張志誠(chéng)，陳梅娟，艾 軍

(1.中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，國(guó)家非洲豬瘟參考實(shí)驗(yàn)室，青島 266032;2.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院,銀川 750000；3.昆明海關(guān)技術(shù)中心，昆明 650228)

豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)為尼多病毒(Nidovirales)目、冠狀病毒(Coronaviridae)科、α-冠狀病毒(Alphacoronavirus)屬成員[1]，是一種可引起豬急性腹瀉、嘔吐、脫水和仔豬高死亡率的傳染性腸道病毒。PEDV最初20世紀(jì)70年代出現(xiàn)在英國(guó)，隨后迅速傳至西班牙等其他歐洲國(guó)家。PEDV于2013年5月首次在美國(guó)發(fā)現(xiàn)，并迅速傳播，導(dǎo)致美國(guó)養(yǎng)豬業(yè)損失嚴(yán)重[2]。PEDV感染對(duì)豬健康危害極大，雖然其對(duì)人的感染和直接危害尚未報(bào)道，但單就PEDV病毒遺傳基因序列與在蝙蝠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的冠狀病毒具有高度相似性[3-6]以及實(shí)際生活場(chǎng)景中人-豬生態(tài)界面的多重重復(fù)性、深度交叉性和互動(dòng)性而言，提示該病毒對(duì)公共衛(wèi)生安全具有特殊意義，隨著2020年新型冠狀病毒Sars-CoV-2(COVID-19)在全球大流行以來(lái)，這種不確定性風(fēng)險(xiǎn)越來(lái)越被廣泛關(guān)注。冠狀病毒科由4個(gè)屬組成：α冠狀病毒、β冠狀病毒、γ冠狀病毒和δ冠狀病毒[7-8]。α屬的冠狀病毒和β屬冠狀病毒對(duì)哺乳類(lèi)動(dòng)物危害極大，α屬的冠狀病毒對(duì)哺乳動(dòng)物致病的代表性成員有HCoV-229E、HCoV-NL63、PEDV、傳染性胃腸炎病毒(transmissible gastroenteritis virus，TGEV)、豬呼吸道冠狀病毒(porcine respiratory coronavirus,PRCV)以及近些年發(fā)現(xiàn)的由蝙蝠中一種新型的HKU2冠狀病毒外溢到豬群的高致死性豬急性腹瀉綜合征冠狀病毒(swine acute diarrhoea syndrome coronavirus,SADS-CoV)等[9-10]。β冠狀病毒包括HCoV-OC43、HCoV-HKU1、severe acute respiratory syndrome-associated coronavirus (SARS-CoV)、Middle East respiratory syndrome coronavirus (MERS-CoV)以及目前全球流行的SARS-CoV2(COVID-19)等[7]。γ冠狀病毒和δ冠狀病毒主要對(duì)禽類(lèi)等危害嚴(yán)重，但也會(huì)對(duì)哺乳動(dòng)物有嚴(yán)重危害，如δ屬的成員有豬δ冠狀病毒 (porcine delta-coronavirus,PDCoV)[7-8]。養(yǎng)殖家畜及野生哺乳動(dòng)物豬、牛、蝙蝠等在Sars-CoV-1、Mers-CoV以及Sars-CoV-2等人間冠狀病毒的幾次大流行中都被認(rèn)為具有某種特殊的流行病學(xué)意義，蝙蝠體內(nèi)冠狀病毒與PEDV高度相似的基因序列[3-6]，提示養(yǎng)殖家畜和人群的生態(tài)界面的互動(dòng)可能會(huì)加速病毒的種間變異。PEDV作為一種感染可導(dǎo)致豬高死亡率的冠狀病毒，目前雖無(wú)直接證據(jù)表明其和目前全球流行的新型冠狀病毒COVID-19的直接關(guān)聯(lián)，但其作為RNA病毒的冠狀病毒科、α-冠狀病毒亞屬成員，在遺傳變異、致病力、傳播擴(kuò)散以及宿主危害選擇等方面存在極大的不確定性和可變性，同時(shí)其也是國(guó)際貿(mào)易，尤其是當(dāng)前中美生豬及豬肉貿(mào)易中具有重要檢疫性意義的病原微生物。為此，本文在對(duì)PEDV的病原學(xué)、流行病學(xué)、傳播途徑結(jié)合近年來(lái)美國(guó)PEDV流行株發(fā)生和監(jiān)測(cè)等方面信息挖掘基礎(chǔ)上，基于2019年美國(guó)生豬入境我國(guó)西南地區(qū)陸路口岸利用抗體檢測(cè)篩查結(jié)果，結(jié)合貝葉斯統(tǒng)計(jì)推斷，依托Poptools在Excel的插件作為量化平臺(tái)，開(kāi)展對(duì)美國(guó)豬群中的PEDV真流行率的分布推斷研究，以期為當(dāng)前美國(guó)生豬及豬肉制品入境我國(guó)口岸的風(fēng)險(xiǎn)管理及其檢疫監(jiān)測(cè)和抽樣技術(shù)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來(lái)源

本研究中美國(guó)養(yǎng)殖豬群PEDV先驗(yàn)信息表觀流行率的咨詢主要包括來(lái)自2019年11和12月美國(guó)豬病報(bào)告系統(tǒng)對(duì)育肥豬(wean to market)、母豬(sow)和無(wú)法確定生長(zhǎng)階段和身份的豬(unknown status)的監(jiān)測(cè)結(jié)果(檢測(cè)數(shù)和陽(yáng)性數(shù))的報(bào)告[Domestic Disease Monitoring Reports-Swine Health Information Center &Swine Disease Reporting System(SDRS)|College of Veterinary Medicine |Iowa State University (iastate.edu)]，美國(guó)豬病研究平臺(tái)系統(tǒng)(SDRS)[11]是一個(gè)可以公開(kāi)訪問(wèn)的監(jiān)測(cè)報(bào)告系統(tǒng)，游走的不確定身份豬PEDV監(jiān)測(cè)信息[12]來(lái)自PubMed國(guó)際科技網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)文獻(xiàn)資料查新。2019年度來(lái)自美國(guó)進(jìn)口生豬入境中國(guó)口岸監(jiān)測(cè)和檢測(cè)信息，來(lái)自國(guó)家出入境檢驗(yàn)檢疫局昆明海關(guān)技術(shù)中心實(shí)驗(yàn)室。

1.2 PEDV入境我國(guó)口岸篩查與檢測(cè)

目前PEDV診斷試劑可分為病毒學(xué)和血清學(xué)方法的試劑兩類(lèi)。病毒學(xué)的試劑主要針對(duì)病原、核酸和蛋白，而血清學(xué)的試劑主要是針對(duì)由于感染引起的免疫應(yīng)答的抗體檢測(cè)。2019年，美國(guó)入境中國(guó)西南陸路昆明海關(guān)的活豬的口岸篩查使用ID Screen PEDV Indirect ELISA抗體檢測(cè)試劑盒 (ID Screen?PEDV Indirect Screening test (IDvet,Grabels,France)。按照ID Screen?PEDV Indirect Screening test試劑盒判定標(biāo)準(zhǔn)的說(shuō)明，S /P%≥60%被認(rèn)為是抗體陽(yáng)性，而<60%被認(rèn)為是陰性。

1.3 貝葉斯統(tǒng)計(jì)推斷

貝葉斯理論和方法是知識(shí)學(xué)習(xí)、統(tǒng)計(jì)決策以及風(fēng)險(xiǎn)優(yōu)化過(guò)程[13]，同時(shí)也是人工智能(artificial intelligence-AI)技術(shù)和機(jī)器學(xué)習(xí)的統(tǒng)計(jì)理論基礎(chǔ)，其廣泛應(yīng)用于進(jìn)化醫(yī)學(xué)和生物學(xué)、醫(yī)療診斷[10,14-17]、人口調(diào)查與統(tǒng)計(jì)評(píng)估、監(jiān)測(cè)與抽樣[18-29]等多個(gè)方面。貝葉斯統(tǒng)計(jì)的表達(dá)公式：

①

其中，Pr(θ)為“先驗(yàn)分布”，它表達(dá)了觀察和認(rèn)知X事件前對(duì)X事件相關(guān)因素的認(rèn)識(shí)程度或經(jīng)驗(yàn)的描述，為處理問(wèn)題實(shí)際需要，它通?？梢杂媒y(tǒng)計(jì)分布函數(shù)來(lái)簡(jiǎn)化，用以表達(dá)對(duì)事件X事件的一種確認(rèn)度不高的,或者不確定性的認(rèn)識(shí)。X在本文中為美國(guó)豬群中的PEDV感染狀況分布。動(dòng)物個(gè)體對(duì)特定病源微生物的感染狀態(tài)函數(shù)通常用二項(xiàng)分布函數(shù)(Binomial distribution)或者伯努利分布 (Burnell distribution)函數(shù)來(lái)描述[25,30-31]，但畜群感染特定病源微生物流行率推斷要復(fù)雜得多，臨床癥狀或者可靠的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)可以為該參數(shù)的估計(jì)和推斷提供先驗(yàn)認(rèn)知。先驗(yàn)分布代表了在探究、探索和查詢目標(biāo)事件發(fā)生前，人們已經(jīng)存在的對(duì)目標(biāo)事件的一種經(jīng)驗(yàn)分布和認(rèn)識(shí)，對(duì)該概念及其參數(shù)化的認(rèn)識(shí)是貝葉斯統(tǒng)計(jì)與傳統(tǒng)的基于頻率分布的數(shù)值統(tǒng)計(jì)的最本質(zhì)區(qū)別。本研究的先驗(yàn)分布函數(shù)定義為在開(kāi)展美國(guó)生豬入境昆明口岸開(kāi)展抗體檢測(cè)篩查前的PEDV在美國(guó)的發(fā)生狀況的認(rèn)識(shí)。本文中美國(guó)豬群中攜帶PEDV的先驗(yàn)分布信息主要是通過(guò)查詢美國(guó)豬病研究平臺(tái)(SDRS)咨詢，以2019年11—12月監(jiān)測(cè)報(bào)告中的陽(yáng)性檢測(cè)數(shù)及其表觀流行率分布為基數(shù)，選擇利用二項(xiàng)分布模型的共軛分布函數(shù)模型Beta(α，β)來(lái)描述美國(guó)豬群PEDV在開(kāi)展本研究之前的未知患病率，以其作為統(tǒng)計(jì)推斷真流行率的先驗(yàn)信息，其中，α=陽(yáng)性檢測(cè)數(shù)量+1，β =陰性檢測(cè)數(shù)量+1[10,25]，Beta分布：

Prior P(ρ)～Beta(α,β)=>ρ|α,β=B (α,β)ρα-1(1-ρ)β-1

②

Pr(X|θ)“似然函數(shù)”(likelihood function)，Pr(X|θ)表達(dá)為在給定先驗(yàn)分布Pr(θ)的條件下隨機(jī)觀察到事件X的概率分布。二項(xiàng)分布的X(xi)的概率質(zhì)量函數(shù)-Binomial distribution probability mass function (pmf)的計(jì)算表達(dá)式

③

Pr(θ|X)為“后驗(yàn)分布”，它用來(lái)描述觀察x事件后先驗(yàn)認(rèn)知和綜合了新咨詢后認(rèn)知到的X，它也是貝葉斯推斷的最終目標(biāo)。在本文中指代美國(guó)豬群PEDV真流行率分布函數(shù)，該分布函數(shù)的真實(shí)數(shù)值分布可以通過(guò)系統(tǒng)監(jiān)測(cè)和大樣本抽樣來(lái)獲取，更大的樣本抽樣監(jiān)測(cè)可以為獲取真實(shí)流行率提供更加有把握的統(tǒng)計(jì)認(rèn)知和確認(rèn)，但大樣本的監(jiān)測(cè)和抽樣對(duì)應(yīng)的是大的人力、物力和財(cái)力投入。統(tǒng)計(jì)抽樣提供了解決此問(wèn)題的思路，通常通過(guò)一定數(shù)量小樣本抽樣可以獲取近似準(zhǔn)確的認(rèn)識(shí)?；诖苏J(rèn)識(shí)作為假設(shè)，以入境我國(guó)西南陸路昆明口岸的美國(guó)生豬作為美國(guó)養(yǎng)殖豬群中的一個(gè)小樣本抽樣，該入境豬群樣本可以在一定程度上反映美國(guó)豬群的統(tǒng)計(jì)特征，但不同樣本數(shù)量大小(N)所附帶的統(tǒng)計(jì)特征的不確定性會(huì)有較大差異。基于該美國(guó)入境生豬小樣本在昆明口岸利用IDVetScreen?PEDV Indirect Screening test試劑盒開(kāi)展的PEDV實(shí)驗(yàn)室抗體篩查檢測(cè)為進(jìn)一步從統(tǒng)計(jì)上更新了對(duì)美國(guó)豬群的PEDV實(shí)際流行率的認(rèn)識(shí)。

2 結(jié) 果

2.1 口岸PEDV抗體檢測(cè)及其參數(shù)分布

PEDV基因組是單股正鏈RNA，基因組全長(zhǎng)約 28 kb,其主要由3個(gè)部分組成，包括 5′端非編碼區(qū)(5′-UTR)，3′非編碼區(qū)(3′-UTR)，7 個(gè)開(kāi)放閱讀框(ORF1a、ORF1b、ORF2～6)，其中ORF編碼12種非結(jié)構(gòu)蛋白與4種結(jié)構(gòu)蛋白[spike (S)、envelope (E)、membrane (M)、nucleocapsid (N)]和1種ORF3編碼的NS3B輔助蛋白[32]。目前，在美國(guó)豬群中至少存在兩種遺傳上不同的PEDV菌株，即PEDV原型菌株(U.S.PEDV prototype strain)和S-INDEL變異菌株(S-INDEL-variant strain)[33-36]。此外新近分離到的 PEDV PC177和 Minnesota188被認(rèn)為是原型菌株的變種[37]。目前，對(duì)PEDV的血清學(xué)檢測(cè)試劑包括間接熒光抗體 (indirect fluorescent antibody，IFA)、病毒中和試驗(yàn) (virus neutralization，VN)、基于全病毒(whole virus，WV)酶聯(lián)免疫ELISA抗體試劑，基于重組的S1蛋白ELISA和基于N (nucleocapsid)蛋白的ELISA等[37],其都是基于原型毒株(U.S.PEDV prototype),但Chen 等[37]2016的研究顯示，目前基于原型株-U.S.PEDV prototype的血清學(xué)檢測(cè)試劑都可以檢出變異株-S-INDEL-variant strain的抗體。

2019—2020年，美國(guó)入境的生豬在西南陸路口岸實(shí)驗(yàn)室利用IDVet ELISA開(kāi)展抗體篩查，該試劑盒主要是針對(duì)PEDV G2b基因組的N蛋白。Gerber等[38]2016年度在美國(guó)開(kāi)展的針對(duì)IDVetScreen?PEDV Indirect Screening test試劑盒的驗(yàn)證試驗(yàn)顯示，該試劑盒的檢測(cè)敏感性 (diagnostic sensitivity,DSe)為73.7% (95% CI=71.5%～79.6%)，檢測(cè)的特異性(diagnostic specificity,DSp)為98.4% (95% CI=96.6%～99.5%)。從Gerber等[38]的驗(yàn)證試驗(yàn)看，基于重組N蛋白的IDVet-ELISA抗體試劑盒監(jiān)測(cè)PEDV感染后生豬的免疫球蛋白的敏感性和特異性數(shù)值區(qū)域分布與其他參評(píng)試驗(yàn)的4個(gè)劑盒差異并不明顯。5個(gè)試劑盒都具有相對(duì)較低的敏感性和表現(xiàn)一般的特異性，從側(cè)面說(shuō)明豬群感染PEDV隱秘性和準(zhǔn)確探測(cè)的難度，同時(shí)也指示出目前應(yīng)用的商用試劑盒開(kāi)展的對(duì)PEDV監(jiān)測(cè)檢測(cè)準(zhǔn)確性都存在一定的不確定性。要準(zhǔn)確推導(dǎo)發(fā)病狀況，利用具有明確驗(yàn)證參數(shù)的檢測(cè)試劑和方法的監(jiān)測(cè)，才可以用以有效推斷特定病原微生物在特定群體中的真實(shí)流行狀況。Gerber等[38]研究已經(jīng)為推斷PEDV流行率提供了非常有價(jià)值的參數(shù)，為較好地描述該試劑盒探測(cè)PEDV抗體數(shù)值準(zhǔn)確程度的變化性和不確定性，基于Gerber等參數(shù)驗(yàn)證的研究和實(shí)驗(yàn)室測(cè)試的感染數(shù)據(jù)，利用Pert (Min,Median,Max)統(tǒng)計(jì)分布來(lái)隨機(jī)表達(dá)該試劑盒的檢測(cè)準(zhǔn)確性(diagnostic sensitivity-DSe、Diagnostic specificity-DSp)參數(shù)分布，此分布參數(shù)涵蓋的數(shù)值區(qū)間的變化性將參與后續(xù)的真流行率的分布估計(jì)和推斷。該試劑盒的Dse和DSp的數(shù)值區(qū)間的統(tǒng)計(jì)分布如圖1所示。

圖1 2019—2020年美國(guó)入境中國(guó)西南陸路口岸豬只的抗體篩查方法的檢測(cè)敏感性與檢測(cè)特異性分布Fig.1 Distribution of the diagnostic sensitivity &diagnostic specificity of antibody screening test used for PEDV detection in Kunming entry port

2.2 美國(guó)豬群2019年P(guān)EDV監(jiān)測(cè)及其先驗(yàn)發(fā)生率

美國(guó)豬病監(jiān)測(cè)包括養(yǎng)殖豬群的SDRS (swine disease reporting system)監(jiān)測(cè)和對(duì)游走的不確定身份豬的監(jiān)視。美國(guó)無(wú)身份游蕩豬群的監(jiān)視主要由美國(guó)動(dòng)植物檢疫局(US Department of Agriculture Animal &Plant Health Inspection Services)野生動(dòng)物研究中心(Wildlife Services National Wildlife Research Center,WSNWR)負(fù)責(zé)系統(tǒng)實(shí)施和開(kāi)展。Bowman等[39]和Scott等[40]的研究認(rèn)為美國(guó)PEDV的發(fā)生是養(yǎng)殖豬群的感染發(fā)生在先，然后傳播擴(kuò)散到了游走的不確定身份豬等其他豬的群體，這一結(jié)論的證據(jù)是游走的不確定身份豬等監(jiān)測(cè)的PEDV陽(yáng)性核酸要比養(yǎng)殖豬群的PEDV陽(yáng)性核酸的出現(xiàn)晚一年以上。針對(duì)現(xiàn)階段美國(guó)游走的不確定身份豬群PEDV的感染狀況，Bevins等[12]采集了大量野豬的血清，并對(duì)其進(jìn)行了PEDV暴露風(fēng)險(xiǎn)和兩次抗體檢測(cè)篩查，結(jié)果推斷美國(guó)游走的不確定身份豬的PEDV血清患病率為0.1% (95%CI=0.03%～0.16%)。美國(guó)豬病監(jiān)測(cè)報(bào)告系統(tǒng)基于PEDV核酸PCR分析[11]顯示，2017—2019年，美國(guó)養(yǎng)殖豬群的PEDV RNA核酸陽(yáng)性檢出隨月份和不同抽檢群體間都具有較明顯差異，其中育肥 (wean to market)階段豬群體中的陽(yáng)性檢出最高，能繁母豬(adult/sow)次之，而其他不確定生長(zhǎng)階段類(lèi)型豬的樣品(unknown)的檢出率最低。2019年9月份為12.98%，母豬場(chǎng)的PEDV檢測(cè)水平為5.24%，11月份為14.19% (415/2 129),12月份陽(yáng)性檢出比例升至15.64% (483/3 089)。2020年1月份PEDV陽(yáng)性病例的百分比較2019年12月份有較大幅度提高，其中明尼蘇達(dá)州和北卡羅來(lái)納州的陽(yáng)性檢出率升幅較為顯著，最高可以達(dá)到25.3%。2020年2—5月，PEDV感染呈現(xiàn)下降態(tài)勢(shì)，考慮到2020年COVID-19在美國(guó)流行狀況的影響，此階段的PEDV陽(yáng)性檢出率下降可能和這段區(qū)間內(nèi)豬群監(jiān)測(cè)的范圍、取樣頻率、樣本選擇和取樣數(shù)量等有一定關(guān)聯(lián)。此外，PEDV陽(yáng)性檢出率還受監(jiān)測(cè)方案中的檢測(cè)方法和試劑選擇的影響。基于免疫應(yīng)答的間接免疫抗體檢測(cè)方法更能有效反映病原感染的真實(shí)發(fā)病率，而PCR的檢測(cè)超高敏感性由于樣品在豬場(chǎng)采集以及實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制的不確定性可能導(dǎo)致出現(xiàn)的大量假陽(yáng)性問(wèn)題也被廣為關(guān)注[41-45]。

2.3 美國(guó)豬群PEDV后驗(yàn)流行率分布推斷

美國(guó)豬群2019年P(guān)EDV監(jiān)測(cè)的先驗(yàn)發(fā)生率顯示，美國(guó)豬群中PEDV感染發(fā)病狀況分布上隨著生豬生產(chǎn)不同階段感染狀況具有時(shí)間差異性和不同地理區(qū)域的空間異質(zhì)性，PEDV在美國(guó)豬群中的感染面廣，且其分布有極大的區(qū)間不確定性，這給區(qū)間生豬移動(dòng)和豬肉貿(mào)易帶來(lái)了巨大的挑戰(zhàn)和安全威脅。根據(jù)中華人民共和國(guó)海關(guān)與出入境檢驗(yàn)檢疫局的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示：2016—2020年，來(lái)自美國(guó)入境我國(guó)口岸的活豬數(shù)量巨大，特別是自2018年8月我國(guó)非洲豬瘟疫情發(fā)生后，國(guó)內(nèi)豬的存欄和種質(zhì)資源減小，豬肉市場(chǎng)受到極大沖擊，美國(guó)入境的豬及其產(chǎn)品數(shù)量會(huì)在近幾年呈現(xiàn)大幅度增加的態(tài)勢(shì)。2019年，來(lái)自美國(guó)South Dakota(Mound City)、Kentucky(Adolphus)、Missouri(Washburn,Montgomery City)等地入境中國(guó)西南陸路口岸的生豬1 930頭份，其中利用ID Screen PEDV Indirect ELISA抗體檢測(cè)試劑盒(ID Screen?PEDV Indirect Screening test (IDvet,Grabels,France)隨機(jī)抽檢開(kāi)展檢疫篩查的184頭份樣品，結(jié)果顯示無(wú)抗體陽(yáng)性樣品檢出?；谶@一批次樣品利用抗體檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)結(jié)果，作為對(duì)美國(guó)豬群PEDV的貝葉斯認(rèn)知更新，利用貝葉斯推斷模型①-②-③來(lái)優(yōu)化美國(guó)豬群PEDV真流行率，推斷結(jié)果顯示PEDV在美國(guó)豬群中的真流行率分布中位值(Median)為0.005 22(95% CI=0.000 424～0.022 5)，如圖2概率密度高度右偏(Positively Skewed &Right Skew)紅色曲線所示，而基于PubMed及美國(guó)豬病檢測(cè)平臺(tái)等科技咨詢的檢出率作為先驗(yàn)信息的流行率中位值為0.065 4(95% CI=0.06～0.07)(圖2藍(lán)色曲線所示)。在對(duì)美國(guó)豬群PEDV發(fā)生率先驗(yàn)分布和口岸實(shí)驗(yàn)室的抗體檢測(cè)方法參數(shù)分布認(rèn)識(shí)的基礎(chǔ)上，利用貝葉斯推斷模型①-②-③，在基于2019年度口岸實(shí)驗(yàn)室對(duì)美國(guó)South Dakota、Kentucky、Missouri等三地入境豬的血清樣品的抗體檢測(cè)結(jié)果更新優(yōu)化基礎(chǔ)上，利用概率密度統(tǒng)計(jì)分布特性可以推斷：美國(guó)豬群的PEDV真流行率最大可能分布主要集中在2.5%百分位數(shù)(P2.5%=0.000 19)與中位數(shù)(P50%=0.005 22)之間(圖2)。概率密度高度正偏的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分布的趨勢(shì)顯示，美國(guó)PEDV真流行率大于0.02的可能性相對(duì)較低，雖然隨機(jī)抽樣群體的PEDV分布值可能會(huì)有小概率(P≤2.5%)溢出分布大于0.03的可能(圖2)?；谪惾~斯統(tǒng)計(jì)推斷和口岸實(shí)驗(yàn)室抗體檢測(cè)結(jié)果優(yōu)化的美國(guó)PEDV真流行率最大可能分布區(qū)間這一統(tǒng)計(jì)特征值將會(huì)作為美國(guó)PEDV疫情發(fā)生狀況更新前，我國(guó)口岸針對(duì)PEDV檢驗(yàn)檢疫抽樣樣品計(jì)算量的最主要依據(jù)。

圖2 貝葉斯推斷的美國(guó)豬群PEDV感染的先驗(yàn)流行率與后驗(yàn)流行率分布Fig.2 Distribution of Bayesian inference on posterior prevalence and prior prevalence of PEDV in US swine population

3 討 論

2013年，PEDV傳入美國(guó) (US PEDV isolate，USA/NC35140/2013)[12],給美國(guó)養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)巨大危害和損失。作為冠狀病毒的PEDV 屬于RNA病毒，具有可變性強(qiáng)、易于發(fā)生突變等的特點(diǎn)。目前研究顯示在美國(guó)豬群中至少存在兩種遺傳上不同的PEDV毒株，即PEDV原型株 (U.S.PEDV prototype strain)和S-INDEL變異株 (S-INDEL-variant strain)[33-36]。

美國(guó)豬群PEDV先驗(yàn)分布的數(shù)據(jù)挖掘顯示，美國(guó)養(yǎng)殖豬群和游走的不確定身份豬的PEDV表觀流行率分布具有極大區(qū)間差異和群間差異。SDRS應(yīng)用PCR的監(jiān)測(cè)顯示[11]：育肥豬的陽(yáng)性率明顯高于能繁母豬和其他豬群，而利用基于N蛋白和S1重組蛋白的免疫抗體ELISA方法篩查的游走豬的PEDV感染率(IgG)較PCR檢測(cè)的養(yǎng)殖豬群的PEDV顯著的低。常規(guī)PCR和實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(rRT-PCR)等分子診斷方法與傳統(tǒng)的其他方法相比被認(rèn)為具有更高的分析敏感性和分析特異性。不同PEDV rRT-PCR的敏感性和特異性雖有差異，但Miller等[41]研究顯示，PEDV rRT-PCR分析敏感性通常可以達(dá)到1個(gè)拷貝的RNA。極高的分析敏感性也就意味著極高概率的污染風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)實(shí)驗(yàn)室生物安全水平、污染控制、樣品處理及其實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)等提出了極高的要求,同時(shí)證據(jù)也顯示，大量rRT-PCR陽(yáng)性樣品在動(dòng)物回歸試驗(yàn)和攻毒試驗(yàn)中不顯示感染性。特別是在用消毒劑處理的PEDV樣品用PCR處理后依然呈現(xiàn)陽(yáng)性，故而研究認(rèn)為對(duì)PCR陽(yáng)性或者弱陽(yáng)性的實(shí)驗(yàn)室結(jié)果的需要謹(jǐn)慎的解釋[41-45]。從這個(gè)角度解釋?zhuān)B(yǎng)殖豬群的PEDV核酸檢測(cè)結(jié)果可能會(huì)存在有部分陽(yáng)性樣品為假陽(yáng)性結(jié)果。

2019年，來(lái)自美國(guó)South Dakota等三州入境中國(guó)西南陸路口岸的生豬，利用IDVet抗體檢測(cè)試劑盒(ID Screen?PEDV Indirect Screening test (IDvet,Grabels,France)檢疫篩查的184頭份樣品，無(wú)抗體陽(yáng)性樣品檢出。基于這一批次樣品抗體檢測(cè)結(jié)果，作為對(duì)美國(guó)豬群PEDV流行率的貝葉斯認(rèn)知更新，利用貝葉斯推斷模型①-②-③來(lái)優(yōu)化美國(guó)豬群PEDV真流行率，推斷結(jié)果顯示PEDV在美國(guó)豬群中的真流行率中位值(Median)為0.005 22(95% CI=0.000 424～0.022 5)(圖2)?；诤篁?yàn)分布流行率的概率密度呈現(xiàn)高度右偏(Positive Skew)的統(tǒng)計(jì)特征，推斷美國(guó)豬群的PEDV真流行率最大可能分布值主要集中在2.5%百分位數(shù)(P2.5%=0.000 19)與中位數(shù)(P50%=0.005 22)之間區(qū)域，95%的高置信上限(UCL)的流行率分布為3%。統(tǒng)計(jì)概率密度高度正偏(圖2)的分布數(shù)據(jù)也提示：美國(guó)PEDV真流行率大于0.02的可能性相對(duì)較低，雖然局部地區(qū)隨機(jī)抽樣群體的PEDV分布值可能會(huì)有小概率溢出分布大于0.03的可能(P≤2.5%)。這一估計(jì)值與美國(guó)WSNWR Bevins等[12]基于2012—2015年度間大樣本(n=7 997)利用高特異性(DSp=100%)和高敏感性(DSe=88%)的基于S1重組蛋白ELISA方法監(jiān)測(cè)結(jié)果推斷的PEDV在游走豬群體中95% UCL-高置信上限保持一致 (online Technical Appendix Tables 1,2,https://wwwnc.cdc.gov/EID/article/24/7/17-2077-Techapp1.pdf)。

利用貝葉斯統(tǒng)計(jì)方法推斷，在先驗(yàn)信息挖掘的基礎(chǔ)上，結(jié)合口岸實(shí)驗(yàn)室抗體檢測(cè)結(jié)果，優(yōu)化對(duì)美國(guó)PEDV真流行率的估計(jì)，對(duì)認(rèn)識(shí)和了解美國(guó)豬群感染PEDV狀況及對(duì)來(lái)自美國(guó)的生豬入境我國(guó)口岸的檢疫監(jiān)管、風(fēng)險(xiǎn)管控和風(fēng)險(xiǎn)決策具有突破性的技術(shù)意義。流行率是公共衛(wèi)生和動(dòng)物衛(wèi)生健康應(yīng)對(duì)傳染病流行認(rèn)知最為基本和關(guān)鍵的指標(biāo)，同時(shí)其也是后續(xù)風(fēng)險(xiǎn)干預(yù)、風(fēng)險(xiǎn)管理和風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)的基礎(chǔ)指標(biāo)。流行率通常有表觀流行率和真流行率之分。表觀流行率最為常見(jiàn)，是檢測(cè)陽(yáng)性數(shù)量與檢測(cè)樣本量的比率，其以假定檢測(cè)方法為金標(biāo)準(zhǔn)，以100%準(zhǔn)確性(100% DSe,100% DSp,100% 重復(fù)率等)為假設(shè)。但在實(shí)際場(chǎng)景中，金標(biāo)的方法雖然可能存在，但其適用范圍和場(chǎng)景非常有限，或者僅在試劑比對(duì)和驗(yàn)證中應(yīng)用。在常規(guī)監(jiān)測(cè)檢測(cè)中所應(yīng)用的方法很少可以或者基本無(wú)法達(dá)到金標(biāo)的要求。檢測(cè)總是會(huì)有錯(cuò)誤率和不確定性，假陰性和假陽(yáng)性結(jié)果總是會(huì)與檢測(cè)結(jié)果相伴隨。故而在很多情景下，表觀流行率給我們提供的咨詢雖然有一定意義，但也可能是一種直觀的誤導(dǎo)。如以口岸實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果的表觀流行率來(lái)比較，口岸利用抗體檢測(cè)試劑盒的陽(yáng)性檢出數(shù)量為0，其表觀流行率為0，直觀的解釋是此次入境的動(dòng)物100%不存在PEDV感染或者不攜帶PEDV病原微生物。但考慮到檢測(cè)方法的檢測(cè)敏感性和檢測(cè)特異性不可能同時(shí)達(dá)到100%[10,25,27]，這種推斷顯然是不符合常識(shí)和實(shí)際。

與表觀流行率相對(duì)應(yīng)的是真流行率，對(duì)真流行率的認(rèn)識(shí)是傳染病控制和預(yù)防的基礎(chǔ)。真流行率表達(dá)的是在特定測(cè)試條件下對(duì)某種疫病在群體中流行狀況的認(rèn)識(shí)。由于生物機(jī)體、致病微生物及健康的復(fù)雜性，群體中特定疫病發(fā)生的真流行率數(shù)值通常很難獲取，但貝葉斯統(tǒng)計(jì)推斷為人們提供了一種思路和解決方案，即后驗(yàn)分布可以無(wú)限逼近這一分布?；趯?duì)先驗(yàn)信息的認(rèn)知，在后驗(yàn)信息如最新實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)數(shù)據(jù)和結(jié)果更新的基礎(chǔ)上，利用統(tǒng)計(jì)推斷方法不斷提高和優(yōu)化對(duì)真實(shí)發(fā)病率的認(rèn)識(shí)，這就是本文推導(dǎo)美國(guó)PEDV真實(shí)發(fā)病率的思路。在本研究如圖2的概率密度分布顯示，貝葉斯優(yōu)化后的后驗(yàn)概率分布的中位值(紅色曲線)，即美國(guó)PEDV真流行率最可能值0.005 22(95% CI=0.000 424～0.022 5)與先驗(yàn)分布的統(tǒng)計(jì)中位值(藍(lán)色曲線)0.065 4(95% CI=0.06～0.07)存在多達(dá)十多倍以上的數(shù)值差距?？梢悦黠@看出，先驗(yàn)分布的流行率認(rèn)識(shí)要明顯高于后驗(yàn)分布的流行率，其基本假設(shè)是檢測(cè)所用試劑的完全理想化以及假定檢測(cè)方法具有100%的臨床檢測(cè)敏感性DSe和100%臨床檢測(cè)特異性DSp的準(zhǔn)確度。PEDV自2013年在美國(guó)出現(xiàn)US PEDV分離株USA/NC35140/2013后，很快鑒定出原型毒株(US PEDV Protoype)和變異毒株(S INDEL)，此后報(bào)道的PC177以及2014年Marthaler 等[36-37]分離到的可能的第三毒株 Minnesota188?？紤]到目前的血清學(xué)方法和檢測(cè)試劑如IFA、VN、WV-ELISA、S1-ELISA、N-ELISA等都是基于美國(guó)原型毒株(US PEDV Protoype)設(shè)計(jì)[37]的，故而在美國(guó)豬群中PEDV毒株分布存在多樣性的條件下，利用現(xiàn)有試劑達(dá)到100%準(zhǔn)確性，在理論上是不具有操作性和可能性的。

PEDV真流行率分布受到PEDV病原微生物學(xué)特性、流行毒株分布類(lèi)型、樣品抽檢類(lèi)型與方法、樣品處理技術(shù)、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)、試劑盒檢測(cè)準(zhǔn)確性等一系列環(huán)境和質(zhì)量控制等因素綜合決定的，故而具有一定的不確定性。由于生物遺傳多樣性和環(huán)境變量控制的難度，特定疫病在特定群體中的流行率分布具有不確定性是一種客觀存在。對(duì)于PEDV，其流行毒株多、進(jìn)化變異快、且其宿主數(shù)量分布廣，加之小樣本監(jiān)測(cè)、抽樣檢測(cè)及實(shí)驗(yàn)室等環(huán)境控制的隨機(jī)性和不確定性，其真流行率具有較大的區(qū)間變化和時(shí)間變化，為降低這種不確定性，其真流行率分布可以通過(guò)大量先驗(yàn)信息的挖掘和基于更新數(shù)據(jù)的實(shí)驗(yàn)室基于N蛋白ELISA的抗體檢測(cè)篩查，以優(yōu)化和統(tǒng)計(jì)迫近我們對(duì)美國(guó)豬群的PEDV真流行率統(tǒng)計(jì)分布的認(rèn)識(shí)，特別是更新信息的大樣本數(shù)量可以為統(tǒng)計(jì)置信分布和決策提供大概率的統(tǒng)計(jì)認(rèn)知和確信度，從而降低對(duì)美國(guó)豬群PEDV流行率分布估計(jì)的不確定性認(rèn)識(shí)。

真流行率分布的認(rèn)識(shí)對(duì)口岸檢測(cè)檢疫和風(fēng)險(xiǎn)決策管理具有重要意義，可以為實(shí)現(xiàn)口岸風(fēng)險(xiǎn)量化管理和風(fēng)險(xiǎn)決策，減小和降低特定病原微生物傳入的風(fēng)險(xiǎn)不確定性提供操作的可能性和可行性。如以此次PEDV口岸篩查為例，如以先驗(yàn)分布的流行率為基準(zhǔn)，計(jì)算檢測(cè)檢疫抽樣量，會(huì)存在顯著的缺陷。其一是基于先驗(yàn)分布流行率模擬計(jì)算出的抽取至少一頭份陽(yáng)性動(dòng)物的抽樣量會(huì)顯著的降低十多倍以上。其二是以錯(cuò)誤的流行率抽取的動(dòng)物數(shù)量的降低，也會(huì)顯著的增加該種病毒越過(guò)國(guó)界和檢疫口岸，導(dǎo)致傳入內(nèi)地的風(fēng)險(xiǎn)不確定顯著增加。而基于后驗(yàn)貝葉斯推斷的流行率估計(jì)的最大可能值計(jì)算的口岸抽樣數(shù)量，將會(huì)在現(xiàn)有研究認(rèn)知基礎(chǔ)上最大程度確定需要隨機(jī)抽檢的數(shù)量和存在的可能入境不確定性，從而降低在特定階段來(lái)自美國(guó)入境的活豬攜帶PEDV病原的可能性。

此外，在口岸檢疫篩查的方法、試劑選擇和鑒別準(zhǔn)確性方面，因?yàn)槟壳癙EDV ELISA抗體檢測(cè)的方法是基于美國(guó)PEDV分離株(USA /NC35140 /2013)設(shè)計(jì)，其可以探測(cè)樣品中是否有當(dāng)前美國(guó)PEDV流行毒株 (PEDV Protoype &S INDEL)的IgA和IgG的存在，但其對(duì)同屬于α冠狀病毒的TGEV沒(méi)有有效的鑒別篩查能力，因?yàn)樽C據(jù)顯示TGEV會(huì)對(duì)PEDV的ELISA抗體檢測(cè)有較為明顯的干擾和交叉反應(yīng)，而對(duì)豬的其他冠狀病毒如PRCoV和DeltaCoV不產(chǎn)生干擾[12]。Bevins等[12]對(duì)美國(guó)野豬的PEDV初篩試驗(yàn)和利用基于S1蛋白的ELISA復(fù)核試驗(yàn)驗(yàn)證了這一點(diǎn)，其中在7 997份野豬樣本中，253份經(jīng)PEDV-ELISA初篩呈抗體陽(yáng)性，然后對(duì)這253份樣本利用基于特異性S1重組蛋白ELISA方法進(jìn)行復(fù)篩，發(fā)現(xiàn)其中8份被確認(rèn)為PEDV抗體陽(yáng)性，另外兩個(gè)樣本被認(rèn)為是疑似陽(yáng)性，而其余243份陽(yáng)性樣本被認(rèn)為是TGEV。PEDV和TGEV同屬α冠狀病毒(圖3)，其對(duì)我國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生健康和公共衛(wèi)生安全都具有潛在威脅，為進(jìn)一步明確和降低來(lái)自美國(guó)的α冠狀病毒入境我國(guó)風(fēng)險(xiǎn)，故而建議目前口岸首先使用基于N蛋白的ELISA抗體作為初篩，然后以基于S1重組蛋白ELISA抗體篩查作為復(fù)篩，來(lái)提高口岸對(duì)來(lái)自美國(guó)豬的α冠狀病毒入境我國(guó)的風(fēng)險(xiǎn)認(rèn)知、管控和鑒別能力。

冠狀病毒科4個(gè)屬(圖3)中的α冠狀病毒和β冠狀病毒對(duì)哺乳動(dòng)物危害極大。豬感染冠狀病毒對(duì)公共衛(wèi)生的不確定性風(fēng)險(xiǎn)隨著近期Sars-CoV-2(COVID-19)全球流行越來(lái)越被廣泛關(guān)注。作為歸屬于豬的冠狀病毒，雖然PEDV、TGEV、PRCV、SADS-CoV和PDCoV等引起豬的傳染性腸道和呼吸道感染并導(dǎo)致大量死亡，但其在人群流行的冠狀病毒的形成和病毒演化中的影響和風(fēng)險(xiǎn)尚不明確[7]?？诎稒z疫檢測(cè)是抵御外來(lái)入侵疫病傳入的最后一道防線，故而來(lái)自異域可能出現(xiàn)的新的冠狀病毒毒株給我國(guó)口岸監(jiān)測(cè)、檢疫監(jiān)管帶來(lái)了巨大技術(shù)挑戰(zhàn)，利用貝葉斯統(tǒng)計(jì)推斷，結(jié)合選擇具有高度特異性和敏感性的口岸篩查試劑和方法，以實(shí)時(shí)更新的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)咨詢?yōu)橹R(shí)更新，適時(shí)優(yōu)化口岸檢測(cè)抽樣，對(duì)強(qiáng)化我國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生和公共衛(wèi)生安全，降低潛在入侵畜禽疫病傳入風(fēng)險(xiǎn)具有突破性的意義。

該亞科的病毒分為4個(gè)屬：α冠狀病毒(紫色)、β冠狀病毒(粉色)、γ冠狀病毒(綠色)和δ冠狀病毒(藍(lán)色),系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)是基于已發(fā)表的管狀病毒進(jìn)化樹(shù)[7,46-48]The viruses in this subfamily group into four genera (prototype or representative strains shown):Alphacoronavirus (purple),Betacoronavirus (pink),Gammacoronavirus (green)and Deltacoronavirus (blue).Classic subgroup clusters are labelled 1a and 1b for the alphacoronaviruses and 2a-2d for the betacoronaviruses.The tree is based on published trees of Coronavirinae [7,46-48]圖3 冠狀病毒亞科系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系Fig.3 Phylogenetic relationships in the Coronavirinae subfamily

4 結(jié) 論

PEDV可引起仔豬的高死亡率，對(duì)豬的健康生長(zhǎng)以及動(dòng)物衛(wèi)生和公共衛(wèi)生的暴露風(fēng)險(xiǎn)不確定性高，潛在危害大。目前，美國(guó)豬群中至少存在兩種遺傳上不同的PEDV毒株——PEDV原型株U.S.PEDV prototype strain 和S-INDEL變異株S-INDEL-variant strain。本文基于對(duì)美國(guó)PEDV流行毒株監(jiān)測(cè)及先驗(yàn)信息挖掘，利用貝葉斯統(tǒng)計(jì)推斷，結(jié)合選擇具有高度特異性和敏感性的口岸篩查試劑和方法，以更新的實(shí)驗(yàn)室篩查檢測(cè)咨詢?yōu)橹R(shí)更新，推斷美國(guó)豬群PEDV發(fā)生的真流行率，以期為現(xiàn)階段美國(guó)生豬入境我國(guó)的口岸檢驗(yàn)檢疫、監(jiān)測(cè)抽樣提供基于科學(xué)證據(jù)的風(fēng)險(xiǎn)決策技術(shù)支撐。分析結(jié)果顯示，PEDV在美國(guó)豬群中的真流行率分布中位值為0.005 22(95% CI=0.000 424～0.022 5)，95%的高置信上限的流行率分布為3%，高度右偏的統(tǒng)計(jì)分布推斷美國(guó)豬群當(dāng)前的PEDV真流行率最大可能分布主要集中在2.5%百分位數(shù)(P2.5%=0.000 2)與中位數(shù)(P50%=0.005 22)之間。概率密度高度正偏的數(shù)據(jù)分布趨勢(shì)顯示，美國(guó)PEDV真流行率大于0.02的可能性相對(duì)較低,雖然在美國(guó)不同地理空間中，隨機(jī)豬群PEDV真流行率分布值可能會(huì)存在有小概率溢出分布大于0.03(P≤2.5%)的可能?？诎稒z疫與監(jiān)測(cè)是抵御外來(lái)入侵疫病傳入的最后一道防線，在現(xiàn)階段口岸篩查的試劑選擇方面，建議口岸首先使用基于N蛋白的ELISA抗體作為初篩方法，然后以基于S1重組蛋白ELISA抗體篩查作為復(fù)篩方法，來(lái)提高口岸對(duì)來(lái)自美國(guó)入境生豬的α冠狀病毒潛在侵入我國(guó)的風(fēng)險(xiǎn)認(rèn)知、管控和鑒別能力。基于口岸實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果優(yōu)化的貝葉斯統(tǒng)計(jì)推斷方法可以為在現(xiàn)有知識(shí)和認(rèn)知基礎(chǔ)上，最大程度阻斷來(lái)自異域病原微生物入侵提供監(jiān)測(cè)技術(shù)支持，對(duì)口岸檢驗(yàn)檢疫、抽樣監(jiān)測(cè)、風(fēng)險(xiǎn)管控和通關(guān)決策具有現(xiàn)實(shí)和突破性的意義。