◎嚴(yán)美婷，張 良

（江西省食品發(fā)酵研究所，江西 宜春 336000）

納豆是大豆經(jīng)納豆菌發(fā)酵而成的一種傳統(tǒng)食品，納豆中含有納豆激酶，其作用廣泛，具有抗血栓、降血壓、抗腫瘤等多種生理功能[1-3]。高活力的納豆菌既可以縮短發(fā)酵時(shí)間，減少發(fā)酵過程中的污染，減少成本，也能提高納豆激酶酶活性，因此提高納豆菌的發(fā)酵活力至關(guān)重要。

納豆菌菌粉相比較于液態(tài)種子液，其明顯優(yōu)勢是污染小，且使用更加便捷。從成本考慮，降低了菌種存放的條件，在低溫干燥的環(huán)境下可保存。但納豆菌菌粉由于經(jīng)過干燥處理，其細(xì)胞及活力都受到了損傷，因此在進(jìn)行發(fā)酵或繁殖之前，必須對其復(fù)水活化，恢復(fù)損傷的細(xì)胞，經(jīng)一定時(shí)間的培養(yǎng)后恢復(fù)其正常的生理功能[4-5]。目前納豆菌的研究主要集中在納豆激酶高產(chǎn)菌株的選育及液態(tài)發(fā)酵條件的優(yōu)化，以及添加輔佐材料及一些化學(xué)藥品對納豆激酶酶活產(chǎn)生的影響，而忽略了納豆菌菌粉的復(fù)水活化條件對納豆菌發(fā)酵活力的影響[6]。因此掌握納豆菌菌粉的復(fù)水活化機(jī)理，選擇合適的復(fù)水活化條件對提高納豆菌的發(fā)酵活力至關(guān)重要。

本文對納豆菌菌粉的復(fù)水活化工藝進(jìn)行研究，通過單因素和正交試驗(yàn)優(yōu)化其復(fù)水工藝，以期尋找出最佳的納豆菌菌粉復(fù)水活化條件，提高其發(fā)酵活力，進(jìn)而為納豆食品的生產(chǎn)及制備提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

納豆菌菌粉，江西省食品發(fā)酵研究所微生物實(shí)驗(yàn)室保存；脫脂乳粉，光明脫脂奶粉；牛肉膏、蛋白胨，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；酵母膏（分析純），杭州微生物試劑二廠；可溶性淀粉（分析純），廣東汕頭市西隴化工廠。

1.2 培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基：牛肉膏0.3%，蛋白胨1%，瓊脂1.5%～2.5%，NaCl 0.5%，pH 為7.4～7.6。

發(fā)酵液培養(yǎng)基：可溶性淀粉3%，酵母膏2%，K2HPO40.01%，KH2PO40.01%，CaCl20.05%，pH 為6.5。

1.3 儀器與設(shè)備

BXM-30R 立式壓力蒸汽鍋（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司）、UV-9100 紫外可見分光光度計(jì)（北京瑞利分析儀器公司）、BS224S 電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司）、SHP-160 型生化培養(yǎng)箱（上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司）、TGL-16G 臺式離心機(jī)（長沙湘智離心機(jī)儀器有限公司）、HH-4 恒溫水浴鍋（國華電器有限公司）及SPH-304 恒溫?fù)u床（上海世平實(shí)驗(yàn)有限公司）。

1.4 單因素實(shí)驗(yàn)

1.4.1 復(fù)水劑種類的選擇

以無菌水、生理鹽水、納豆菌培養(yǎng)種子液、黃豆汁以及4%、8%和12%的脫脂乳粉作為復(fù)水活化劑，將納豆菌菌粉以1∶200 的比例（W/V）與復(fù)水劑混合，置于32 ℃的恒溫箱中復(fù)水活化60 min 后用平板菌落計(jì)數(shù)法計(jì)算活菌數(shù)[7]，再將其接種至發(fā)酵液中進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵[8]，用福林酚法[9]測定發(fā)酵液中納豆激酶酶活，從而確定最佳的復(fù)水劑種類。

1.4.2 菌粉與復(fù)水劑比例的選擇

將納豆菌菌粉與復(fù)水劑分別按1∶50、1∶100、1∶150、1∶200、1∶250、1∶300 和1∶350 的比例混合，置于32 ℃恒溫箱中復(fù)水活化60 min，測定活菌數(shù)及發(fā)酵液中納豆激酶酶活，從而確定最佳的比例。

1.4.3 復(fù)水時(shí)間的選擇

將納豆菌菌粉與復(fù)水劑以1∶200 的比例（W/V）混合后置于32 ℃恒溫箱中分別復(fù)水活化20 min、40 min、60 min、80 min、100 min 和120 min，測定活菌數(shù)及發(fā)酵液中納豆激酶酶活，從而確定最佳的復(fù)水時(shí)間。

1.4.4 復(fù)水溫度的選擇

將納豆菌菌粉與復(fù)水劑以1∶200 的比例（W/V）混合后分別置于20 ℃、24 ℃、28 ℃、32 ℃、36 ℃、40 ℃和44 ℃的恒溫箱中復(fù)水活化60 min，測定活菌數(shù)及發(fā)酵液中納豆激酶酶活，從而確定最佳的復(fù)水溫度。

1.5 正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，分別選取納豆菌菌粉與復(fù)水劑比例（A）、復(fù)水溫度（B）和復(fù)水時(shí)間（C）3 個(gè)因素進(jìn)行正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。其正交實(shí)驗(yàn)水平因素設(shè)計(jì)見表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)水平因素設(shè)計(jì)表

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 復(fù)水劑種類對納豆菌菌粉復(fù)水活化的影響

由圖1 可知，不同的復(fù)水劑對納豆菌菌粉復(fù)水活化的效果不同，無菌水對菌粉的復(fù)水活化效果最差，以8%脫脂乳和12%脫脂乳作為復(fù)水劑時(shí)效果最好，菌粉復(fù)水活化后活菌數(shù)及納豆激酶酶活較高，其中兩者的活菌數(shù)相差較小，而以8%脫脂乳為復(fù)水劑時(shí)納豆激酶酶活高于12%脫脂乳復(fù)水劑，故選擇8%脫脂乳粉作為最佳復(fù)水劑。

圖1 復(fù)水劑種類對納豆菌菌粉復(fù)水活化的影響圖

2.1.2 菌粉與復(fù)水劑的比例對納豆菌菌粉復(fù)水活化的影響

由圖2 可知，活菌數(shù)隨菌粉與復(fù)水劑比例升高呈下降趨勢，這是由于隨著復(fù)水劑含量的增加，菌粉的含量相對減少所導(dǎo)致。而納豆激酶酶活呈先增加后下降趨勢，當(dāng)比例為1∶100 時(shí)酶活最高，為629.325 U·mL-1，這說明在此比例下復(fù)水劑對菌粉的復(fù)水效果最好，復(fù)水活化后納豆菌的活力最強(qiáng)。故綜合數(shù)據(jù)分析，選擇該比例前后接近的梯度1∶75、1∶100、1∶125 作為該因素3 個(gè)水平進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。

圖2 菌粉與復(fù)水劑的比例對納豆菌菌粉復(fù)水活化的影響圖

2.1.3 復(fù)水溫度對納豆菌菌粉復(fù)水活化的影響

由圖3 可知，活菌數(shù)和納豆激酶酶活隨著復(fù)水溫度的升高都呈先升高后降低的趨勢，納豆菌菌粉在36 ℃條件下復(fù)水后活菌數(shù)最高，在40 ℃條件下復(fù)水活化后納豆激酶酶活最高，但此溫度下的活菌數(shù)與36 ℃條件下的活菌數(shù)相差不大，因此綜合考慮選擇32 ℃、36 ℃、40 ℃作為該因素3 個(gè)水平進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。

圖3 復(fù)水溫度對納豆菌菌粉復(fù)水活化的影響圖

2.1.4 復(fù)水時(shí)間對納豆菌菌粉復(fù)水活化的影響

由圖4 看出，從20～60 min 這段時(shí)間納豆菌活菌數(shù)和納豆激酶酶活增加明顯，當(dāng)菌粉復(fù)水60 min后其活菌數(shù)和納豆激酶酶活達(dá)到最高，活菌數(shù)達(dá)5.051×108CFU·mL-1，發(fā)酵后酶活達(dá)587.924 U·mL-1。繼續(xù)增加復(fù)水時(shí)間，活菌數(shù)和納豆激酶酶活都下降，說明復(fù)水時(shí)間過長，反而對納豆菌菌粉活化不利。綜上分析，選擇以60 min 為基準(zhǔn)上下10 min 為梯度的3 個(gè)水平：50 min、60 min、70 min 作為該因素3 個(gè)水平進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。

圖4 復(fù)水時(shí)間對納豆菌菌粉復(fù)水活化的影響圖

2.2 正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

對正交實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2，方差分析見表3。由表2 可知，Rc＞RA＞RB，則表明各因素對實(shí)驗(yàn)影響大小為C ＞A ＞B，由表3可知菌粉與復(fù)水劑比例和復(fù)水時(shí)間對納豆激酶酶活的影響顯著（P＜0.05），復(fù)水溫度對酶活的影響不顯著（P＞0.05）。由表4 可知，A2與A3差異不顯著，與A1差異顯著，較佳水平為A2（k2最大），B 因素的各水平對納豆激酶酶活力的影響無差異，但較佳水平為B2，C2與C3、C1間差異顯著，較佳水平為C2，故納豆菌菌粉的最佳復(fù)水工藝方案為A2B2C2。經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證得出采用此工藝納豆菌菌粉復(fù)水活化后活菌數(shù)達(dá)5.268×108CFU·mL-1，納豆激酶酶活達(dá)750.062 U·mL-1，因此納豆菌菌粉的最佳復(fù)水工藝為：以8%的脫脂乳粉作為復(fù)水活化劑，發(fā)酵劑與復(fù)水劑比例為1∶100，復(fù)水溫度為36 ℃，復(fù)水時(shí)間為60 min。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果表

表3 方差分析結(jié)果表

表4 多重比較結(jié)果表

3 結(jié)論

納豆菌菌粉在用于發(fā)酵納豆前需進(jìn)行復(fù)水活化，恢復(fù)細(xì)胞的正常功能。本文采用單因素及正交實(shí)驗(yàn)對納豆菌菌粉的復(fù)水活化工藝進(jìn)行了優(yōu)化，確定了菌粉最佳復(fù)水活化工藝為：以8%脫脂乳粉為復(fù)水劑，發(fā)酵劑與復(fù)水劑比例為1∶100，復(fù)水溫度為36 ℃，復(fù)水時(shí)間為60 min，在此條件下納豆菌菌粉經(jīng)復(fù)水活化后活菌數(shù)達(dá)到了5.268×108CFU·mL-1，用于液態(tài)發(fā)酵時(shí)納豆激酶酶活達(dá)750.062 U·mL-1。

此復(fù)水工藝有效地提高了納豆菌菌粉的活性，從而有利于提高納豆及其制品的生產(chǎn)效率及其穩(wěn)定性。