張耀玲 王勝寶 郝興順 劉勇 張成兵 魏芳勤 黃重

摘 要：利用ITS方法和進(jìn)化樹構(gòu)建對(duì)1株自分離的野生側(cè)耳屬真菌進(jìn)行了分析鑒定，通過單因素試驗(yàn)研究了影響該真菌菌絲生長的環(huán)境和營養(yǎng)條件。結(jié)果表明：經(jīng)鑒定，該側(cè)耳屬真菌為平菇，寧強(qiáng)平菇菌株與其他平菇菌株親緣關(guān)系遠(yuǎn)，自分離和選育的鎮(zhèn)巴平菇和寧強(qiáng)平菇親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。該平菇菌絲生長的最佳碳源為蔗糖，最佳氮源為蛋白胨，生長的最佳pH在6.0～6.5，最適溫度25℃，最佳碳氮比10∶1。

關(guān)鍵詞：菌絲;ITS;平菇

中圖分類號(hào) S571.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 1007-7731（2021）11-0040-03

Identification of a Wild Pleurotus ostreatus Strain and its Nutritional Growth Conditions

ZHANG Yaoling1，2 et al.

（1Hanzhong Institute of Agricultural Sciences， Hanzhong 723000， China; 2Quality and Safety of Agricultural Products Inspection Test Center of Yulin， Yulin 719000， China）

Abstract： A self isolated wild Pleurotus fungus was identified by its method and phylogenetic tree construction. Then， the environmental and nutritional conditions affecting the mycelial growth of the fungus were studied by single factor experimental design. The results showed that Pleurotus ostreatus was Pleurotus ostreatus， and Ningqiang Pleurotus ostreatus was far related to other Pleurotus ostreatus strains， and Zhenba Pleurotus ostreatus and Ningqiang Pleurotus ostreatus were far related. The optimal carbon source and nitrogen source for the mycelium growth of Pleurotus ostreatus were sucrose and peptone. The optimal pH range for the mycelium growth was 6.0-6.5， the optimal temperature was 25℃， and the optimal carbon nitrogen ratio was 10∶1.

Key words： Mycelium; ITS; Pleurotus ostreatus

側(cè)耳屬為一類營養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高的腐生真菌，在我國栽培種類豐富，范圍廣，市場占有量大，具有悠久的栽培歷史[1]。據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，全世界大概有50種側(cè)耳屬具有有效名，圖力古爾[2]等初步確定了我國分布有36個(gè)側(cè)耳種。在中國栽培的側(cè)耳屬真菌包括糙皮側(cè)耳（平菇）、肺形側(cè)耳（秀珍菇）、金頂側(cè)耳（榆黃蘑）等[2]。近年來，分子生物學(xué)方法的應(yīng)用為側(cè)耳屬的分類和鑒定帶來了便利。為此，筆者從寧強(qiáng)縣深山采摘并分離獲得一株側(cè)耳屬菌株，隨后利用ITS方法對(duì)其進(jìn)行了分析和鑒定，對(duì)該菌株的菌絲生長適宜條件進(jìn)行了研究，旨在探索該側(cè)耳屬菌株生長適宜的條件，為該菌株的進(jìn)一步開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料 供試野生菌株采自漢中市寧強(qiáng)縣，通過組織分離留種，記為寧強(qiáng)菌株。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 寧強(qiáng)菌株的分子鑒定 采用PDA復(fù)合培養(yǎng)基培養(yǎng)菌絲，CTAB法提取DNA。通用引物ITS1和ITS4各1μL，DNA：1μL，2*Mix：10μL，進(jìn)行PCR，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，送公司測序。采用軟件ClustalW 2.0，進(jìn)行DNA序列比對(duì)，用MEGA 6.0進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，以NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.2 菌株最佳營養(yǎng)和環(huán)境條件的確定 采用PDA復(fù)合培養(yǎng)基（馬鈴薯200g，葡萄糖20g，磷酸二氫鉀3g，硫酸鎂1.5g，蛋白胨5g，瓊脂粉10g，維生素B1 10mg，加水定容至1L，pH自然）于25℃暗培養(yǎng)菌株。設(shè)置了6種碳源處理，6種氮源處理，5種碳氮比處理，4個(gè)溫度梯度處理和7個(gè)pH梯度處理，每個(gè)處理作3個(gè)平行，具體方法詳見文獻(xiàn)[3]。

1.2.2.1 碳源 分別添加蔗糖、果糖、麥芽糖、乳糖、淀粉、葡萄糖6種不同供試碳源于PDA復(fù)合培養(yǎng)基中，添加量20g/L。

1.2.2.2 氮源 分別添加硝酸鈉、牛肉膏、酵母粉、硫酸銨、谷氨酸、蛋白胨6種不同供試氮源于PDA復(fù)合培養(yǎng)基中，添加量5g/L。

1.2.2.3 溫度 采用PDA復(fù)合培養(yǎng)基培養(yǎng)，分別設(shè)置15℃、20℃、25℃及30℃4個(gè)溫度梯度。

1.2.2.4 pH值 采用PDA復(fù)合培養(yǎng)基培養(yǎng)，分別設(shè)置為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0。

1.2.2.5 碳氮比 采用PDA復(fù)合培養(yǎng)基培養(yǎng)，改變蛋白胨添加量配成碳氮比為10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1的培養(yǎng)基，觀察不同碳氮比處理對(duì)菌絲生長的影響。

1.3 數(shù)據(jù)處理 采用Micrsoft Excel 2013軟件作圖，用DPS軟件方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于ITS序列的進(jìn)化分析 從圖1可以看出，寧強(qiáng)菌株的ITS片段大小為646bp（去除載體兩端的多克隆位點(diǎn)序列），將該序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST搜索和比對(duì)，獲取相似度最高的前15個(gè)菌株的ITS序列，這些側(cè)耳屬菌株均為平菇（Pleurotus ostreatus），結(jié)合寧強(qiáng)菌株的子實(shí)體形態(tài)特征、菌落形態(tài)特征，綜合表明寧強(qiáng)菌株為平菇菌株。

從進(jìn)化樹來看，寧強(qiáng)平菇菌株為單獨(dú)的一個(gè)分支，與其他16個(gè)平菇菌株的遺傳距離遠(yuǎn)，說明寧強(qiáng)平菇菌株與其他菌株親緣關(guān)系遠(yuǎn)，菌株KY686259.1與鎮(zhèn)巴平菇親緣關(guān)系近，除平菇菌株KY686259.1、鎮(zhèn)巴平菇和寧強(qiáng)平菇菌株之外，其他的13個(gè)菌株聚類在一個(gè)分支上，可能是相似的平菇品種，親緣關(guān)系最近，自分離和選育的鎮(zhèn)巴平菇和寧強(qiáng)平菇不在同一分支上，結(jié)合兩者菌株的子實(shí)體形態(tài)特征、菌落形態(tài)特征差異都較大，說明兩者進(jìn)化距離遠(yuǎn)，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

2.2 不同碳源對(duì)寧強(qiáng)平菇菌株生長的影響 寧強(qiáng)平菇菌株的菌絲在6種供試碳源培養(yǎng)基上均能生長，菌絲呈灰白色，均有少量的黃色分泌物，但是在不同碳源培養(yǎng)上，菌絲的生長狀況差異較為明顯。如表1所示，在淀粉中菌絲生長速度最快，為10.78mm/d，與其他碳源處理之間差異達(dá)到極顯著水平。其次為蔗糖、葡萄糖、麥芽糖，三者之間有顯著性差異。在添加有乳糖的培養(yǎng)基上，菌絲生長最緩慢，為7.32mm/d，但是依然可以促進(jìn)菌絲長勢。綜合比較，說明寧強(qiáng)平菇的最適碳源為淀粉，其次為蔗糖。

2.3 不同氮源對(duì)寧強(qiáng)平菇菌絲生長的影響 寧強(qiáng)平菇菌絲在6種供試氮源中均邊緣整齊，菌絲呈灰白色。如表2所示，在硝酸鈉培養(yǎng)基中菌絲生長速率小、菌落長勢最差，與其他處理間達(dá)到了極顯著水平;寧強(qiáng)平菇在添加蛋白胨的培養(yǎng)基上的菌絲長勢強(qiáng)壯，生長速率最大，與其他處理間達(dá)到了顯著水平。牛肉膏、酵母粉和谷氨酸3種氮源，菌絲之間的長勢差異不明顯。綜合比較，蛋白胨是寧強(qiáng)平菇生長的最適氮源。

2.4 不同溫度對(duì)寧強(qiáng)平菇菌絲生長的影響 寧強(qiáng)平菇菌絲生長和子實(shí)體發(fā)育的整個(gè)過程中，溫度是一個(gè)重要的環(huán)境因子。如圖3所示，在15～30℃溫度范圍內(nèi)，寧強(qiáng)平菇菌絲都可以生長的，菌絲對(duì)溫度變化較為明顯敏感。其中，15℃時(shí)菌絲生長速度最小，15～30℃時(shí)時(shí)菌絲的生長速度呈增加后降低的趨勢，溫度為25℃時(shí)菌絲的生長速度達(dá)到最大，長勢最佳。

2.5 不同pH對(duì)寧強(qiáng)平菇菌絲生長的影響 由表3可知，培養(yǎng)基pH值對(duì)寧強(qiáng)平菇菌絲生長的影響較為顯著。pH為6.0～7.0時(shí)菌絲長勢達(dá)到最佳，邊緣呈絨毛狀且整齊，差異極顯著;菌絲長速度在pH為6.5時(shí)達(dá)到最大，所以pH為6.0～6.5最適寧強(qiáng)平菇菌絲生長。

2.6 不同碳氮比對(duì)寧強(qiáng)平菇菌絲生長的影響 由表4可知，寧強(qiáng)平菇菌絲對(duì)培養(yǎng)基中碳氮比的變化對(duì)較為敏感，在試驗(yàn)范圍內(nèi)，菌絲長勢在培養(yǎng)基中碳氮比為10∶1時(shí)達(dá)到最佳，生長速度達(dá)到最大，為10.46mm/d。

3 討論

寧強(qiáng)平菇菌株與其他16個(gè)平菇菌株親緣關(guān)系遠(yuǎn)，自分離和選育的鎮(zhèn)巴平菇和寧強(qiáng)平菇親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。寧強(qiáng)平菇可以利用的碳源很廣，通過平板實(shí)驗(yàn)篩選出寧強(qiáng)平菇生長的最好的碳源為淀粉，其次為蔗糖，乳糖不適宜寧強(qiáng)平菇生長。在6種供試氮源中，寧強(qiáng)平菇對(duì)蛋白胨的利用效果最好，其次是酵母粉和牛肉膏。由于蛋白胨中含有蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素等多種氮源和生長因子，能夠滿足菌絲對(duì)多樣營養(yǎng)的需求，進(jìn)而促進(jìn)菌絲生長，而無機(jī)氮源和氨基酸因其成分單一，難以滿足菌絲對(duì)微量元素、生長因子等的需求，菌絲生長緩慢[5]。因此，寧強(qiáng)平菇菌絲對(duì)蛋白胨的利用優(yōu)于無機(jī)氮源和氨基酸。不同碳氮比處理對(duì)菌絲生長也有影響，碳氮比為10∶1能滿足菌絲生長對(duì)碳氮的要求，菌絲長勢最好。綜合來看，在15～30℃培養(yǎng)條件下，菌絲均能生長，25℃是寧強(qiáng)平菇菌絲生長的最適溫度，最適pH為6.0～6.5。

參考文獻(xiàn)

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[6]鄭偉.平菇優(yōu)良菌株的選育及評(píng)價(jià)[D].邯鄲：河北工程大學(xué)，2017.

（責(zé)編：張宏民）