王衛(wèi)振，鄧占釗，辛國省，蔡正云，顧亞玲，張 娟*

(1.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，銀川 750021；2.彭陽縣畜牧技術(shù)推廣服務(wù)中心,固原 756599；3.寧夏大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 寧夏飼料工程技術(shù)研究中心，銀川 750021)

環(huán)狀RNA(circular RNA,circRNA)與線性RNA相比不具有3′端ploy(A)和5′端帽子，在真核生物組織或細(xì)胞中豐富、穩(wěn)定表達(dá)，對(duì)RNA外切酶(RNase R)具有抗性[1-2]。circRNA作為內(nèi)源性非編碼RNA (non-coding RNAs,ncRNAs)還具有高度保守性[3-4]。雖然circRNA早在1976年就被發(fā)現(xiàn)，由于circRNA不具有游離的3′和5′端，無法通過依賴于多聚 poly(A)的分子技術(shù)檢測(cè)到；同時(shí)，環(huán)化外顯子是經(jīng)反向剪接(back-splicing)形成共價(jià)環(huán)，異于經(jīng)典線性剪接，早期轉(zhuǎn)錄組分析的映射算法無法直接將測(cè)序得到的片段聯(lián)配到基因組上，使得在早期的研究中，circRNA被認(rèn)為是線性轉(zhuǎn)錄本異常剪接的副產(chǎn)物，隨著深入研究發(fā)現(xiàn)，circRNA的異常剪接是受到剪接機(jī)制嚴(yán)格調(diào)控的[3]。近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，circRNA在人類疾病尤其是癌癥方面發(fā)揮著重要的生物學(xué)功能，成為RNA領(lǐng)域研究的新熱點(diǎn)。伴隨著高通量測(cè)序技術(shù)的普及和應(yīng)用，越來越多的circRNA被鑒定出來。在未來，研究這些不同尋常分子的關(guān)鍵挑戰(zhàn)是如何發(fā)揮其功能。本文綜述了circRNA的研究簡(jiǎn)史、種類、可變剪接、生物學(xué)功能及在家禽中的研究進(jìn)展，以期為在家禽中深入研究circRNA提供理論基礎(chǔ)。

1 circRNA的研究簡(jiǎn)史

基于PubMed數(shù)據(jù)庫，本文梳理了1971年之后circRNA的研究進(jìn)程。1971年，Diener[5]在馬鈴薯塊莖病中發(fā)現(xiàn)一種類病毒，令人不解的是這種病毒的RNA呈環(huán)形結(jié)構(gòu)；1976年，基于電子顯微鏡分析，在植物類病毒和仙臺(tái)病毒中發(fā)現(xiàn)共價(jià)閉合circRNA分子[6-7]，至此，一種全新的、未知的RNA出現(xiàn)在研究者的視野。隨后，在人類抑癌基因DDC、ETS-1、小鼠Sry基因、大鼠細(xì)胞色素P450、2C24基因中都發(fā)現(xiàn)異常剪接轉(zhuǎn)錄本形成circRNA[8-11]。2012年，Salzman等[12]對(duì)人類多種類型細(xì)胞數(shù)百種基因進(jìn)行RNA-seq測(cè)序證實(shí)，circRNA是基因表達(dá)程序的普遍特征。對(duì)于circRNA的功能研究最早報(bào)道于1988年，在肝炎病毒中發(fā)現(xiàn)具有開放閱讀編碼框(ORF)的circRNA編碼抗原多肽P24Delta和P27Delta[13]；真核生物circRNA可在核糖體上翻譯啟動(dòng)，前提是circRNA具有內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRESs)，才能在ORF上合成多肽鏈[14]。Hansen等[15]首次證明，circRNA可以作為miRNA的海綿，競(jìng)爭(zhēng)性吸附miRNA，提高miRNA的靶標(biāo)水平。circRNA的發(fā)現(xiàn)和功能研究為ncRNAs研究注入新的活力，也使得ncRNA在轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)更加復(fù)雜化、多樣化。circRNA作為一種新興功能大分子，為生命科學(xué)領(lǐng)域的探索掀開嶄新的一頁。

2 circRNA的分類

根據(jù)基因注釋信息，circRNA大部分來源于編碼蛋白質(zhì)基因的外顯子，通常包含1～5個(gè)外顯子[16]，也有一些circRNAs來源于內(nèi)含子、非編碼區(qū)、反義鏈、3′非翻譯區(qū)(3′UTR)、5′非翻譯區(qū)(5′UTR)或基因間區(qū)[16-18]。依據(jù)序列來源將circRNA分為4種類型：僅由外顯子衍生的circRNA (exonic circular RNA,EciRNA)(圖1A～B)；僅由內(nèi)含子衍生的circRNA (intronic circular RNA,ciRNA)(圖1D)；外顯子-內(nèi)含子衍生的circRNA(exon-intron circular RNA,EIciRNA)(圖1C)[19]；基因間區(qū)circRNA (intergenic circular RNA)[19]。

A.單外顯子反向剪接形成EciRNA；B.脫去內(nèi)含子，外顯子反向剪接形成多外顯子EciRNA；C.外顯子之間保留內(nèi)含子形成EIciRNA；D.內(nèi)含子套索結(jié)構(gòu)逃避脫支和降解形成ciRNAA.Single exon back splicing to form EciRNA;B.Removal of introns，back splicing of exons to form multiple exon EciRNA;C.Introns are retained between exons to form EIciRNA;D.Intron lariat structure escapes debranching and degradation to form ciRNA圖1 不同亞型circRNA示意圖Fig.1 Schematic representation of different subtypes of circRNA

3 circRNA生物發(fā)生機(jī)制

基因轉(zhuǎn)錄后的pre-mRNA要經(jīng)過復(fù)雜的加工才能形成成熟的mRNA(圖2A)。單個(gè)基因位點(diǎn)經(jīng)過可變剪接(alternative splicing)產(chǎn)生多種類型的circRNA(圖2B～G)。目前，已報(bào)道的circRNA的生物發(fā)生機(jī)制有5種：1)內(nèi)含子配對(duì)驅(qū)動(dòng)環(huán)化 (直接反向剪接模型)[4]；2)套索驅(qū)動(dòng)環(huán)化(外顯子跳越模型)[4]；3)RNA結(jié)合蛋白(RBPs)驅(qū)動(dòng)環(huán)化[20]；4)重 剪接驅(qū)動(dòng)環(huán)化[21]；5)反式元件驅(qū)動(dòng)環(huán)化[22]。此外，circRNA的發(fā)生還受到聚合酶Ⅱ(Pol-Ⅱ)[23]、聚合酶Ⅲ(Pol-Ⅲ)[24]、RNA編輯酶腺苷脫氫酶(ADAR)[1,25]、內(nèi)含子中G-U擺動(dòng)堿基對(duì)[26]、poly(A)的延伸[26]等影響。

3.1 內(nèi)含子配對(duì)驅(qū)動(dòng)環(huán)化和套索驅(qū)動(dòng)環(huán)化

在內(nèi)含子配對(duì)驅(qū)動(dòng)環(huán)化中(圖2C)，兩側(cè)翼內(nèi)含子中反向互補(bǔ)串聯(lián)重復(fù)序列，如ALU元件、RCMs元件、ICSs元件等，能有效促進(jìn)內(nèi)含子互補(bǔ)配對(duì)環(huán)化[26]。在套索驅(qū)動(dòng)環(huán)化中(圖2B)，pre-mRNA遵循經(jīng)典GU-AG法則剪接，規(guī)范剪接的pre-mRNA發(fā)生折疊，使非相鄰的外顯子相互靠近發(fā)生外顯子跳躍，經(jīng)反向剪接形成包含外顯子和內(nèi)含子的套索前體，該前體通過內(nèi)部剪接去除內(nèi)含子，形成EciRNA[4]。在這兩種機(jī)制中，當(dāng)內(nèi)含子未被完全剪接，而保留在新生成的circRNA中時(shí)，就形成了EIciRNA[27]。

3.2 RNA結(jié)合蛋白驅(qū)動(dòng)環(huán)化

RNA結(jié)合蛋白(RBPs)作為circRNA生物發(fā)生機(jī)制的激活劑或抑制劑在調(diào)控circRNA發(fā)生中的重要作用已經(jīng)被證實(shí)。震動(dòng)蛋白(quaking,QKI)和盲肌蛋白(muscleblind,MBL/MBNL1)能與pre-mRNA側(cè)翼內(nèi)含子中特定基序列結(jié)合，將側(cè)翼內(nèi)含子連接在一起，這個(gè)過程類似于內(nèi)含子配對(duì)驅(qū)動(dòng)環(huán)化，不同的是，RBPs與特定位點(diǎn)結(jié)合后形成二聚體促進(jìn)pre-mRNA環(huán)化[28-29](圖2D)。此外，免疫因子NF90/NF110[30]、異質(zhì)核糖核蛋白L(HRNPL)[31]、FUS蛋白[32]、RNA結(jié)合基序蛋白20 (RBM20)[33]、脯氨酸-谷氨酰胺剪接因子(SFPQ)[34]等RBPs都能通過與特定位點(diǎn)結(jié)合促進(jìn)環(huán)化。與之相反的是，作用于雙鏈RNA的ADAR1能將腺苷編輯為肌苷(A-I)，主要進(jìn)攻對(duì)象為ALU元件，導(dǎo)致雙鏈RNA發(fā)生U-I錯(cuò)配，削弱雙鏈RNA的結(jié)合能力進(jìn)而抑制circRNA的產(chǎn)生[1,25](圖2E)。

3.3 重剪接驅(qū)動(dòng)環(huán)化

在腫瘤基因中報(bào)道了一種異常剪接方式，對(duì)成熟的mRNAs進(jìn)行重剪接產(chǎn)生circRNA[21]。值得注意的是，這種重新剪接能夠使較遠(yuǎn)的弱替代剪接位點(diǎn)替代真實(shí)的強(qiáng)剪接位點(diǎn)，形成大型套索外顯子環(huán)(圖2F)，從而導(dǎo)致mRNA片段的缺失[21]。乳腺癌細(xì)胞人類腫瘤易感基因TSG101的mRNA第2外顯子至第9外顯子重剪接組成內(nèi)源性的circRNA[21]。

3.4 反式元件驅(qū)動(dòng)環(huán)化

ciRNA的生物發(fā)生機(jī)制不同于EciRNA和EIciRNA，它由反式元件(trans-acting splicing elements)驅(qū)動(dòng)環(huán)化而來。在內(nèi)含子中的特殊序列5′SS附近的7nt-GU富集元件和3′SS附近的11nt-C富集元件，在反向剪接中，兩種元件結(jié)合形成包含內(nèi)含子的套索結(jié)構(gòu)，通過2′,5′-磷酸二酯鍵共價(jià)連接成環(huán)，接著下游3′端的殘余序列在脫支酶和核酸外切酶作用下降解[17,19,35]。一般而言，內(nèi)含子套索會(huì)在脫支酶的作用下開環(huán)，隨后被降解，但含有7nt-GU富集元件和11nt-C富集元件的內(nèi)含子能阻止脫分支酶的結(jié)合[17](圖2G)。

3.5 其他因子調(diào)控的環(huán)化

circRNAs來源于Pol-Ⅱ轉(zhuǎn)錄本，抑制Pol-Ⅱ活性，發(fā)現(xiàn)直接從內(nèi)源性的pre-mRNA到circRNA環(huán)化效率極低，深入研究發(fā)現(xiàn)，反向剪接與Pol-Ⅱ的延伸率呈正相關(guān)，并受順式元件(cis-acting splicing regulatory elements)的調(diào)控[23]。此外，有報(bào)道顯示，切割或聚腺苷酸化抑制Pol-Ⅱ終止轉(zhuǎn)錄，circRNA的表達(dá)水平升高，原因在于轉(zhuǎn)錄本通讀延伸至下游基因，并進(jìn)行反向剪接[36]。Pol-Ⅲ作為轉(zhuǎn)錄中常見的聚合酶，也能啟動(dòng)高效環(huán)化[24,37]。在內(nèi)含子反向重復(fù)序列中出現(xiàn)的G-U擺動(dòng)堿基對(duì)及poly(A)的延伸都會(huì)限制circRNA的形成[26]。在古細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)內(nèi)含子的環(huán)化至少涉及兩種酶，特定的核酸內(nèi)切酶和連接酶，核酸內(nèi)切酶特異性識(shí)別切割凸起-螺旋-凸起(B-H-B)結(jié)構(gòu)；連接酶連接外顯子，并將剪切暴露出2′,3′-環(huán)磷酸和5′-羥基末端連接轉(zhuǎn)化為結(jié)合型環(huán)磷酸鹽，形成7nt的發(fā)夾環(huán)[38]。也有報(bào)道證實(shí)，pre-tRNA能剪接成tRNA內(nèi)含子circRNA (trciRNA)，這需要保守的tRNA序列基序和連接-內(nèi)切酶復(fù)合體參與[39]。

4 circRNA的功能

cirRNA在調(diào)控基因表達(dá)中發(fā)揮重要作用。有證據(jù)表明，circRNA不僅自身與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合參與基因表達(dá)調(diào)控，還可以靶向吸附miRNA或與RBPs結(jié)合作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子影響基因表達(dá)[15,17,19-20]。circRNA可以作用轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控親本基因轉(zhuǎn)錄(圖3A)，small RNA干擾或RNase H反義寡核苷酸(ASOs)34靶向敲除EIciRNA導(dǎo)致親本基因中mRNA 表達(dá)水平下降[19]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，EIciRNA通過與Pol-Ⅱ和U1SNP在親本基因啟動(dòng)區(qū)域結(jié)合啟功親本基因順式表達(dá)[19]。miRNA是長(zhǎng)度僅有22 nt左右的ncRNA，在基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中發(fā)揮重要作用，miRNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控與mRNA的UTRs結(jié)合阻礙翻譯的進(jìn)行或降解mRNA[40-41]。circRNA富含miRNA的競(jìng)爭(zhēng)性靶點(diǎn)，發(fā)揮類似海綿作用吸附miRNA (圖3B)，從而阻斷miRNA與mRNA的結(jié)合，調(diào)節(jié)miRNA對(duì)基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控[2,15,35]。在人腦和小鼠腦中小腦變性相關(guān)蛋白1反義(CDR1as)環(huán)狀轉(zhuǎn)錄本ciRS-7富含70多個(gè)保守miRNA靶點(diǎn)，作為miR-7的海綿以miR-7依賴性的AGO2蛋白締合，完全抵抗miRNA介導(dǎo)的靶點(diǎn)失穩(wěn)，強(qiáng)烈抑制miR-7活性，提升miR-7靶基因水平[15,35]。已經(jīng)證實(shí)circRNA能與RBPs結(jié)合，形成circRNA-RBPs復(fù)合體發(fā)揮生物學(xué)功能(圖3C)。

A.pre-mRNA通過經(jīng)典剪接生成mRNA；B.套索驅(qū)動(dòng)環(huán)化，pre-mRNA折疊成套索前體，套索前體反向剪接生成circRNA；C.內(nèi)含子配對(duì)驅(qū)動(dòng)環(huán)化，兩側(cè)翼內(nèi)含子在反向互補(bǔ)串聯(lián)重復(fù)序列ALU元件作用下堿基互補(bǔ)配對(duì)，經(jīng)反向剪接生成circRNA；D.RBPs驅(qū)動(dòng)環(huán)化，RBPs與側(cè)翼內(nèi)含子特定基序結(jié)合促使兩側(cè)翼內(nèi)含子形成二聚體環(huán)化，經(jīng)反向剪接生成circRNA；E.ADAR1破壞反向互補(bǔ)配對(duì)堿基，發(fā)生U-I錯(cuò)配，削弱雙鏈結(jié)合能力抑制環(huán)化；F.重剪接驅(qū)動(dòng)環(huán)化，成熟mRNA經(jīng)反向剪接形成套索外顯子環(huán)，導(dǎo)致mRNA片段缺失；G.反式元件驅(qū)動(dòng)環(huán)化，含有內(nèi)含子反式元件形成的套索結(jié)構(gòu)逃避脫支和降解，形成ciRNAA.pre-mRNA generated mRNA by classical splicing;B.Lariat driven circularization,pre-mRNA folds into lariat precursors,and back splicing of lariat precursors to generated circRNA;C.Intron pairing driven circularization,the base complementary pairing of two flanking intronic in the action of reverse complementary tandem repeat sequence ALU element,and circRNA is generated by back splicing;D.RBPs driven circularization,binding of RBPs to flanking intronic specific sequence motifs induces dimerize cyclization of flanking intronic,and circRNA is generated by back splicing;E.ADAR1 destabilizes reverse complementary pairing bases,generates U-I mismatches,and weakens duplex binding ability to inhibit cyclization;F.Resplicing drives circularization,mature mRNA is back splicing to form a larita exon loop,causes deletion of mRNA fragments;G.Trans acting splicing elements driven cyclization,the larita structure formed by the intron trans acting splicing element escapes debranching and degradation to form ciRNA圖2 circRNA驅(qū)動(dòng)環(huán)化示意圖Fig.2 Schematic representation of circRNA driven circularization

ciRS-7結(jié)合miR-671激發(fā)ciRS-7的解環(huán)和AGO2介導(dǎo)的mRNA沉默，從而使吸附的miR-7脫靶得以釋放[15,35,42]。circ-Foxo3與 CDK2和p21蛋白結(jié)合形成三元復(fù)合體阻斷CDK2的功能抑制細(xì)胞周期進(jìn)程[43]。

circRNA作為ncRNA并非不能編碼蛋白質(zhì)，目前已知circRNA依賴于以下兩種機(jī)制翻譯。1)N6-甲基腺苷甲基化修飾(m6A)[44-45](圖3D)；2)IRSEs或原核生物核糖體結(jié)合位點(diǎn)[46-48](圖3E)。m6A是RNA堿基修飾中最豐富的存在，有報(bào)道證實(shí)，人細(xì)胞內(nèi)源性circRNA經(jīng)m6A修飾促進(jìn)內(nèi)源性circRNA翻譯[44]。共識(shí)的m6A基序富集于大量circRNA上，使circRNA不依賴于帽子進(jìn)行翻譯，這種受m6A驅(qū)動(dòng)的翻譯在circRNA中普遍存在，并依賴起始因子eIF4G2和m6A閱讀器YTHDF3，被甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3/14增強(qiáng)，被去甲基酶FTO抑制[44]。一項(xiàng)在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的研究發(fā)現(xiàn)，circ-SHPRH編碼的SHPRH-146aa通過保護(hù)全長(zhǎng)的SHPRH蛋白免受泛素蛋白酶的降解，從而抑制癌細(xì)胞的增殖和致瘤性[46]。對(duì)果蠅內(nèi)源性circMBL1的研究發(fā)現(xiàn)，核糖體-circMBL1 UTR具有允許不依賴于帽子結(jié)構(gòu)在體內(nèi)翻譯的能力[47]。重要的是，circMbl和一些Mbl mRNA 亞型在突觸中翻譯，circMbl的翻譯在果蠅大腦中可能發(fā)揮重要作用，但Mbl和circMbl分子編碼的蛋白質(zhì)不包含可識(shí)別的肽信號(hào)序列[47]。在小鼠和人體細(xì)胞中鑒定的circZNF609包含一個(gè)從起始密碼子開始的ORF，circZNF609與重鏈多核糖體結(jié)合，并以剪接依賴性和帽依賴性的方式通過ORF編碼蛋白質(zhì)[48]。但對(duì)circ-ZNF609衍生蛋白的分子活性及它是否有助于調(diào)節(jié)或控制ZNF609衍生蛋白的活性還沒有進(jìn)展，circ-ZNF609編碼的蛋白質(zhì)缺乏鋅指結(jié)構(gòu)域提示它可以作為顯性-陰性競(jìng)爭(zhēng)者或作為替代ZNF609復(fù)合物形成的調(diào)節(jié)劑[48]。

circRNA通過與線性RNA競(jìng)爭(zhēng)調(diào)控親本基因的選擇性剪接 (圖3F)，果蠅MBL/MBNL1蛋白第二外顯子側(cè)翼內(nèi)含子富含MBL蛋白亞型結(jié)合位點(diǎn)，過表達(dá)MBL-A，內(nèi)源性circ-MBL增加13倍而mRNA表達(dá)水平降低2倍[20]。顯然，MBL蛋白促進(jìn)了circ-MBL生成，使反向剪接更具競(jìng)爭(zhēng)力。擬南芥SEP3基因第6外顯子生成的circRNA強(qiáng)烈結(jié)合親本基因DNA基因座，形成RNA-DNA雜合體R-loop結(jié)構(gòu)，R-loop結(jié)構(gòu)抑制雜合體區(qū)段轉(zhuǎn)錄，發(fā)生跨外顯子選擇性剪切，促進(jìn)轉(zhuǎn)錄本突變體SPE3.3的產(chǎn)生[49]。

一些circRNAs被發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)表觀遺傳基因表達(dá)相關(guān)的異常甲基化和組蛋白修飾 (圖3G)。晚期乳腺癌中ETS轉(zhuǎn)錄因子家族成員FLI1啟動(dòng)子染色質(zhì)復(fù)合物外顯子產(chǎn)生一個(gè)circRNA，稱作FECR1[50]。circFECR1利用正反饋機(jī)制在啟動(dòng)子的CpG島誘導(dǎo)DNA低甲基化激活FLI1，circFECR1募集雙加氧酶-1(TET1)到FLI1，誘導(dǎo)DNA脫甲基，circFECR1還通過與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶-1(DNMT1)結(jié)合并下調(diào)DNMT1，DNMT1是維持DNA甲基化關(guān)鍵酶[50]。hsa_circ_0012919是自身免疫病系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)的一種潛在生物標(biāo)識(shí)物，hsa_circ_0012919下調(diào)降低腫瘤壞死因子超家族(TNFSF)CD70和CD11a的表達(dá)，上調(diào)DNMT1的表達(dá)，逆轉(zhuǎn)CD4+T細(xì)胞中CD70和CD11a的DNA甲基化不足[51]。

circRNA除了上述生物學(xué)功能外，在臨床醫(yī)學(xué)上還具有新興作用——生物標(biāo)記物，尤其在癌癥的發(fā)生和發(fā)展方面。circRNA的穩(wěn)定性、保守性、普遍性和特異性使其成為潛在的有、價(jià)值的腫瘤預(yù)后和診斷生物標(biāo)志物，其在腫瘤細(xì)胞中的功能和調(diào)節(jié)作用使其成為腫瘤治療的靶點(diǎn)。circFoxo3在乳腺腫瘤組織中普遍下調(diào)，并可能抑制腫瘤生長(zhǎng)和癌細(xì)胞活性[52]。circ-FBXW7在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中表達(dá)下調(diào)，并與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的總體生存率相關(guān)，并且circ-FBXW7編碼的FBXW7-185aa可以通過降低C-myc的半衰期，抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞周期阻滯和增殖[53]。

A.circRNA調(diào)控親本基因轉(zhuǎn)錄；B.circRNA充當(dāng)miRNA的海綿；C.circRNA與RBP結(jié)合；D-E.circRNA編碼蛋白質(zhì)；F.調(diào)控親本基因的選擇性剪接；G.表觀遺傳修飾，調(diào)控DNA甲基化A.circRNA regulates parental gene transcription;B.circRNA acts as miRNA sponge;C.circRNA binds to RBP;D-E.circRNA encoded proteins;F.Regulate the selective splicing of parental genes;G.Epigenetic modification,regulating the DNA methylation圖3 circRNA功能示意圖Fig.3 Schematic representation of circRNA function

5 circRNA在家禽方面的的研究進(jìn)展

在各種肉制品中，由家禽衍生出的產(chǎn)品是人類在日常生活中的重要食品來源之一。目前，禽肉已經(jīng)取代牛肉成為世界上第二大消費(fèi)肉類，消費(fèi)水平僅次于豬肉。家禽的經(jīng)濟(jì)性狀、氧化應(yīng)激與疾病免疫是家禽養(yǎng)殖行業(yè)盈利和規(guī)避風(fēng)險(xiǎn)的著力點(diǎn)。最近的研究提示，在家禽的經(jīng)濟(jì)性狀、氧化應(yīng)激與疾病免疫等領(lǐng)域都不難發(fā)現(xiàn)circRNA的蹤跡。

5.1 circRNA調(diào)控家禽的肌細(xì)胞增殖與分化

肌細(xì)胞的增殖與分化是家禽生長(zhǎng)發(fā)育的基礎(chǔ)，但肌細(xì)胞的增殖與分化受一系列復(fù)雜因素的影響，如基因、細(xì)胞因子、ncRNAs的調(diào)控[54]。circRNA作為ncRNAs在家禽肌細(xì)胞發(fā)生中的作用日益凸現(xiàn)。Ouyang等[55]對(duì)不同胚齡雞胚骨骼肌發(fā)育過程中circRNA的表達(dá)進(jìn)行RNA-seq測(cè)序，鑒定出462個(gè) 差異表達(dá)circRNAs，一些差異circRNAs來源基因與肌肉生物學(xué)進(jìn)程有關(guān)，并證實(shí)circRBFOX2S與miR-206相互作用促進(jìn)細(xì)胞增殖。Chen等[56]在對(duì)成纖維細(xì)胞因子受體2(FGFR2)的研究中發(fā)現(xiàn)，該基因3～6號(hào)外顯子產(chǎn)生的circFGFR2在雞胚骨骼肌發(fā)育中差異表達(dá)；進(jìn)一步探究該circRNA在雞胚發(fā)育中的作用機(jī)制發(fā)現(xiàn)，circFGFR2過表達(dá)促進(jìn)成肌細(xì)胞和QM-7細(xì)胞增殖，加速生肌決定因子1(MYOD1)、肌細(xì)胞生成素(MYOG)的表達(dá)和肌管的形成，而敲除circFGFR2對(duì)成肌細(xì)胞則有相反作用；并且circFGFR2能夠直接靶向miR-133a-5p和miR-29b-1-5p兩個(gè)miRNAs，抑制其表達(dá)和活性，解除對(duì)成肌細(xì)胞增殖和分化的抑制作用。為確定circRNA在雞胚胎骨骼肌發(fā)育中的機(jī)制，Shen等[57]對(duì)4個(gè)不同胎齡肉雞和蛋雞的胸肌進(jìn)行RNA-seq測(cè)序，由TMTC1基因轉(zhuǎn)錄而來的circTMTC1在不同胚齡表達(dá)水平蛋雞顯著高于肉雞，對(duì)circTMTC1敲除后加速雞骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖分化；miR-128-3p能夠靶向MSTN基因，抑制其表達(dá)，促進(jìn)雞骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化，而circTMTC1則通過吸附miR-128-3p抑制雞胚胎干細(xì)胞分化。這些研究說明，circRNA廣泛參與肌細(xì)胞發(fā)生過程中的調(diào)控。

5.2 circRNA調(diào)控家禽的卵泡發(fā)育

卵泡發(fā)育是決定家禽生殖性能的關(guān)鍵因素，但卵泡發(fā)育受到顆粒細(xì)胞、卵泡膜細(xì)胞和卵母細(xì)胞的共同作用，在轉(zhuǎn)錄水平也涉及到circRNA的調(diào)控。Shen等[58]在4個(gè)發(fā)育層次卵泡的卵泡膜細(xì)胞上鑒定到14 502個(gè)circRNAs，有5 622個(gè)circRNAs分布在多個(gè)層次卵泡膜細(xì)胞中；在與生殖相關(guān)的通路中都富集到差異表達(dá)circRNAs和mRNA，包括TGF-β信號(hào)通路、卵母細(xì)胞減數(shù)分裂和血管平滑肌收縮；與此同時(shí)，Shen等[59]在對(duì)4個(gè)不同發(fā)育層次雞顆粒細(xì)胞RNA測(cè)序后發(fā)現(xiàn)，差異表達(dá)的circRNAs呈現(xiàn)組織特異性和階段特異性的動(dòng)態(tài)變化。對(duì)DEcircRalGPS2的生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，來源于RalGPS2基因的3個(gè) 差異circRNAs可能共享相同的miRNA作為海綿。Wu等[60]對(duì)鴨白卵泡和黃卵泡卵測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，共預(yù)測(cè)到4 204個(gè)circRNAs，14個(gè)circRNAs在兩種卵泡中差異表達(dá)；Wu等[60]研究表明，aplacirc_(013267)可促進(jìn)鴨顆粒細(xì)胞凋亡，aplacirc_(013267)能直接結(jié)合并抑制apla-mir-1-13，上調(diào)血小板凝血酶蛋白1表達(dá)促進(jìn)顆粒細(xì)胞凋亡。綜上所述，circRNA在家禽卵泡發(fā)育中具有潛在的作用，并且circRNA可作為了解卵泡發(fā)育的新途徑。

5.3 circRNA調(diào)控家禽的疾病與免疫

研究證實(shí)，circRNA能與免疫應(yīng)答基因相互作用，介導(dǎo)疾病的發(fā)生、發(fā)展過程，并可作為生物標(biāo)記物參與疾病診斷[61-63]。病毒引起的傳染性疾病會(huì)在家禽養(yǎng)殖業(yè)中造成毀滅性的經(jīng)濟(jì)損失，其中以馬立克病毒(marek disease virus,MDV)、禽白血病病毒亞群(avian leukosis virus subgroup,ALV-J)為最。為揭示ncRNAs在疾病中的調(diào)控作用，對(duì)雞MDV感染腫瘤脾、MDV感染無損傷存活脾、健康脾進(jìn)行RNA-seq測(cè)序顯示，鑒定出的2 169個(gè)circRNAs有113個(gè)差異表達(dá)，對(duì)circRNA/LncRNA-miRNA-mRNA的互作網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源競(jìng)爭(zhēng)RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)參與腫瘤調(diào)控[62]。在circRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，circZMYM3與7個(gè)靶向免疫基因的miRNAs互作，表明ncRNAs介導(dǎo)免疫應(yīng)答基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[64]。在感染ALV-J的雞中發(fā)現(xiàn)，circRNA與ALV-J誘導(dǎo)的腫瘤形成有關(guān)，并可能有助于介導(dǎo)雞腫瘤的誘導(dǎo)和發(fā)展[61,63]。對(duì)ALV-J抗性雞和ALV-J易感雞肝組織進(jìn)行測(cè)序，并對(duì)在抗性雞中12個(gè)上調(diào)的circRNAs的前5個(gè)miRNAs靶基因進(jìn)行GO和KEGG分析，發(fā)現(xiàn)靶基因主要參與免疫途徑[61]。同樣，Qiu等[63]對(duì)ALV-J的研究發(fā)現(xiàn)，比較差異表達(dá)的circRNAs的來源基因和mRNA，并進(jìn)行內(nèi)源競(jìng)爭(zhēng)RNA網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)，幾個(gè)與腫瘤和免疫相關(guān)的基因同時(shí)存在于差異mRNA和circRNAs的來源基因中，并參與內(nèi)源競(jìng)爭(zhēng)RNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

5.4 circRNA調(diào)控家禽的氧化應(yīng)激

在現(xiàn)代家禽集約化養(yǎng)殖模式下，氨氣(NH3)作為一種具有強(qiáng)烈刺激性的有害氣體是禽舍內(nèi)主要空氣污染物，嚴(yán)重影響家禽和工人的健康狀況[64]。有研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)時(shí)間暴露于高濃度NH3環(huán)境中會(huì)導(dǎo)致家禽的嚴(yán)重應(yīng)激反應(yīng)，造成呼吸道損傷出血、肝損傷、脾損傷、胸腺損傷和免疫反應(yīng)等[65]。Chen等[66]基于轉(zhuǎn)錄譜分析發(fā)現(xiàn)，在高NH3脅迫下，5個(gè)circRNAs和100個(gè)mRNAs顯著失調(diào)，并且GO結(jié)果表明，免疫反應(yīng)和細(xì)胞因子調(diào)控因高NH3脅迫而失調(diào)，共表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，circRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)與氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)緊密相關(guān)。高NH3脅迫下調(diào)了抗氧化基因GPx和GST4的表達(dá)，上調(diào)炎性基因IL-1、IL-6和IL-8的表達(dá)[66]。

5.5 circRNA調(diào)控家禽的肌內(nèi)脂肪沉積

家禽以其肉質(zhì)鮮美、風(fēng)味獨(dú)特而受消費(fèi)者青睞，而脂肪是決定肉質(zhì)風(fēng)味關(guān)鍵性因素。影響畜禽機(jī)體內(nèi)脂肪含量的因素包括脂肪合成代謝和肌內(nèi)脂肪沉積。有研究表明，肌內(nèi)脂肪沉積受到circRNA調(diào)控，王莎莎[67]在對(duì)櫻桃谷鴨的誘導(dǎo)前后脂肪細(xì)胞的RNA測(cè)序中發(fā)現(xiàn)，大量ncRNAs差異表達(dá)，其中有66個(gè)circRNAs顯著上調(diào)，75個(gè)顯著下調(diào)；GO和KEGG結(jié)果顯示，差異基因大量富集在脂肪酸合成代謝，不飽和脂肪酸合成等通路中，進(jìn)一步構(gòu)建circRNA/LncRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)為研究鴨脂肪沉積調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)[67]。

6 展 望

借助于第二代高通量測(cè)序平臺(tái)，circRNA如雨后春筍般由無用的剪接垃圾走進(jìn)研究者的學(xué)術(shù)殿堂。雖然大量的基礎(chǔ)研究已經(jīng)證實(shí)了circRNA的剪接機(jī)制和功能，但有一些問題仍亟待解決，如circRNAs的降解機(jī)制。目前，僅有有限的研究報(bào)道闡釋circRNA的降解，在這一方向的研究十分匱乏。Hansen等[42]報(bào)道了ciRS-7結(jié)合miR-671激發(fā)ciRS-7的解環(huán)降解和AGO2介導(dǎo)的的mRNA沉默，然而這是基于特定序列，對(duì)于成千上萬種circRNAs并不適用。Lasda和Parker[68]一項(xiàng)使用三細(xì)胞系的研究發(fā)現(xiàn)，circRNA的代謝是通過胞外小體和微囊泡將聚集過量的circRNA從細(xì)胞中清除，對(duì)于這一降解機(jī)制是否適用于不同細(xì)胞定位circRNA的降解仍有待研究，此外，是否還存在其他降解機(jī)制或胞內(nèi)排出機(jī)制也不可知。在circRNA的研究中大多僅限于轉(zhuǎn)錄組學(xué)，而對(duì)于多組學(xué)的聯(lián)合分析少之又少。如果在circRNA翻譯功能研究中聯(lián)合蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)，從多組學(xué)、多角度、多方向進(jìn)行整合研究，可能會(huì)發(fā)現(xiàn)非常有研究?jī)r(jià)值的circRNA翻譯調(diào)控機(jī)制。目前，circRNA的研究對(duì)象主要集中在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域生物標(biāo)志物的研究，但circRNA在家禽等經(jīng)濟(jì)動(dòng)物中的研究也在蓬勃興起，篩選家禽經(jīng)濟(jì)性狀中關(guān)鍵circRNA，深度挖掘circRNA在家禽經(jīng)濟(jì)性狀中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，是未來circRNA在家禽研究中的重點(diǎn)突破對(duì)象。