miR-21的表達和分泌[19],內皮功能障礙中神經肽Y升高促進巨噬細胞浸潤和平滑肌泡沫細胞形成是通過PTX3的調控發(fā)生的,并且這些過程伴隨著增加炎癥細胞的趨化性而放大血管炎癥,觸發(fā)平滑肌泡沫細胞的形成[20]。以上研究均證實了,在不同類型的細胞及不同的組織中,PTX3均會影響炎癥因子釋放,從而發(fā)揮特定的生物學功能。作者在臨床樣本中發(fā)現(xiàn)STEMI患者中PTX3表達增高,進一步通過細胞學實驗探究了PTX3和炎癥因子與心肌細胞凋亡的關系。本研究探究過表達PTX3對心肌細胞的影響,qPCR結果提示過表達PTX3后心肌細胞炎癥因子IL-1β、IL6和TNF-α顯著上升,這提示PTX3具有調控炎癥因子釋放的功能,與臨床結果發(fā)現(xiàn)的患者外周血炎癥因子及氧化應激分子的增加結果相一致;同時本研究通過流式細胞分析探究炎癥因子釋放是否會對心肌細胞凋亡產生影響,結果表明過表達PTX3會引發(fā)心肌細胞存活率降低,而早期凋亡和晚期凋亡水平均顯著增加,這與當前文獻報道的STEMI患者存在不可逆的心肌細胞損傷相一致。由此推測,PTX3可能通過促進炎癥因子釋放,引發(fā)心肌細胞凋亡,進而導致了心肌組織的不可逆損傷。

綜上,STEMI患者中PTX3表達水平顯著升高,炎癥因子分泌增加,表明PTX3可能通過促進炎癥因子的分泌誘導心肌細胞的凋亡,引發(fā)心肌損傷。本研究可以進一步通過分子生物學實驗探究PTX3對細胞凋亡相關分子CyclinD1和CDK1等信號通路的調控,完善PTX3對細胞凋亡影響的分子機制,為臨床研究提供理論基礎。