方軻　沈敬華

摘要：單克隆抗體的應用是一項迅速發(fā)展的技術。本文闡述了單克隆抗體制備前雜交瘤細胞的培養(yǎng)條件和應用，包括細胞的培養(yǎng)、培養(yǎng)基的選擇，融合時期的選擇，從而指導和優(yōu)化實驗室中雜交瘤的培養(yǎng)，促進融合細胞的融合率和后繼單克隆抗體篩選實驗的順利進行。

關鍵詞：雜交瘤；細胞培養(yǎng)；單克隆抗體

隨著雜交瘤細胞株不斷的建立和生產(chǎn)單克隆抗體的日益廣泛應用，雜交瘤細胞的培養(yǎng)和優(yōu)化不斷得到改善，但是國內實驗室設備和條件有限，多數(shù)的單克隆抗體的篩選還是應用基礎的免疫抗原包被，結合Elisa方法聯(lián)合有限稀釋法來篩選單克隆抗體。為了獲得特異性較強的雜交瘤細胞株，融合前后細胞的培養(yǎng)以及雜交瘤的培養(yǎng)和儲存，仍是基礎實驗室中必須注意和重視的技術。

1雜交瘤的起源和生產(chǎn)

1.1雜交瘤所用的骨髓瘤細胞系 1966年Petingel等在體外培養(yǎng)小鼠漿細胞成功。Milstein等1972年由P3中用20μg 8-氮雜鳥嘌呤（8-azaguanine）篩選出缺乏次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶（HGPRT）的新細胞系，稱之為P3-X63-Ag8。由于X63本身分泌IgG1，形成的雜交瘤除分泌B細胞的特異性抗體外，同時分泌X63產(chǎn)生的抗體，因其抗體不純，現(xiàn)多改用不分泌型骨髓瘤細胞系。國內現(xiàn)已引進NS-1，SP2/0，F(xiàn)O，X63-Ag8-653等小鼠骨髓瘤細胞系。最常使用的是SP2/0及NS-1[1]。

1.2人骨髓瘤細胞系 為產(chǎn)生穩(wěn)定的人免疫球蛋白的雜交瘤，需要人的缺某種酶的骨髓瘤細胞系。國外已篩選了一些人骨髓瘤細胞，但融合率不高，還沒有推廣使用。目前人一人雜交瘤技術仍存在著雜交瘤在不同培養(yǎng)基中的生長速度問題。細胞生長緩慢，抗體分泌力弱及效價較低，且難于克隆化等困難[2]，限制了人骨髓瘤細胞的應用。

1.3淋巴細胞和骨髓瘤細胞的關系 B淋巴細胞容易與漿細胞瘤融合，而T細胞則需要同胸腺淋巴肉瘤融合（Kohler， et al. 1977；Schwaber， 1977）。脾臟是大量T或B細胞的來源，與小鼠骨髓瘤細胞融合時，最常用的是小鼠的脾細胞。按照Burnet的細胞系選擇學說，一個B淋巴細胞只能產(chǎn)生一種抗體，其"后代"也只能產(chǎn)生此種抗體，因為抗體是由DNA上的基因所決定，基因是可以遺傳的。在正常情況下，小鼠脾中含有能產(chǎn)生各種不同抗體的B細胞，一只純種小鼠體內可有（1～5）×107種不同的抗體，即有（1～5）×107種不同的B細胞。為了提高獲得某種雜交瘤的機會，就需要設法增加小鼠體內分泌該種抗體的B細胞的數(shù)量。最常用的方法是用特定抗原多次免疫小鼠，使之產(chǎn)生特異性抗體。通過將免疫小鼠的脾細胞和小鼠骨髓瘤細胞的融合，然后經(jīng)過多次篩選，從而得到特異性的雜交瘤細胞。這樣所獲得的特異性的雜交瘤細胞在既具有脾細胞分泌抗體的能力的同時，又具有小鼠骨髓瘤細胞永生的特性，從而可以無限制地提供結構與性質完全相同的單克隆抗體[3]。

1.4生產(chǎn) 人用鼠源的單抗的生產(chǎn)方法分為體內法和體外法2種。體內法即腹水法，腹水中抗體濃度高，可達2～10mg/ml。我國對體內法生產(chǎn)的人用鼠源單克隆抗體的質檢項目繁多，要求嚴格，打腹水的BALB/c小鼠必須達到SPF（Specific Pathogen Free無特定病原體級實驗動物級）的要求，其飼養(yǎng)，繁殖和生產(chǎn)腹水以及純化抗體的廠房也必須符合GMP（Good Manufacturing Practice良好的生產(chǎn)質量管理規(guī)范），限制了體內法在人用鼠源單抗生產(chǎn)領域的應用；單抗的體外生產(chǎn)方法是通過雜交瘤細胞的體外培養(yǎng)法，它的特點是生產(chǎn)的產(chǎn)品純度高，避免了鼠類病毒的污染，質檢項目方面有很大的簡化，可推廣用于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)，是人用鼠源單抗生產(chǎn)方式的主要發(fā)展方向[4]。

2融合細胞實驗，雜交瘤細胞培養(yǎng)和保存注意事項

2.1單克隆抗體制備時SP2/0細胞復蘇和融合時間 融合前SP2/0需要提前1w復蘇，因為在融合前可以發(fā)生細胞反復傳代導致細胞生長活性下降，或是因為細胞活力的問題或是污染問題而被迫推遲細胞融合時間，所以融合前小鼠的加強時間一定要是在細胞傳代后，確認細胞沒有問題再進行小鼠的加強免疫。通常小鼠加強免疫后第4d（包括免疫的當天），進行細胞融合，可以取得更高的融合率。不分泌抗體的特異性B淋巴母細胞是B細胞與骨髓瘤細胞進行融合的最適時期。最后一次免疫2～4d后，脾內特異性B細胞大量增殖時進行融合，可得較多的雜交瘤。

筆者進行觀察后，發(fā)現(xiàn)骨髓瘤細胞在復蘇后培養(yǎng)第2代的時候可以進入細胞的旺盛生長期，在這個時期進行細胞的融合可以提高雜交瘤細胞的融合率，注意進行融合前一天必須進行一次細胞的換液。

2.2關于培養(yǎng)液的配置 雜交瘤細胞的培養(yǎng)液采用的是10～20%胎牛血清添加至DME或RPMI-1640中作為基礎的培養(yǎng)液。因為血清之間質量差異甚大，影響試驗結果穩(wěn)定性，常需多次篩選，在篩選穩(wěn)定后，應采用統(tǒng)一批次的血清和培養(yǎng)液進行細胞融合，從而避免血清和培養(yǎng)液的問題導致的試驗結果不穩(wěn)定。筆者曾碰到過因為更換培養(yǎng)液而導致融合細胞后雜交瘤細胞大量死亡的事故。實驗過程中此類問題應該盡量避免。

2.3關于培養(yǎng) 動物細胞在體外增殖的方式可以分為兩種：一種是在培養(yǎng)液中自由懸浮生長的懸浮細胞；另外一種是貼附在固相基質表面生長的貼壁細胞（ADC，Anchoragedepen-dentcen）。雜交瘤細胞系是由骨髓瘤細胞與免疫動物的脾細胞融合形成的，不是一種嚴格的ADC細胞。不同的細胞系，細胞之間的貼壁依賴性有較大差異[5]。雜交瘤細胞是半懸浮細胞，更換培養(yǎng)液時只需要每次更換反應器中培養(yǎng)液體積的3/4即可，保持剩余培養(yǎng)液中的細胞作為種子，可以維持反復培養(yǎng)， 減少雜交瘤細胞因受到培養(yǎng)環(huán)境變化帶來的生理影響，保證細胞活性，同時擴大培養(yǎng)的時候也可將漂浮的部分細胞繼續(xù)單獨培養(yǎng)。

2.4關于傳代 擴大培養(yǎng)時避免用1ml的加樣槍吹吸細胞，這樣可以避免細胞由于強烈的吹打導致細胞的破碎和碎裂。盡量采取無損傷1.5ml的玻璃吸管吹打和傳代，可以減少細胞在傳代時導致的機械性損傷。

2.5關于飼養(yǎng)層細胞 飼養(yǎng)層細胞（小鼠腹腔滲出細胞）的加入有助于促進雜交瘤的生長并可以增加雜交瘤的產(chǎn)量。飼養(yǎng)細胞可以是成纖維細胞，胸腺或脾臟淋巴細胞，但常用的是從同系健康小鼠腹腔中收集的腹腔滲出細胞，主要是巨噬細胞。

2.6關于凍存溫度 細胞凍存的過程要經(jīng)歷液體溶液的固化和水分子通過細胞膜的滲透過程，凍存細胞的溶液一旦形成冰晶，高滲透壓的環(huán)境會導致細胞內外環(huán)境的改變，會增加防凍劑對細胞毒性造成細胞的損傷。這是由于細胞內形成冰晶促使電解質濃度升高引起細胞脫水而使細胞失活。當凍存的降溫速率過快或復溫速度過慢，都會使細胞內形成冰晶，導致細胞的損傷和死亡。通常溫度越低，酶活力也越低，細胞新陳代謝也隨著降低，保存時間相對延長。

傳統(tǒng)的細胞凍存有程序性的降溫液氮凍存法和非程序性的降溫液氮凍存法。程序性降溫液氮凍存法需要購置專用儀器，優(yōu)點是溫度控制較好，對細胞損傷小，有條件的實驗室應考慮首選該法；缺點是操作步驟復雜費時，再加上成本昂貴，普及困難。

本實驗室，采用的是在添加10%比例的DMSO保護劑后，將細胞懸掛于液氮罐和液氮之間，距離液氮平面大于15cm，2～3h后放入液氮凍存或隔夜放入液氮凍存，都可以保證良好的細胞凍存效果；雜交瘤細胞和sp2/0細胞凍存液里的血清濃度保持在20%的比例。凍存時選擇培養(yǎng)處于對數(shù)生長期的細胞，在收集細胞前一天換新鮮培養(yǎng)液，第二天收集細胞凍存[6]。凍存液中血清含量不應低于20%，最高可用90%的血清和10%的二甲亞砜混合的凍存液。血清濃度越高，凍存效果越好[7]。

3結論

盡管雜交瘤細胞大量培養(yǎng)和單克隆抗體制備的研究方面已經(jīng)取得很大進展，但由于設備條件和技術的限制，國內各實驗室大部分仍然是以少量培養(yǎng)和制備為主，還存在著很多優(yōu)化和改善的空間，以增加后期實驗單克隆抗體制備的成功率，從而使單克隆抗體的制備得到更廣泛的應用。

參考文獻：

[1]方福德.現(xiàn)代醫(yī)學實驗技巧全書[M].下冊.北京大學醫(yī)學出版社，1999：06.

[2]James K and Bell GT[J]. J Immunol Methods，1987，100：5.

[3]董志偉，王琰.抗體工程[M].第二版.北京大學出版，2002：54.

[4]王祥斌，孔健.體外培養(yǎng)雜交瘤細胞生產(chǎn)人用鼠源單克隆抗體[J].中國生物制品學雜志，2002，15（5）：315.

[5]汪美先，辛顏彬，薛小平，等.雜交瘤細胞體外大量培養(yǎng)研究的進展[J].細胞與分子免疫學雜志，1990（02）：63-67.

[6]馮樂平，劉志國.基因工程試驗教程[M].第一版.科學出版社，2013：90.

[7]張贇，溫偉紅.細胞核分子免疫學實用實驗技術[M].第一版.第四軍醫(yī)大學出版社，2013：16.

編輯/申磊