何卓琳，唐敏嘉，張雪婧，侯 曉，蒲萬(wàn)霞

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用藥物創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室甘肅省新獸藥工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730050)

大腸桿菌(Escherichiacoli,E.coli)在環(huán)境和動(dòng)物體內(nèi)外廣泛存在，可通過(guò)飲水、食物以及密切接觸等途徑傳播[1]。糞便是E.coli的“儲(chǔ)存庫(kù)”[2]，可向外界散播病原菌，污染飲水、飼草、農(nóng)作物[3]，也可改變黏膜屏障破壞體內(nèi)菌群平衡或感染局部組織[4]，最終危害人類和動(dòng)物健康。養(yǎng)殖場(chǎng)通常添加干燥土壤和秸稈維持運(yùn)動(dòng)場(chǎng)的干燥和潔凈，同時(shí)也為微生物提供了繁殖場(chǎng)所，對(duì)動(dòng)物健康存在潛在危險(xiǎn)。糞便作為有機(jī)肥料，用于農(nóng)作物生產(chǎn)[5]，可增加動(dòng)植物間的傳播和食物鏈污染的風(fēng)險(xiǎn)[6]。

目前動(dòng)物感染和動(dòng)物產(chǎn)品污染致病性E.coli在動(dòng)物健康和公共衛(wèi)生安全上是一個(gè)嚴(yán)重的問(wèn)題。2019年4月在美國(guó)10個(gè)州暴發(fā)的牛肉污染E.coliO103事件強(qiáng)調(diào)了流行病學(xué)調(diào)查和尋找簡(jiǎn)便高效的微生物溯源技術(shù)及分型方法的重要性[7]。因此，準(zhǔn)確、快速地比較菌株間親緣關(guān)系和精細(xì)分型，對(duì)流行病學(xué)調(diào)查、控制和預(yù)防具有重要意義。本試驗(yàn)選擇奶牛養(yǎng)殖環(huán)境分離E.coli進(jìn)行親緣關(guān)系和系統(tǒng)進(jìn)化分群分析，以期為健康養(yǎng)殖提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品來(lái)源

2017—2019年，在新疆某大型奶牛場(chǎng)(養(yǎng)殖規(guī)模2.5萬(wàn)頭)相對(duì)固定位置采集樣品209份，見(jiàn)表1。糞(土)樣用五點(diǎn)混合采樣法采集，在運(yùn)動(dòng)場(chǎng)或糞池四周的中點(diǎn)及中心采樣(糞土五個(gè)點(diǎn)的樣同樣由五點(diǎn)采樣法所得)，每點(diǎn)均采500 g或500 mL左右，裝入自封袋或滅菌瓶，同一運(yùn)動(dòng)場(chǎng)或糞池的樣混勻?yàn)?份。采奶樣時(shí)，將乳房擦拭消毒，棄去前2把，收集8～10 mL于無(wú)菌離心管。水樣則隨機(jī)選擇3個(gè)使用水的出水口，各采集500 mL。空白土壤和苜蓿地樣品采集同糞(土)。

表1 樣品來(lái)源Table 1 Sample source

1.2 主要設(shè)備和試劑

PCR儀、凝膠成像儀(美國(guó)Applied Biosystems)、電泳儀(北京六一)、移液器和高速離心機(jī)(Eppendorf)。細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司；PremixTaqTM、10×TaqBuffer(Mg2+)、dNTP(2.5 mmol·L-1each)、Taq酶(5 U·μL-1)、DNA Marker均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；培養(yǎng)基購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)

所需引物[8-9]由北京擎科生物有限公司合成。

1.4 大腸桿菌的分離純化

稱取除奶及水外的樣品100 g或100 mL，加入400 mL滅菌LB液體培養(yǎng)基，混勻，吸上清液5 mL接于100 mL滅菌LB液體培養(yǎng)，37 ℃，160 r·min-1條件下增菌15 h。吸取1 mL奶樣或水樣，加到9 mL LB滅菌液體培養(yǎng)基中，增菌。無(wú)菌條件下蘸取增菌液，在麥康凱培養(yǎng)基上接種，37 ℃倒置培養(yǎng)18 h，挑取疑似單菌落2～5個(gè)，直至純化；將純化后的菌接于伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)16 h，觀察菌落是否為黑色帶金屬光澤，若是則保留，否則舍棄。

1.5 分離菌株的鑒定、去重及同源性分析

用純化菌株DNA為模板，擴(kuò)增16S rRNA序列。反應(yīng)體系25 μL：2×TaqPrimer Mix 12.5 μL，通用上下游引物、DNA模板各1 μL，ddH2O 9.5 μL。反應(yīng)退火條件為53 ℃ 45 s。擴(kuò)增產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，拍照記錄。把符合預(yù)期大小的產(chǎn)物送上海派森諾生物有限公司測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，按相似性≥99%判定。對(duì)分離E.coli用ERIC-PCR擴(kuò)增、電泳，來(lái)自同一樣品中條帶數(shù)目及大小一致的菌株視為重復(fù)，僅留1株。用MEGA7.0軟件對(duì)保留E.coli序列與參考株16S rRNA基因序列構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹(shù)，進(jìn)行同源性分析。

1.6 大腸桿菌的ERIC-PCR基因分型

以非重復(fù)E.coli的DNA做模板，用Eric引物擴(kuò)增，體系20 μL：10×TaqBuffer 2.5 μL、dNTP 2 μL、Taq酶1 μL、ERIC引物各0.5 μL，模板DNA1.5 μL；ddH2O 12 μL。反應(yīng)退火條件為52 ℃ 1 min。擴(kuò)增產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，并拍照記錄，把≥2條帶的菌株用Bio Numerics軟件繪制UPGMA聚類圖，條件位置差異容許度和優(yōu)化值為1.5%。按相似度≥75%為同一型判定多態(tài)性。

1.7 大腸桿菌的系統(tǒng)進(jìn)化分群

參考Clermont[8]的方法，進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分群試驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)菌分離鑒定、去重及同源性分析

經(jīng)增菌、特異性培養(yǎng)基分離純化、16S rRNA PCR檢測(cè)、測(cè)序、Blast比對(duì)及ERIC去重，141份分離出338株E.coli，2017—2019年分別為104、118和116株。分離率為67.46%(141/209)；糞(土)樣品分離率最高，為100%；2017—2019年奶樣分離率分別為46.67%、56.67%和73.33%；2017年空白土壤和苜蓿地樣品分離率為25%，其余樣品未分離出E.coli。經(jīng)16S rRNA相似性分析，較多糞(土)樣分離菌株與MN208150.1(尿液或環(huán)境分離，條件致病性)的相似性達(dá)100%。

2.2 ERIC-PCR基因分型

ERIC-PCR分型的條帶數(shù)為2～9，大小500～5 000 bp，將E.coli分為Ⅰ～ⅩⅣ共14型。Ⅳ型為優(yōu)勢(shì)型，196株，相似度77.7%～100%，29組菌株條帶相同，包括空白土壤分離E.coli；其次為Ⅰ型(59株)、Ⅴ(31株)、Ⅹ(11株)；剩余41株分布在其他10種型，部分聚類圖見(jiàn)圖1。2株苜蓿地樣品分離E.coli在Ⅳ和ⅩⅢ型，與同年糞(土)樣分離菌株基因型相同。奶樣分離E.coli的86.90%(73/84)聚在Ⅳ、Ⅰ、Ⅴ型，Ⅵ、Ⅷ、ⅩⅣ型無(wú)分布；90.48%與同年的糞(土)分離菌株同聚一型。

圖1 大腸桿菌ERIC-PCR基因分型的部分聚類樹(shù)狀圖Fig.1 Part of the cluster tree of ERIC-PCR typing of E. coli

2.3 系統(tǒng)進(jìn)化分群結(jié)果

338株E.coli被分為6個(gè)群，B1群占比最大，為75.45%(255/338)，其次是A、C、D或E和F群，分別為18.34%(62/338)、2.96%(10/338)、1.18%(4/338)和0.30%(1/338)。2018和2019年奶源分離菌各1株未分型。不同來(lái)源E.coli均B1群占主導(dǎo)。大育成牛運(yùn)動(dòng)場(chǎng)糞土源E.coli只有B1群；病牛糞土源E.coli系統(tǒng)進(jìn)化群最豐富，詳情見(jiàn)圖2。

A.原糞樣品；B.奶樣；C.運(yùn)動(dòng)場(chǎng)糞土樣品。ND.未分類的；占比(Y軸)=某種樣品某群菌株數(shù)/本樣品總菌株數(shù)×100%A.dung samples;B.milk samples;C.manure samples.ND.Unclassified；Percentage (Y-axis)=number of certain type bacteria in a sample /total bacteria in the sample×100%圖2 不同樣品分離E. coli的系統(tǒng)進(jìn)化分群類型分布及占比Fig.2 Distribution and proportion of phylogenetic groups of E. coli isolated from different samples

3 討 論

自然界E.coli廣泛分布，可通過(guò)糞便和廢水排入環(huán)境，通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體，一些致病性E.coli不僅給畜牧業(yè)發(fā)展造成危害，還威脅人類健康[10]。因此，了解養(yǎng)殖環(huán)境E.coli流行情況及遺傳進(jìn)化分群關(guān)系對(duì)預(yù)防疾病和維護(hù)健康至關(guān)重要，故本試驗(yàn)以養(yǎng)殖場(chǎng)環(huán)境E.coli為研究對(duì)象。本研究67.46%的分離率，與山東地區(qū)牛糞便和場(chǎng)污水78.6%和71.4%的分離率不同[11]；糞樣分離率與新疆不同日齡犢牛糞源E.coli的分離率[12]相同。受地理位置、管理方式、糞便處理方法、采樣因素的影響，分離率存在差異。

ERIC-PCR分型是高效、便捷、低成本的分子分型方法，是基于基因間重復(fù)共有序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，由條帶數(shù)目及大小進(jìn)行分型，用于評(píng)估菌株的遺傳多樣性和親緣關(guān)系。Staji等[13]發(fā)現(xiàn)，同一來(lái)源分離菌株基因存在差異，不同來(lái)源也可有較近的親緣關(guān)系。鄭曉風(fēng)等[14]用ERIC-PCR方法發(fā)現(xiàn)菌株間存在交叉?zhèn)鞑ァ１狙芯繉.coli分為14種型，可見(jiàn)其廣泛的DNA多樣性。90.48%奶樣分離菌株與糞(土)分離菌株親緣關(guān)系較近，表明E.coli會(huì)通過(guò)多途徑水平傳播?；贓RIC-PCR，27株O157：H7E.coli分為8種型[15]；我國(guó)華東地區(qū)的103株臨床乳腺炎E.coli被分為10個(gè)型[16]。本試驗(yàn)ERIC基因多樣性與上述報(bào)道存在差異，可能因地理位置、血清型不同造成。

E.coli致病力與系統(tǒng)發(fā)育群有關(guān)[17]。胃腸道黏膜上的共生E.coli無(wú)致病性，通常為A和B1群；引起腸道感染的大都為A、B1或D群；引起腸外感染的分布于B2和D群[18]，說(shuō)明A和B1群為條件致病性，B2和D群致病性較強(qiáng)。本研究分離E.coli大都是條件致病性的，分階段管理、提高飼養(yǎng)水平、及時(shí)并合理處理糞便可減少動(dòng)物發(fā)病。張星星等[19]報(bào)道新疆腹瀉犢牛糞源E.coli主要為A群，其次是D、B1、B2群；佟盼盼等[20]報(bào)道新疆地區(qū)牛源產(chǎn)志賀毒素E.coli(STEC)以A群為主(94.74%)，E群2.39%，B1、D和F群較少；張德顯[21]調(diào)查發(fā)現(xiàn)A群是遼寧地區(qū)臨床乳腺炎E.coli優(yōu)勢(shì)群；本研究顯示，奶牛養(yǎng)殖環(huán)境中E.coli主要為B1群，其次為A群，還有5.62%的C+D+E+F群；與上述兩報(bào)道不一致，一方面可能是早期的方法將C群歸入A群，而本文采用了最新的方法；另一方面樣品來(lái)源不同，可能影響試驗(yàn)結(jié)果。本研究未檢測(cè)到B2群，與馬帥等的研究[22]相比多出分離自病牛運(yùn)動(dòng)場(chǎng)糞土的F群；Sarowska等[23]報(bào)道F群與B2群相關(guān)，本研究結(jié)果與Sarowska等的報(bào)道相吻合。Rehman等[24]和Bessalah等[25]用最新方法分別研究腹瀉牦牛源和不同健康狀況駱駝源E.coli，結(jié)果顯示分別以A(79.5%)和B1群(53%)為主。本結(jié)果與其結(jié)果存在不同，這些差異可能與動(dòng)物種類、健康狀況及地理位置有關(guān)，需進(jìn)一步研究證實(shí)。

4 結(jié) 論

通過(guò)對(duì)E.coli的分離鑒定，共獲得非重復(fù)菌株338株；ERIC-PCR將其分為Ⅰ～ⅩⅣ共14種型，Ⅳ型為優(yōu)勢(shì)型；不同時(shí)間、生長(zhǎng)階段及來(lái)源E.coli的系統(tǒng)進(jìn)化分群以B1群為主。