王國(guó)盼,楊 達(dá),陸安靜,秦 琳,張倩茹,王建梅,楊再文,何 莉,譚道鵬

(1.遵義醫(yī)科大學(xué) 貴州金釵石斛產(chǎn)業(yè)發(fā)展關(guān)鍵技術(shù)工程中心,貴州 遵義 563000;2.貴州匯騰科技有限公司,貴州 遵義 563000;3.貴州苗藥生物技術(shù)有限公司,貴州 銅仁 554400)

艾納香,又名大風(fēng)艾、大毛藥、大艾等,為菊科艾納香屬植物艾納香[Blumeabalsamifera(L.)DC.]的葉及嫩枝[1],是一種傳統(tǒng)苗藥,其性味辛、微苦、微溫,具有祛風(fēng)除濕、溫中止瀉、活血散瘀之功效,可用于風(fēng)濕痹痛、跌撲傷痛,可治療胃潰瘍[2]、促進(jìn)皮膚創(chuàng)傷及燒傷愈合等[3-4]。艾納香廣泛分布于貴州、廣東、海南、云南、廣西、福建等長(zhǎng)江以南省區(qū),特別是在貴州省的羅甸縣具有規(guī)?；姆N植[5]?；瘜W(xué)成分研究表明,艾納香含有揮發(fā)油、黃酮類、倍半萜類、苯丙素類等多種類型的化學(xué)成分[6]。其中,艾納香揮發(fā)油有特殊的清香氣,具有抗菌、消炎、止痛、抗氧化、驅(qū)蟲等多種活性[7-8],用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、濕疹、產(chǎn)后痛風(fēng)等[9],被認(rèn)為是艾納香的主要有效成分,是咽立爽口含滴丸[10]、金喉健噴霧劑[11]等多種貴州特色民族藥復(fù)方制劑的活性組分之一。此外,因具有顯著的抗菌、抗氧化活性,艾納香揮發(fā)油還被日益廣泛的應(yīng)用于日化品行業(yè)[12]。文獻(xiàn)報(bào)道艾納香揮發(fā)性成分主要包括L-龍腦、樟腦、2-茨醇、β-石竹烯、桉葉油醇、古蕓烯、芳樟醇、松油醇、丁子香酚、愈創(chuàng)木醇、庫貝醇、花椒油素等[13-15],其中L-龍腦為艾片的主要有效成分,具有顯著的消炎止痛、抗菌、抗氧化、抗病毒等多種生物活性[16],花椒油素具有抑制血小板凝聚的作用[17],L-龍腦、樟腦均具有較好的抗腦缺血再灌注損傷作用[18-19],β-石竹烯具有抑菌、抗炎、抗抑郁等作用[20]。此外,還發(fā)現(xiàn)艾納香揮發(fā)油中的其他成分如芳樟醇、葎草烯、α-古蕓烯、石竹烯氧化物、δ-杜松烯等都表現(xiàn)出較好的抑菌活性[21]。

揮發(fā)油的傳統(tǒng)提取方法主要采用水蒸氣蒸餾法,但該方法具有高耗能、有效成分得率較低等缺點(diǎn)。CO2超臨界提取是一種新型的提取技術(shù),具有有效防止熱敏性物質(zhì)破壞、提取效率高且能耗較少,操作簡(jiǎn)單、自動(dòng)化程度高、各項(xiàng)指標(biāo)易于準(zhǔn)確控制[22]等優(yōu)點(diǎn),日益廣泛地應(yīng)用于食用油或中藥揮發(fā)油的提取,如薄荷精油[23]、花椒精油[24]、艾葉揮發(fā)油[25]等。

近年來,關(guān)于艾納香揮發(fā)油的提取報(bào)道,有水蒸氣蒸餾法[26]、同時(shí)蒸餾萃取法[27]、頂空固相微萃取法[28]、微波輔助法[29]等。本研究采用CO2超臨界萃取技術(shù)提取艾納香葉中的揮發(fā)性成分,并采用GC-MS技術(shù)分析鑒定其化學(xué)成分,以期為艾納香的進(jìn)一步合理開發(fā)及綜合利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 多功能粉碎機(jī)(BO-100P2,永康市鉑歐五金制品有限公司),萬分之一天平(ME203E/02,上海梅特勒-托利多儀器有限公司),超臨界CO2萃取儀(RZSCF230-50-5+1L,南通睿智超臨界科技有限公司),GC-MS聯(lián)用儀(GCMS-TQ8040,日本島津公司)。

1.1.2 試劑 C7-C40系列正構(gòu)烷烴標(biāo)準(zhǔn)液(壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司)、正己烷[AR,薩恩化學(xué)技術(shù)(上海)有限公司]、丙酮[AR,重慶川東化工(集團(tuán))有限公司]、無水硫酸鈉(AR,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

1.1.3 藥材 艾納香葉(產(chǎn)地:貴州省羅甸縣,批號(hào):20181001)由貴州苗藥生物技術(shù)有限公司提供,經(jīng)遵義醫(yī)科大學(xué)譚道鵬副教授鑒定為菊科植物艾納香Blumeabalsamifera的干燥葉。

1.2 方法

1.2.1 艾納香葉CO2超臨界提取物的制備 取干燥的艾納香葉,粉碎,稱取455 g,裝入CO2超臨界萃取儀的萃取釜中,設(shè)置壓力30 MPa、溫度46～47 ℃,用超臨界CO2循環(huán)萃取80 min,然后從分離釜(I分壓力:7 MPa;Ⅰ分溫度:41～42 ℃;Ⅱ分壓力:6 MPa;Ⅱ分溫度:44～45 ℃)中分離出艾納香葉CO2超臨界提取物。

1.2.2 艾納香葉CO2超臨界提取物的GC-MS分析 取艾納香葉CO2超臨界提取物適量,加入10 mL正己烷充分溶解,用無水硫酸鈉除水,稀釋至適宜濃度后用0.22 μm微孔濾膜過濾并進(jìn)行GC-MS分析。氣相色譜條件:色譜柱為SH-Rxi-5Sil MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)彈性石英毛細(xì)管柱;程序升溫條件:柱溫70 ℃(保持2 min),以5 ℃/min升溫至150 ℃(保持2 min),以10 ℃/min升溫至260 ℃保持10 min至完成分析。進(jìn)樣口溫度250 ℃,載氣為高純氦氣,載氣流量1.0 mL/min,進(jìn)樣量0.5 μL,分流比10∶1;質(zhì)譜條件:離子源為EI源,離子源溫度200 ℃,接口溫度250 ℃,電子能量70 eV,溶劑延遲1.5 min,質(zhì)量范圍為45～500 amu。采用NIST標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫檢索并結(jié)合保留指數(shù)進(jìn)行定性分析,僅報(bào)道匹配度大于80%(最大值100%)的鑒定結(jié)果,采用峰面積歸一化法定量。

1.2.3 保留指數(shù)的測(cè)定 精密吸取C7-C40系列正構(gòu)烷烴標(biāo)準(zhǔn)液100 μL,加正己烷定容至1 mL,搖勻,0.22 μm微孔濾膜過濾后即得0.1 mg/mL C7-C40正構(gòu)烷烴混標(biāo)溶液。按照1.2.2中的色譜條件分析正構(gòu)烷烴混標(biāo),記錄保留時(shí)間。各組分的保留指數(shù)根據(jù)其保留時(shí)間與C7-C40正構(gòu)烷烴混標(biāo)的保留時(shí)間通過GC-MS-TQ8040聯(lián)用儀的數(shù)據(jù)分析軟件(GC-MS再解析)自動(dòng)計(jì)算求得。

2 結(jié)果

2.1 GC-MS聯(lián)用技術(shù)分析艾納香葉CO2超臨界提取物中的揮發(fā)性成分 采用CO2超臨界萃取技術(shù)提取得到的艾納香葉提取物為黃綠色油狀物,得率為9.01%。采用GC-MS聯(lián)用技術(shù)對(duì)艾納香葉CO2超臨界提取物中的揮發(fā)性成分進(jìn)行分析鑒定,共分離出119個(gè)組分。各組分的質(zhì)譜數(shù)據(jù)經(jīng)計(jì)算機(jī)檢索NIST標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫并結(jié)合保留指數(shù)定性分析,采用峰面積歸一化法測(cè)定各組分的相對(duì)含量,共鑒定78種化合物,占艾納香葉揮發(fā)性成分總量的87.02%(表1)。圖1為艾納香葉和C7-C40系列正構(gòu)烷烴標(biāo)準(zhǔn)液的GC-MS總離子流色譜。

表1 艾納香葉CO2超臨界提取物中化學(xué)成分組成

續(xù)表1

續(xù)表1

續(xù)表1

續(xù)表1

A:艾納香葉CO2超臨界提取物;B:C7-C40系列正構(gòu)烷烴標(biāo)準(zhǔn)液。圖1 GC-MS總離子流色譜

2.2 艾納香葉CO2超臨界提取物中的揮發(fā)性成分 如圖2所示,艾納香葉CO2超臨界提取物中的揮發(fā)性成分主要包括:5種萜類衍生物(31.90%)、44種脂肪族化合物(18.58%)、10種芳香族化合物(18.50%)、12種含氮化合物(14.54%)及其他類成分。脂肪族化合物包括:13種酯類化合物,相對(duì)含量最高為5.51%;其他依次為17種飽和烷烴類(5.22%)、6種酮酸類(4.21%)、5種醇類(2.56%)、2種烯烴類(0.25%)、1種醚類(0.83%)。各組分中相對(duì)含量最高的為單萜酯類化合物1,2-二甲基-1-甲酸乙酯-2-環(huán)戊烯(31.18%),其次為含氮化合物1-(4-十氫二苯并吡喃)-4-苯基-5-硫酮四唑(7.26%)、芳香族化合物鄰苯二甲酸單丁酯(6.53%)、芳香族化合物1-對(duì)硝基乙酰苯-3,4-二甲氧基苯(3.61%)、酮酸類化合物2,6,6,9,9,13-六甲基-7,8-二氮-2,7,12-三烯-4,11-二酮-7,8-二氧化物(3.32%),這些成分占艾納香葉揮發(fā)性成分總量的51.9%。

圖2 艾納香葉中揮發(fā)性成分的分類及相對(duì)含量

3 討論

植物中的揮發(fā)性成分比較復(fù)雜,常常由幾十種到數(shù)百種成分組成,大多為相對(duì)分子質(zhì)量小、極性小的化合物,主要包括萜類化合物、芳香族化合物、脂肪族化合物等。本研究艾納香葉CO2超臨界提取物中的揮發(fā)性成分主要為萜類衍生物,占31.90%。萜類化合物是一類廣泛存在于植物界的化學(xué)成分,具有多種生物活性,并且是一些中藥的主要有效成分[30-32]。本研究發(fā)現(xiàn)了5種艾納香中未曾報(bào)道過的萜類衍生物,其中包括含量最高的1,2-二甲基-1-甲酸乙酯-2-環(huán)戊烯,占31.18%,有文獻(xiàn)報(bào)道與其結(jié)構(gòu)相近的倍半萜內(nèi)酯具有抗流感病毒活性[33]。此外,還發(fā)現(xiàn)了種類豐富的飽和烷烴類化合物,包括正十九烷烴、正二十一烷烴、正二十八烷烴等活性成分,具有抗菌[34]、抗抑郁活性[35]。這些結(jié)果表明CO2超臨界萃取得到的艾納香葉提取物具有較高的開發(fā)前景。

本研究所得到的艾納香葉CO2超臨界提取物與文獻(xiàn)報(bào)道的艾納香揮發(fā)油成分有所不同:如王遠(yuǎn)輝等[27]采用GC-MS分析水蒸汽蒸餾法、同時(shí)蒸餾萃取法和頂空固相微萃取法3種方法提取的艾納香提取物中含量較高的化學(xué)成分包括龍腦、樟腦、桉葉醇、花椒素、(+)-γ-古蕓烯、(E)-羅勒烯、(E)-石竹烯等單萜及倍半萜類化合物,而本研究提取的艾納香葉CO2超臨界提取物并未發(fā)現(xiàn)這些成分,并且王遠(yuǎn)輝等提取的3個(gè)樣品中相對(duì)含量前5位的化學(xué)成分在種類與數(shù)量上也都存在差異。這說明提取工藝會(huì)造成艾納香提取物中化學(xué)成分的較大差異。與趙超等[15]的研究也有所不同,當(dāng)超臨界CO2萃取條件為萃取壓力30 MPa,萃取溫度50 ℃,萃取時(shí)間50 min時(shí)含量較高的化學(xué)成分有(+)-2-樟腦、L-龍腦、β-石竹烯、花椒油素、7-(2-羥基異丙基)-1,4α-二甲基十氫萘-1-醇、葉綠醇、二十四烷、三十三烷等,與本研究含量較高的1,2-二甲基-1-甲酸乙酯-2-環(huán)戊烯、1-(4-十氫二苯并吡喃)-4-苯基-5-硫酮四唑、鄰苯二甲酸單丁酯、1-對(duì)硝基乙酰苯-3,4-二甲氧基苯、2,6,6,9,9,13-六甲基-7,8-二氮-2,7,12-三烯-4,11-二酮-7,8-二氧化物等化學(xué)成分不同,說明萃取壓力、萃取溫度、萃取時(shí)間不僅對(duì)艾納香揮發(fā)油的萃取率產(chǎn)生影響,提取物的化學(xué)成分也有差異。不同產(chǎn)地具有不同的自然環(huán)境和氣候條件,可能影響中藥化學(xué)成分的組成。因此,以上不同艾納香提取物中化學(xué)成分的差異可能是由于樣品的采摘地點(diǎn)、采摘季節(jié)及樣品的提取工藝等因素所導(dǎo)致的。

此外,文獻(xiàn)報(bào)道1,2-二甲基-1-甲酸乙酯-2-環(huán)戊烯結(jié)構(gòu)類似物具有抗流感病毒活性,而1,2-二甲基-1-甲酸乙酯-2-環(huán)戊烯在艾納香葉CO2超臨界提取物中的相對(duì)含量高達(dá)31%,這也為艾納香藥材資源的開發(fā)利用提供了新的思路。