陳 哲，陳 蓉，閆樂艷，陳佳彬，于建寧*

(1.江蘇省農業(yè)科學院畜牧研究所，南京 210014；2.泰州市金鵬鵝業(yè)專業(yè)合作社，泰州 225319)

肌肉的發(fā)育過程包括衛(wèi)星細胞的激活，成肌細胞的生成、分化和融合，以及多核肌纖維的形成等。研究顯示，生肌調節(jié)因子(myogenic regulatory factors,MRFs)家族是肌纖維生長發(fā)育的重要調控基因，該家族基因表達沉默將導致生肌節(jié)形成失敗，最終無法形成肌肉[1]。肌細胞生成素(myogenin，MyoG)基因是MRFs家族的重要成員，在促進成肌細胞增殖和融合為多核肌細胞過程中起著重要的作用，是唯一不可替代的成肌調節(jié)因子[2]，同時，MyoG還與家族內其他成員相互作用，共同調節(jié)畜禽產肉量和肉質性狀[3]。雞和鴨MyoG基因存在多處SNPs位點，并且與肉質性狀和屠宰性狀顯著相關[4-5]，說明MyoG基因是家禽肌肉發(fā)育的重要候選基因。

MyoG基因的轉錄和表達受到多種因素的影響，如營養(yǎng)水平、運動等外部環(huán)境因素[6-7]和組蛋白脫乙?；?HDAC)、乙酰膽堿(Ach)等神經遞質[8-9]以及激素[10-11]等多種方式。此外，表觀遺傳修飾研究發(fā)現(xiàn)，鴨MyoG基因啟動子區(qū)CpG島通過甲基化修飾影響基因在腿肌中的轉錄[12]。研究基因啟動子結構可以更深入了解MyoG的表達調控機制，目前多個物種MyoG基因啟動子已經被成功克隆，轉錄調控機制研究取得一定進展，發(fā)現(xiàn)多個轉錄因子如MZF1、CdxA、E-box等可能參與MyoG啟動子調控[3,13-14]。然而，鵝MyoG基因轉錄調控機制目前尚未見報道。

鵝肉具有高蛋白、低脂肪的優(yōu)點，而且富含不飽和脂肪酸，近年來的消費量穩(wěn)步上漲，鵝的肌肉發(fā)育調控值得深入研究。本研究擬克隆鵝MyoG基因的啟動子片段，初步預測啟動子區(qū)轉錄因子結合位點，擴增啟動子系列缺失片段，對轉錄因子進行定點突變，應用雙熒光素酶檢測方法確定調控鵝MyoG基因轉錄調控的關鍵元件，為進一步探索MyoG基因對鵝肌肉發(fā)育的調控機理提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

70日齡泰州鵝胸肌、腿肌、心、肝、脾、肺、腎和下丘腦8種組織樣品由本實驗室保存。

Tks GflexTMDNA Polymerase、T4 DNA連接酶、pMD19-T載體、DH5α感受態(tài)細胞和瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自TaKaRa公司；限制性內切酶NheⅠ、BglⅡ購自美國NEB公司；DNA提取試劑盒、無內毒素質粒小量提取試劑盒購自鼎國生物公司；熒光素酶報告質粒pGL3-Enhancer、pRL-TK、pGL3-basic以及雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自Promega公司；DNA Marker購自上海生工；Mut Express?II Fast Mutagenesis Kit V2定點突變試劑盒購自Vazyme公司；胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、Opti-MEM培養(yǎng)基和Lipofectamine LTX購自Thermo Fisher Science公司(美國)；人胚腎細胞(C2C12)由本實驗室保存。

1.2 鵝MyoG基因5′側翼區(qū)片段擴增

以泰州鵝腿肌DNA為模板，已知鵝MyoG基因部分序列(GenBank No:DQ294735.1)，根據(jù)同源鴨(Anasplatyrhynchos)MyoG基因編碼區(qū)(GenBank No:NW_004676592.1)和啟動子區(qū)(GenBank No:KX981598)序列信息，設計引物M0F/R擴增基因上游預測序列獲得M0片段。生物信息學分析確定M0序列正確且包含啟動子片段后，以M0序列為模板設計4條上游引物(M1F、M2F、M3F、M4F)遞減擴增啟動子區(qū)片段(引物序列見表1)。對所有上游引物引入NheⅠ限制性酶切位點及保護堿基，下游引物引入BglⅡ酶切位點及對應的保護堿基，引物由上海生工合成。PCR擴增體系為50 μL:1 μL Tks Gflex DNA Polymerase，22 μL ddH2O，25 μL 2×Gflx PCR Buffer，1 μL DNA模板，上下游引物各0.5 μL。PCR反應條件：98 ℃預變性5 min；98 ℃ 變性10 s，退火溫度退火15 s，68 ℃延伸3 min，共30個循環(huán)；68 ℃最終延伸10 min，9 ℃保存。擴增產物通過1.5%凝膠電泳檢測，產物回收純化后連接到pMD19-T載體上，重組質粒經NheⅠ和BglⅡ酶切鑒定正確后，送上海生工測序。

表1 擴增鵝MyoG基因啟動子序列的引物Table 1 Primers for amplifying promoter prediction sequence of goose MyoG gene

1.3 鵝MyoG基因5′側翼序列生物信息學分析

利用在線數(shù)據(jù)庫GPminer(http://gpminer.mbc.nctu.edu.tw/index.php)對擴增產物M0序列進行轉錄起始位點、TATA-box、CAAT-box和GC-box位點等預測。使用Signal Scan(http://http://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/signal)和JASPAR數(shù)據(jù)庫(http://jaspar.genereg.net/)對核心啟動子區(qū)內潛在轉錄因子結合位點進行預測。利用DNAstar軟件中Megalign程序進行序列同源性比對。

1.4 鵝MyoG報告基因載體構建及鑒定

將PCR擴增得到的遞減長度的鵝MyoG基因啟動子片段進行NheⅠ和BglⅡ雙酶切，經凝膠回收、T4 DNA連接酶連接后，定向克隆到同樣雙酶切的pGL3-Enhancer載體中，連接產物轉化DH5α感受態(tài)細胞，挑選陽性單克隆菌落，進一步測序鑒定。利用NheⅠ和BglⅡ雙酶切和測序驗證，篩選構建正確的鵝MyoG基因pGL3-MyoG(-1 114～+37)、pGL3-MyoG(-774～+37)、pGL3-MyoG(-624～+37)和pGL3-MyoG(-154～+37)重組雙熒光素酶報告基因質粒。

1.5 鵝MyoG基因突變位點報告基因載體的構建

根據(jù)啟動子活性檢測結果，本試驗運用在線軟件對啟動子核心區(qū)潛在的轉錄因子結合位點進行了預測，relative profile score 閾值設定為0.95，總共篩選出3個轉錄因子結合位點：HNF4(-521～-503 bp)、USF(-379～-370 bp)和E2(-296～-281 bp)。利用點突變技術對3個轉錄因子結合位點進行敲除，設計并合成轉錄因子結合位點缺失的引物，引物序列見表1。以HNF4位點突變試驗為例，以pGL3-MyoG(-624～+37)質粒為模板，Mut1-HNF4-F/Mut1-HNF4-R為引物，PCR擴增整個質粒，擴增完成后，回收擴增片段，加入DpnI酶，去除模板質粒，再次回收，回收產物加T4 DNA連接酶連接，轉化大腸桿菌，涂布平板，過夜培養(yǎng)，挑取單克隆，提取質粒進行雙酶切驗證后測序鑒定。構建突變位點報告基因載體，分別命名為pGL3-HNF4-MyoG、pGL3-USF-MyoG和pGL3-E2-MyoG。

1.6 鵝MyoG和USF基因組織表達分析

以β-actin為內參基因，熒光定量PCR檢測泰州鵝胸肌、腿肌、心、肝、脾、肺、腎、下丘腦8種組織中MyoG和USF的表達情況，定量引物見表2。每個樣品重復3次。

表2 熒光定量引物Table 2 Primers for fluorescence quantitative detection

1.7 細胞培養(yǎng)、轉染和酶活測定

接種C2C12細胞于96孔板，添加DMEM/F12培養(yǎng)液(含有10%胎牛血清、0.10 μL·L-1卡那霉素、0.10 μL·L-1氨芐霉素)，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，當細胞生長至匯合率70%～80%時，將構建的重組雙熒光素酶報告載體采用脂質體Lipo LTX轉染到以上細胞內，作為試驗組，同時轉染pGL3-basic為陰性對照組，pRL-TK為內參質粒，試驗重復3次，每組3個平行試驗。質粒瞬時轉染參照Lipofectamine LTX試劑盒說明書進行。質粒轉染24 h 后，收集細胞裂解液。根據(jù)雙熒光素酶檢測試劑盒(Promega)說明書測定Firefly和Renilla熒光素酶活性，通過計算其比值確定啟動子片段相對活性。

1.8 數(shù)據(jù)分析

qRT-PCR測定的基因表達量利用2-△△Ct方法計算，運用GraphPad prism軟件進行單因素方差分析，使用SPSS 17.0對數(shù)據(jù)進行多重比較，P<0.05認為差異顯著，以*表示，P<0.01認為差異極顯著，以**表示。

2 結 果

2.1 鵝MyoG基因5′側翼序列生物信息學分析

對鵝MyoG基因5′端側翼區(qū)序列進行在線生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，鵝MyoG基因存在1個TATA-box，3個GC-box，無CAAT-box，BDGP在線預測鵝MyoG基因轉錄起始位點(TSS)位于-623 bp處。將鴨MyoG基因編碼區(qū)(GenBank No:NW_004676592.1)和啟動子區(qū)(GenBank No:KX981598)序列進行拼接，獲得鴨MyoG基因5′側翼區(qū)序列，將其與雞MyoG基因(GenBank No:NW_020109686.1)和本研究獲得的鵝MyoG基因起始密碼子前1 114 bp進行多重比對，發(fā)現(xiàn)鵝和鴨同源性是88%，鵝和雞的同源性僅為59.1%，說明MyoG基因啟動子調控機制在鴨和鵝相對保守。

結合Signal Scan和JASPAR預測鵝MyoG基因啟動子轉錄因子結合位點，比較發(fā)現(xiàn)，鴨和鵝MyoG基因啟動子區(qū)存在多個保守的潛在轉錄因子結合位點，包括HNF4、E2、USF和c-Rel等，且主要集中在TSS和起始密碼子ATG之間區(qū)域(圖1)。

星號表示轉錄起始位點；黑色箭頭表示潛在轉錄因子結合位點和方向The asterisk indicates the transcription start site;The black arrows indicate the binding site and direction of potential transcription factors圖1 鴨和鵝MyoG基因啟動子序列比較分析Fig.1 Aligment of MyoG gene promoter sequence between goose and duck

2.2 鵝MyoG基因5′側翼區(qū)擴增

凝膠電泳結果顯示，鵝MyoG基因5′側翼區(qū)擴增序列M0(1 245 bp)符合預期長度(圖2A)，系列缺失啟動子片段M1(1 150 bp)、M2(810 bp)、M3(660 bp)和M4(190 bp)也符合預期長度(圖2B)。

A.鵝MyoG基因5′側翼區(qū)；B.鵝MyoG基因系列缺失片段。M.DNA相對分子質量標準；M0.1 245 bp；M1.1 150 bp；M2.810 bp；M3.660 bp；M4.190 bpA.PCR analysis of goose MyoG 5′-flanking region;B.Serial deletion fragments of goose MyoG promoter.M.DL2000 marker;M0.1 245 bp;M1.1 150 bp;M2.810 bp;M3.660 bp;M4.190 bp圖2 鵝MyoG基因啟動子克隆Fig.2 Cloning of goose MyoG gene promoter

2.3 鵝MyoG基因核心啟動子區(qū)分析

將構建的pGL3-MyoG(-1 114～+37)、pGL3-MyoG(-774～+37)、pGL3-MyoG(-624～+37)和pGL3-MyoG(-154～+37)啟動子報告載體及對照質粒pGL3-Basic分別轉染至C2C12細胞，雙熒光素酶報告基因檢測結果表明，不同長度MyoG啟動子在C2C12細胞均具有活性，其中pGL3-MyoG(-1 114～+37)、pGL3-MyoG(-774～+37)、pGL3-MyoG(-624～+37)相互之間差異不顯著。pGL3-MyoG(-154～+37)的熒光素酶相對活性最低，顯著低于pGL3-MyoG(-774～+37)和pGL3-MyoG(-624～+37)活性(P<0.05)，同時極顯著低于pGL3-MyoG(-1 114～+37)活性(P<0.01)。因此推測，-624～+37 bp是鵝MyoG基因核心啟動子區(qū)，在-624～-154 bp區(qū)域存在關鍵順式調控元件(圖3)。

圖3 鵝MyoG基因啟動子不同片段在細胞系內的相對熒光素酶活性Fig.3 Relative luciferase activities of different segments of goose MyoG promoter in C2C12 cells

2.4 鵝MyoG基因核心啟動子區(qū)突變位點載體構建

以pGL3-MyoG(-624～+37)為模板，以表2所示引物對核心啟動子區(qū)潛在轉錄因子結合位點(HNF4、USF和E2)進行點突變擴增，擴增產物加T4 DNA連接酶連接，轉化大腸桿菌，挑取單克隆提質粒，進行雙酶切(NheⅠ和BglⅡ)驗證，同時對質粒進行測序驗證(圖4)，結果表明，成功構建了pGL3-HNF4-MyoG、pGL3-USF-MyoG和pGL3-E2-MyoG共3個突變位點報告基因載體(圖5)。

M.DNA相對分子質量標準；1.pGL3-HNF4-MyoG雙酶切產物；2.pGL3-USF-MyoG雙酶切產物；3.pGL3-E2-MyoG雙酶切產物M.DNA marker;1.Double digestion products of pGL3-HNF4-MyoG vector;2.Double digestion products of pGL3-USF-MyoG vector;3.Double digestion products of pGL3-E2-MyoG vector圖4 鵝MyoG突變載體雙酶切產物凝膠電泳圖Fig.4 Agarose gel electrophoresis of double digestion products of MyoG mutant vectors

A.HNF4結合位點；B.USF結合位點；C.E2結合位點。方框內表示轉錄因子結合位點突變對比A.HNF4 binding site;B.USF binding site;C.E2 binding site.Bases in box denote mutant transcription factor binding sites圖5 轉錄因子結合位點突變載體測序Fig.5 Sequencing analysis of mutant transcription factor binding sites vectors

2.5 鵝MyoG基因核心調控元件活性驗證

將構建好的pGL3-HNF4-MyoG、pGL3-USF-MyoG和pGL3-E2-MyoG突變位點報告基因載體和對照載體pGL3-MyoG(-624～+37 bp)分別轉染至C2C12細胞，雙熒光素酶報告基因檢測結果表明，突變位點報告基因在C2C12細胞均有活性，3個突變位點報告基因的熒光素酶相對活性均比pGL3-MyoG(-624～+37 bp)降低，其中pGL3-USF-MyoG的活性極顯著下降(P<0.01，圖6)。因此推測，USF是調控鵝MyoG基因轉錄的核心順式調控元件。

圖6 定點突變轉錄因子在細胞系內的相對熒光素酶活性Fig.6 Relative luciferase activities of site-directed mutant transcription factors

2.6 鵝MyoG基因組織表達分析

利用qRT-PCR對鵝胸肌、腿肌、心、肝、脾、肺、腎和下丘腦8種組織中MyoG、USF和內參基因β-actin片段進行擴增，檢測MyoG和USF的組織相對表達量，結果見圖7。MyoG在胸肌、腿肌和心的表達量最高，極顯著高于其它組織(P<0.01)，USF的組織表達模式和MyoG相似，二者在肌肉組織內同時表達，且相對表達量較高。結合轉錄因子突變試驗結果推測，USF和MyoG在鵝肌肉發(fā)育過程中共同發(fā)揮重要作用。

3 討 論

MyoG在哺乳動物骨骼肌發(fā)育的整個過程中都起著十分重要的調控作用，國內外學者對其調控機理的研究獲得了一系列重要的成果。畜禽個體肌肉的形成源自于胚胎時期成肌細胞的增殖與分化，肌纖維數(shù)量在胚胎期就基本固定下來，出生(殼)后不再增加，出生(殼)后肌肉產量的增加主要是通過肌纖維的增粗和變長實現(xiàn)[15]。由于家禽生理特點的差異，家禽胚胎期，尤其是胚胎后期肌肉發(fā)育規(guī)律與哺乳動物有顯著不同，表現(xiàn)為肌纖維直徑的縮小和胸肌產量的降低[16]，與此同時，胸肌中衛(wèi)星細胞的增殖活性和數(shù)量隨著胚齡增加而減少[15]，直到出殼當天，衛(wèi)星細胞的增殖能力才顯著恢復[17]，這與MyoG基因在鵝胚孵化期的表達規(guī)律相似[18]，因此推測，MyoG在家禽和哺乳動物的調控機制存在差異。本研究對鵝MyoG基因啟動子區(qū)序列進行了克隆與分析，篩選出核心啟動子區(qū)并初步明確了核心轉錄調控因子，為下一步分析其在胚胎期作用機制，闡明鵝肌肉發(fā)育的遺傳機制奠定了基礎。

A.MyoG基因mRNA相對表達量；B.USF基因mRNA相對表達量。不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母差異極顯著(P<0.01)A.MyoG mRNA relative expression level;B.USF mRNA relative expression level.Different superscript lowercase and captital letters indicate significant difference (P<0.05)and extremely significant difference (P<0.01)，respectively圖7 鵝MyoG和USF基因mRNA在不同組織的相對表達量Fig.7 The expression level of MyoG and USF mRNA in various tissues of goose

本研究獲得了鵝MyoG基因5′側翼區(qū)序列，生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，該區(qū)域包含MyoG基因啟動子區(qū)，包含TATA-box和GC-box等典型的真核生物轉錄調控元件，但缺失CAAT-box，這與鴨MyoG啟動子存在CAAT-box(位于-2 514～-2 508 bp)的研究結果不同[12]，推測其可能存在于已知序列前端，還需要進一步試驗驗證。而且，CAAT-box也并不總是存在于一個基因的啟動子區(qū)域，豬UCP2和SIM1基因啟動子區(qū)存在相似的情況[19-20]。

為了研究MyoG基因啟動子活性及其轉錄調控機制，本試驗采用擴增啟動子缺失片段的方法，通過構建雙熒光素酶重組載體，轉染至C2C12細胞，利用雙熒光素酶檢測系統(tǒng)對4個不同長度啟動子片段進行活性檢測。結果顯示，-624～+37 bp區(qū)域是鵝MyoG基因核心啟動子區(qū)，-624～-154 bp存在關鍵順式調控元件。采用JASPAR在線程序MatInspector分析-624～-154 bp區(qū)域潛在轉錄因子結合位點，篩選到了HNF4(-521～-503 bp)、USF(-379～-370 bp)和E2(-296～-281 bp)的結合位點。通過采用點突變技術對3個轉錄因子結合位點進行敲除，構建雙熒光素酶重組載體，轉染至C2C12細胞，利用雙熒光素酶檢測系統(tǒng)對3個突變位點報告基因載體進行活性檢測。結果顯示，USF轉錄因子突變載體 pGL3-USF-MyoG的活性極顯著下降(P<0.01)，其它兩處元件(HNF4 和E2)突變對啟動子活性影響不顯著，因此推測，USF是鵝MyoG基因核心轉錄調控因子。本課題組在C2C12細胞系內對USF基因進行敲降的研究中發(fā)現(xiàn)，USF表達量被顯著抑制(P<0.05)后，MyoG基因表達量極顯著降低(P<0.01)，說明在C2C12細胞中USF可以調控MyoG的表達，與本研究得到的結果相似(數(shù)據(jù)未發(fā)表)。

上游刺激因子(upstream stimulatory factor,USF)屬于堿性螺旋-環(huán)-螺旋亮氨酸鋅指(bHLH-LZ)轉錄因子家族，USF蛋白結構域在進化上保守性較高[21]，通常以同源或異源蛋白二聚體的形式特異結合靶基因DNA啟動子區(qū)E-box元件，從而發(fā)揮轉錄調控作用[22-23]，而E-box元件已被證明是一個潛在的順式調控位點[24]。研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)的骨骼肌相關基因控制區(qū)均含有一個或多個E-box元件[25]，USF是在大鼠骨骼肌、心肌等肌肉組織中大量表達的調控因子[26]，其可能廣泛參與肌肉組織的生長調控。對豬USF基因的研究表明，其多態(tài)性與眼肌面積、瘦肉率、屠宰率等胴體性狀存在顯著相關[27]。

理論上，功能相關的基因通常有相似的表達模式，基因表達相關性分析已經成為發(fā)掘基因間相互作用的一種有效手段[28]，轉錄因子對靶基因的調控具有組織特異性[29]，某些轉錄因子與靶基因傾向于共表達[30]，對牛肌肉發(fā)育相關基因與轉錄因子調控網絡研究發(fā)現(xiàn)，MyoG基因與候選轉錄因子具有穩(wěn)定的共表達模式[31]。本研究組織表達譜分析發(fā)現(xiàn)，USF和MyoG在鵝體內存在共表達趨勢，尤其在胸肌、腿肌、心臟表達量較高，且極顯著高于其它組織(P<0.01)，結果進一步說明，USF在調控鵝肌肉發(fā)育中具有潛在的重要功能。

MyoG所在的MRFs家族同樣具有bHLH結構域，結合本研究結果，推測USF首先與MyoG形成二聚體或多聚體，然后堿性區(qū)域與MyoG啟動子區(qū)E-box序列結合，從而激活MyoG基因轉錄。USF是動物體內極其重要的轉錄因子，和細胞生長、糖脂代謝、排卵等生理過程緊密相關[23,32]，但已有的研究結果尚不能完全說明其所代表的生理意義，本研究首次揭示了USF通過調控MyoG基因轉錄參與調控肌肉發(fā)育過程。

來源于不同物種的同源基因分子結構不盡相同，其基因功能、轉錄調控機制等都因基因結構的差異而有所不同。雞MyoG基因131 bp核心啟動子區(qū)內包含E-box和MEF-2兩個元件，二者協(xié)同激活MyoG基因啟動子活性，并且介導E蛋白E2-5和蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)調控MyoG轉錄活性[33]。民豬MyoG基因啟動子核心調控元件是CdxA和MZF1轉錄因子[3]，這與本研究結果不同。結合雞、鴨MyoG基因啟動子研究結果[12]，進一步說明MyoG基因轉錄調控機制非常復雜，下一步可以通過染色質免疫共沉淀(EMSA)和凝膠阻滯分析試驗等方法驗證USF調控鵝MyoG轉錄活性的功能，進一步研究其作用機制。

4 結 論

本試驗成功克隆得到鵝MyoG基因啟動子區(qū)序列，序列比對表明，鵝和鴨MyoG基因啟動子區(qū)同源性較高。啟動子活性檢測發(fā)現(xiàn)，-624～+37 bp區(qū)域是鵝MyoG基因核心啟動子區(qū)，-624～-154 bp區(qū)域存在關鍵順式調控元件。對核心區(qū)轉錄因子進行定點突變，構建轉錄因子突變表達載體后測定活性，結果表明，USF是啟動子核心順式調控因子。本研究結果為進一步開展鵝肌肉發(fā)育調控提供了理論基礎。