趙 龍，湯 承,2，岳 華,2*

(1.西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，成都 610041；2.青藏高原動(dòng)物遺傳資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610041)

牛凸隆病毒(bovine torovirus,BToV)是套式病毒目(Nidovirales)托巴套氏病毒科(Tobaniviridae)凸隆病毒屬 (Torovirus)的成員[1]，是經(jīng)證實(shí)的牛腹瀉病原，主要引起犢牛腹瀉甚至死亡，同時(shí)也可引起成年牛腹瀉[2-3]。該病毒在牛呼吸道中也可檢出，具有雙重組織嗜性，是潛在的呼吸道致病因子[4-5]。自1982年在美國(guó)首次報(bào)道以來(lái)，目前世界上已有17個(gè)國(guó)家報(bào)道BToV的存在或流行，其已經(jīng)具有廣泛的地域分布[4-14]。

BToV為有囊膜單股正鏈RNA病毒，基因組由5′UTR和ORF1a、ORF1b、S、M、HE、N 6個(gè)ORF區(qū)以及3′UTR組成[15]。其中,HE基因編碼的血凝素酯酶蛋白(HE蛋白)具有凝集素結(jié)構(gòu)域 R(136—282 aa)、酯酶結(jié)構(gòu)域 E(21—135 aa、283—338 aa)、膜近端結(jié)構(gòu)域 MP(15—20 aa、339—384 aa)3個(gè) 結(jié)構(gòu)域[16-17]。在病毒感染的初期，HE蛋白幫助病毒實(shí)現(xiàn)與唾液酸的可逆性結(jié)合，從而逃避宿主的免疫作用[16,18-19]。這種具有受體破壞酶活性的結(jié)構(gòu)蛋白還在A群β冠狀病毒、C型流感病毒、傳染性鮭魚貧血病毒這3類病毒中發(fā)現(xiàn)[16,19-21]。在A群β冠狀病毒中，血凝素酯酶蛋白不僅作為病毒感染過(guò)程中的第二受體，還參與宿主特異性和組織嗜性的改變，并且還能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體[22-24]。在C型流感病毒中，血凝素酯酶蛋白的變異可能會(huì)導(dǎo)致病毒發(fā)生抗原漂移[25]。而在傳染性鮭魚貧血病毒中，血凝素酯酶蛋白則決定著病毒的致病性[21]?？梢娧仵ッ傅鞍着c病毒的毒力改變、組織嗜性改變、和跨種間傳播密切相關(guān)，在病毒的感染與進(jìn)化中起著重要作用。

根據(jù)HE基因序列特征可將BToV劃分為3個(gè)基因型(基因Ⅰ～Ⅲ型)[26]，當(dāng)前世界各國(guó)主要流行的是Ⅱ型和Ⅲ型[3,8,27]。本實(shí)驗(yàn)室最近證明了BToV在國(guó)內(nèi)牛群中的存在，檢測(cè)到的毒株均為Ⅱ型毒株[8]。目前，BToV在國(guó)內(nèi)牛群中的流行病學(xué)資料仍然很少，本研究旨在進(jìn)一步分析我國(guó)BToVHE基因分子特征，為牛腹瀉疾病的防控和BToV的遺傳進(jìn)化研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 臨床樣本

94份牛腹瀉樣本采集于2018年11月—2020年9月，其中，20份犢奶牛(3月齡以內(nèi))腹瀉樣本采自遼寧2個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)，58份犢奶牛(3月齡以內(nèi))腹瀉樣本采自河南2個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)，16份肉牛(6月齡)腹瀉樣本采自四川1個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)，樣本凍存于-80 ℃。

1.2 主要試劑及儀器

TrizolTM、pMD19-T克隆載體、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DH5α感受態(tài)細(xì)胞等購(gòu)于寶生物工程(大連)有限公司；PCR預(yù)混酶Quick Taq HS Dye Mix購(gòu)于東洋紡(上海)生物科技有限公司；凝膠成像系統(tǒng)Doc2000(Bio-Rad公司，美國(guó))；基因擴(kuò)增儀(ThermoFisher Scientific公司，美國(guó))。

1.3 RNA提取與cDNA合成

取糞便0.2 g與PBS緩沖液(1∶5)混勻后以8 000 r·min-1離心8 min，取上清液400 μL用Trizol 法提取RNA，然后反轉(zhuǎn)錄合成cDNA凍存于-20 ℃ 待用。

1.4 臨床樣本中BToV的檢測(cè)

采用本實(shí)驗(yàn)室建立的RT-PCR方法[8]進(jìn)行BToV檢測(cè)。PCR陽(yáng)性產(chǎn)物送生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序以驗(yàn)證檢測(cè)準(zhǔn)確性。

1.5 HE基因擴(kuò)增

根據(jù)GenBank中已有的3條完整基因Ⅰ型HE基因序列，15條完整Ⅱ型HE基因序列，3條完整Ⅲ型HE基因序列(參考序列GenBank登錄號(hào)已在遺傳進(jìn)化樹中標(biāo)出)，采用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)6對(duì)引物(表1)，用于擴(kuò)增陽(yáng)性樣本中不同基因型的完整HE基因。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s，48 ℃ 30 s，68 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)。反應(yīng)體系：QuickTaqHS Dye Mix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA 2 μL，ddH2O補(bǔ)足25 μL。陽(yáng)性PCR產(chǎn)物使用膠回收試劑盒回收后連接pMD19-T載體，轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞，增菌后送生工生物工程(上海)有限公司測(cè)序。對(duì)獲得的序列采用SeqMan7.0 (version 7.0;DNASTAR,USA)拼接。

表1 HE基因擴(kuò)增引物信息Table 1 Primer information of HE gene

1.6 遺傳進(jìn)化和重組及結(jié)構(gòu)分析

使用MEGA 7.0.26進(jìn)行多序列比對(duì)，并采用最大似然法建立氨基酸系統(tǒng)發(fā)育樹；使用MegAlign (DNASTAR Inc.,WI,USA)計(jì)算核苷酸和氨基酸相似性；使用SimPlot 3.5.1和RDP 4.97中的RDP、GeneConv、Chimaera、MaxChi、BootScan、SiScan、3Seq 7種方法進(jìn)行重組分析；參照牛凸隆病毒血凝素酯酶(SMTL ID：3i26.1)的晶體結(jié)構(gòu)，使用SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org/interactive)和UCSF Chimera 1.14構(gòu)建本研究中HE蛋白的三維模型[16]。

2 結(jié) 果

2.1 腹瀉樣本中BToV檢測(cè)

從94份牛腹瀉樣本檢出10份BToV陽(yáng)性，平均陽(yáng)性率為10.64%，陽(yáng)性樣本分別來(lái)自遼寧和河南以及四川的4個(gè)牛場(chǎng)；遼寧、河南、四川的陽(yáng)性率：10%(2/20)、1.72%(1/58)、43.75%(7/16)。

2.2 HE基因擴(kuò)增和序列分析

從10份陽(yáng)性樣本中成功擴(kuò)增得到15條完整HE基因，包括9條Ⅱ型(GenBank登錄號(hào)：MW281062～MW281068、MW114526、MW114527)和6條Ⅲ型(GenBank登錄號(hào)：MW281069～MW281073、MW114525)，其中,四川的5份陽(yáng)性樣本存在基因Ⅱ型和Ⅲ型毒株的混合感染，河南的1份樣本單獨(dú)感染基因Ⅲ型毒株，遼寧和四川的各2份樣本單獨(dú)感染Ⅱ型毒株。

本研究獲得的6條完整的基因Ⅲ型HE基因長(zhǎng)度均為1 257 bp，編碼418個(gè)氨基酸，在238位點(diǎn)(相比Ⅱ毒株)缺失1個(gè)氨基酸。它們之間的核苷酸相似性為98.6%～100.0%，氨基酸相似性為98.1%～100.0%，與GenBank中已有的21個(gè)完整HE基因的核苷酸相似性為71.8%～99.3%，氨基酸相似性為71.2%～99.0%。進(jìn)一步分析表明，與GenBank中已有的3條國(guó)外Ⅲ型毒株HE基因相比，本研究獲得的6條Ⅲ型毒株的HE基因具有共同的4個(gè)氨基酸位點(diǎn)突變：V78A、E143A、S238T、Y418H，其中,V78A位于酯酶結(jié)構(gòu)域，E143A、S238T則位于凝集素結(jié)構(gòu)域?；谕暾鸋E基因氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育分析表明，本研究獲得的6條完整的基因Ⅲ型HE基因則在進(jìn)化樹上聚為獨(dú)立的1個(gè)小支，與土耳其毒株MG957145.1親緣關(guān)系最近(圖1)。

本研究獲得的9條Ⅱ型HE基因長(zhǎng)度均為1 260 bp，編碼419個(gè)氨基酸，它們之間的核苷酸相似性為96.0%～100.0%，氨基酸相似性為96%～100%，與GenBank中其余的21個(gè)完整HE基因的核苷酸相似性為77.1%～99.0%，氨基酸相似性為77.1%～99.0%。與GenBank中已有的15條Ⅱ型HE基因相比，本試驗(yàn)Ⅱ型毒株MW281064、MW114526、MW114527和GenBank中Ⅱ型毒株MN073058、MN073059、AJ575379.1 在凝集素結(jié)構(gòu)域中存在1個(gè) 獨(dú)特的氨基酸突變(T150A)。而本試驗(yàn)Ⅱ型毒株MW281062、MW281063、MW281065～MW281068和土耳其Ⅱ型毒株MG957146.1則具有2個(gè)共同的氨基酸突變(I52V、T177N)，分別位于凝集素結(jié)構(gòu)域和酯酶結(jié)構(gòu)域?；谕暾鸋E基因氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育分析表明，本研究中獲得的9條Ⅱ型HE基因由于上述的氨基酸突變導(dǎo)致它們?cè)谶z傳進(jìn)化樹上分別聚為2個(gè)不同的分支(圖1)。

▲.本研究中BToV毒株；■.中國(guó)BToV毒株▲.BToV strains in this study;■.BToV strains in China圖1 BToV完整HE基因氨基酸序列進(jìn)化樹Fig.1 Phylogenetic tree based on the complete amino acid sequence of HE genes

選取GenBank中39條完整HE基因(包括GenBank中已有的21條BToVHE基因、本研究獲得的15條BToVHE基因、3條豬凸隆病毒(PToV)HE基因：AJ575363.1～AJ575365.1)進(jìn)行重組分析，結(jié)果表明，本研究獲得的9條Ⅱ型HE基因存在重組事件，預(yù)測(cè)的重組位點(diǎn)和親本毒株與Smits等[26]的研究一致。同時(shí)6條基因Ⅲ型HE基因也鑒定出重組事件(RDP、GeneConv、Chimaera、MaxChi、BootScan、SiScan、3Seq7種方法支持，得分為0.493)，重組區(qū)域位于105—1 083 bp，預(yù)測(cè)的主要親本毒株是Ⅰ型原型毒株AF076621.1，次要親本毒株是Ⅱ型毒株AB661461.1(圖2)。SimPlot 3.5.1也支持該重組事件；進(jìn)一步分析顯示3個(gè)國(guó)外Ⅲ型毒株AJ575380.1、AJ575381.1、MG957145.1也具有相同的重組事件。

圖2 BToV-MW114525 HE基因重組分析Fig.2 Recombinant analysis the HE gene of BToV-MW114525

根據(jù)BToV HE蛋白晶體結(jié)構(gòu)(SMTL ID：3i26.1)構(gòu)建的三維模型表明，本研究獲得的6個(gè)Ⅲ型HE蛋白模型在238—240位點(diǎn)處的無(wú)規(guī)卷曲與其余國(guó)外Ⅲ型毒株有差別(圖3C)。由于所有Ⅲ型毒株在238位點(diǎn)(相比Ⅱ型毒株)存在1個(gè)氨基酸缺失，Ⅲ型毒株在238—240位點(diǎn)的無(wú)規(guī)卷曲均短于Ⅱ型毒株(圖3A、B)。

A.本研究中基因Ⅱ型毒株SC06；B.國(guó)外基因Ⅲ型毒株HT1(GenBank：MG957145.1)；C.本研究中基因Ⅲ型毒株HN01；藍(lán)色.凝集素結(jié)構(gòu)域(R)；綠色.酯酶結(jié)構(gòu)域(E)；紅色.膜近端結(jié)構(gòu)域(MP)；虛線框內(nèi)表示有改變的空間結(jié)構(gòu)Predicted crystal structures of the BToV HE proteins from three strains:A.Genotype Ⅱ strain SC06 in this study;B.Genotype Ⅲ strain HT1 (GenBank accession No.MG957145.1);C.Genotype Ⅲ strain HN01 in this study.The domains are color-coded:lectin domain (R,blue);esterase domain (E,green);membrane-proximal domain (MP,red).The boxed portions of the structures indicate the different conformations of the same R domain of BToV strains圖3 基于BToV HE蛋白晶體結(jié)構(gòu)(SMTL ID：3i26.1)構(gòu)建的三維模型Fig.3 The 3D models constructed based on the crystal structure of BToV hemagglutinin-esterase (SMTL ID:3i26.1)

3 討 論

BToV是導(dǎo)致牛腹瀉的重要病原，主要引起犢牛腹瀉，同時(shí)也可引起成年牛腹瀉，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[2,3,6,18,28]。BToV在我國(guó)屬于新發(fā)牛腹瀉病原，本實(shí)驗(yàn)室前期報(bào)道了BToV在國(guó)內(nèi)的存在和流行，均為基因Ⅱ型毒株[8]，繼獲得牦牛源BToV基因Ⅲ型基因組[29]后，本研究首次報(bào)道了基因Ⅲ型毒株在我國(guó)牛群中的存在，為了解國(guó)內(nèi)BToV的遺傳多樣性提供了有用的信息。本試驗(yàn)鑒定了Ⅲ型和Ⅱ型毒株的混合感染，這是首次觀察到BToV不同基因型混合感染現(xiàn)象，有助于進(jìn)一步了解BToV的感染和流行特征。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，本研究獲得的9條Ⅱ型毒株分為2個(gè)不同的分支(圖1)，不同分支上的毒株各自產(chǎn)生了獨(dú)特的氨基酸突變，顯示出國(guó)內(nèi)基因Ⅱ型毒株具有遺傳多樣性。而6條Ⅲ型毒株則獨(dú)立聚為1支，顯示出Ⅲ型毒株在我國(guó)具有獨(dú)特的遺傳進(jìn)化趨勢(shì)(圖1)。由于樣本數(shù)量有限，不同基因型毒株在我國(guó)的流行情況還需進(jìn)一步調(diào)查。

BToV HE蛋白具有凝集素結(jié)構(gòu)域(136—282aa)、酯酶結(jié)構(gòu)域(21—135 aa、283—338 aa)和膜近端結(jié)構(gòu)域(15—20 aa、339—384 aa)3個(gè)結(jié)構(gòu)域[16-17]，其中，凝集素結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)病毒與宿主細(xì)胞的唾液酸結(jié)合，HE蛋白的238—240位點(diǎn)位于凝集素結(jié)構(gòu)域空間結(jié)構(gòu)的最外側(cè)，可能在病毒結(jié)合受體的過(guò)程中起著重要作用[16]。而酯酶結(jié)構(gòu)域則發(fā)揮受體破壞酶活性，使病毒可逆性黏附唾液酸，幫助病毒逃避宿主的體液免疫[16-17]。與GneBank中僅有的國(guó)外3條Ⅲ型HE基因相比，本試驗(yàn)獲得的6條Ⅲ型HE基因具有共同的2個(gè)氨基酸位點(diǎn)突變(E143A、S238T)位于HE蛋白的凝集素結(jié)構(gòu)域[16-17]，特別238位氨基酸位點(diǎn)由絲氨酸突變?yōu)樘K氨酸引起238—240位點(diǎn)處的無(wú)規(guī)卷曲也發(fā)生了改變，這可能會(huì)影響病毒與宿主唾液酸的結(jié)合[16-17]。此外，獲得的6條Ⅲ型HE基因在酯酶結(jié)構(gòu)域還有1個(gè)相同的氨基酸突變(V78A)，是否會(huì)影響病毒與唾液酸的可逆性黏附有待于進(jìn)一步研究[16-17]。

相比Ⅰ型和Ⅱ型毒株，所有Ⅲ型毒株(包括本研究毒株)在凝集素結(jié)構(gòu)域中存在2個(gè)獨(dú)特的氨基酸突變(G210D、L170V)，而該位點(diǎn)是形成結(jié)合受體的“疏水袋”關(guān)鍵位點(diǎn)[16-17]，這可能就會(huì)改變整個(gè)基因Ⅲ型BToV毒株與唾液酸受體的結(jié)合能力，進(jìn)而影響病毒與宿主細(xì)胞的結(jié)合[16-17]。在酯酶結(jié)構(gòu)域中，所有Ⅲ型毒株(包括本研究毒株)的2個(gè)位點(diǎn)產(chǎn)生了突變(R103H、Y294R)，由于該位點(diǎn)與HE蛋白結(jié)合唾液酸類型有關(guān)[16-17]，因此，這可能會(huì)改變基因Ⅲ型BToV毒株的唾液酸的結(jié)合類型，從而影響基因Ⅲ型BToV毒株的組織噬性。而相比Ⅰ型和Ⅲ型，所有Ⅱ型毒株(包括本研究毒株)則發(fā)生了1個(gè)氨基酸突變(L168F)，該位點(diǎn)也是形成結(jié)合受體的“疏水袋”關(guān)鍵位點(diǎn)[16-17]，可能會(huì)影響Ⅱ型BToV毒株與宿主細(xì)胞受體的結(jié)合能力。最早報(bào)道BToV的毒株均為Ⅰ型毒株[15,30]，但目前各國(guó)流行的卻是Ⅱ型和Ⅲ型毒株[3,8,27]，這種流行情況的改變可能與這些氨基酸突變有關(guān)，值得進(jìn)一步調(diào)查。

Smits等[26]于2003年的研究顯示，基因Ⅱ型BToV毒株是由原型(Ⅰ型)毒株與PToV在HE基因的3′端發(fā)生重組而來(lái)，而Ⅲ型BToV毒株可能是Ⅱ型BToV毒株與一種未知的ToV在HE基因的中間區(qū)域發(fā)生重組而來(lái)。本研究預(yù)測(cè)的Ⅱ型毒株重組事件與先前研究結(jié)果一致[26]，但Ⅲ型毒株的重組事件所預(yù)測(cè)的親本毒株與先前研究結(jié)果不同[26]。本研究結(jié)果顯示，Ⅲ型毒株是由Ⅰ型毒株和Ⅱ型毒株重組而來(lái)，預(yù)測(cè)出的親本毒株為Ⅰ型毒株AF076621.1和Ⅱ型毒株AB661461.1，重組區(qū)域位于105—1 083 bp，并且GneBank中其余Ⅲ型毒株均具有相同重組事件。造成該重組分析結(jié)果不同的原因是本研究在做重組分析時(shí)加入了GneBank中近年新登錄的BToVHE基因序列。這種通過(guò)HE基因同源重組產(chǎn)生新基因型毒株可能是病毒在進(jìn)化過(guò)程中逃避宿主免疫的一種策略[18-19,31]，這對(duì)進(jìn)一步了解BToV的遺傳進(jìn)化有重要意義。

4 結(jié) 論

本研究證實(shí)了基因Ⅲ型BToV在我國(guó)牛群中的存在，首次鑒定了BToV不同基因型毒株的混合感染，為國(guó)內(nèi)牛腹瀉防控提供了參考。本研究獲得的6條Ⅲ型HE基因存在4個(gè)獨(dú)特的氨基酸突變，其中2個(gè)突變位點(diǎn)位于凝集素結(jié)構(gòu)域，1個(gè)突變位點(diǎn)位于酯酶結(jié)構(gòu)域，可能會(huì)影響病毒與受體的結(jié)合。重組分析顯示Ⅲ型BToV毒株可能是Ⅱ型BToV毒株與Ⅰ型BToV毒株重組而來(lái)，對(duì)進(jìn)一步了解BToV的遺傳進(jìn)化有重要意義。