代 勇，代 巖

（1.撫順市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，遼寧 撫順 113006；2.鐵嶺萬(wàn)和生物科技有限公司，遼寧 鐵嶺 112000）

蛹蟲草菌絲液體培養(yǎng)條件研究

代 勇1，代 巖2

（1.撫順市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，遼寧 撫順 113006；2.鐵嶺萬(wàn)和生物科技有限公司，遼寧 鐵嶺 112000）

本試驗(yàn)對(duì)蛹蟲草菌絲培養(yǎng)條件進(jìn)行了研究，確定最佳的培養(yǎng)條件是：pH值7.0，振蕩培養(yǎng)時(shí)間7天，培養(yǎng)溫度22℃，培養(yǎng)基裝液量100毫升/瓶，搖床振頻120～140轉(zhuǎn)/分鐘。菌絲體表現(xiàn)為菌球分布均勻，密度疏密適中，大小適宜，菌球組織緊實(shí)，干重可達(dá)到0.5克/100毫升。

蛹蟲草；液體發(fā)酵；菌絲干重

蛹蟲草是真菌和蟲體相互結(jié)合的一種藥用真菌，多寄生在鱗翅目蛹和幼蟲體內(nèi)。經(jīng)研究，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值可和冬蟲夏草相媲美，甚至有些成分還高于冬蟲夏草。但由于冬蟲夏草產(chǎn)量低，價(jià)格昂貴，所以蛹蟲草的人工栽培顯得尤為重要，且極具商業(yè)價(jià)值。經(jīng)大量研究表明，人工液體發(fā)酵獲得的蟲草菌絲體和冬蟲夏草的成分基本一致，可代替其入藥。

1 材料和方法

1.1 材料

蛹蟲草固體菌種，由遼東學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心微生物與遺傳實(shí)驗(yàn)室提供。主要儀器：高壓蒸汽滅菌鍋，恒溫培養(yǎng)箱，遠(yuǎn)紅外恒溫干燥箱，分析天平等。菌種活化培養(yǎng)基：馬鈴薯200克，葡萄糖20克，蛋白胨5克，磷酸二氫鉀2克，硫胺素10毫克，瓊脂20克，水1000毫升。液體發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖20克，蛋白胨10克，硫酸鎂1克，磷酸二氫鉀2克，硫胺素15毫克，核黃素15毫克，水1000毫升。

1.2 方法

菌種活化，將斜面固體菌種接種在活化平板培養(yǎng)基上，20～22℃培養(yǎng)1周，菌絲長(zhǎng)滿平板后即可轉(zhuǎn)色備用。按液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方制備液體培養(yǎng)基，用1摩爾/升Hcl或1摩爾/升NaOH將培養(yǎng)基pH值分別調(diào)制4.0、5.0、6.0、7.0、8.0。液體培養(yǎng)基分裝在250毫升三角瓶?jī)?nèi)，每瓶100毫升，各處理重復(fù)5次，常規(guī)滅菌。在無(wú)菌條件下，用打孔器取活化菌種接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)。培養(yǎng)條件: 20～22℃，閉光，130轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)。振蕩培養(yǎng)7天后過濾菌液，菌絲用蒸餾水沖洗數(shù)次，60℃烘干稱重。不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)蛹蟲草菌絲生長(zhǎng)量的影響，培養(yǎng)時(shí)間分別為5、6、7、8、9天。不同培養(yǎng)溫度對(duì)蛹蟲草菌絲生長(zhǎng)量的影響，培養(yǎng)溫度分別為18、20、22、24、26℃。不同裝液量對(duì)蛹蟲草菌絲生長(zhǎng)量的影響，在250毫升三角瓶中培養(yǎng)基裝液量分別為80、100、120、140、160毫升。不同振頻對(duì)蛹蟲草菌絲生長(zhǎng)量的影響，搖床振頻分別為80、100、120、140、160轉(zhuǎn)/分鐘。

2 結(jié)果分析

2.1 不同pH值對(duì)蛹蟲草菌絲生長(zhǎng)量的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明：不同pH值對(duì)蛹蟲草菌絲生長(zhǎng)量的影響不同。由表1可知，在其他條件相同的情況下，菌絲生長(zhǎng)起始期其生長(zhǎng)量隨著pH值的升高而增加，當(dāng)pH值為7.0時(shí)菌絲干重最大（0.4407克/100毫升），菌球分布均勻，大小適中，密度最佳。達(dá)到8.0時(shí)菌絲生長(zhǎng)量開始下降，菌球密度也明顯減小。說明菌絲在弱酸條件下隨著pH值升高而升高，而堿性條件對(duì)菌絲生長(zhǎng)有抑制作用。

2.2 不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)蛹蟲草菌絲生長(zhǎng)量的影響

菌絲在接種后2天內(nèi)要經(jīng)過適應(yīng)期，接著會(huì)進(jìn)入快速生長(zhǎng)期，由表2可看出培養(yǎng)7天的菌絲干重最高（0.5483克/100毫升），在5～6天之間培養(yǎng)時(shí)間較短，菌絲快速生長(zhǎng)期還未達(dá)到頂峰階段，因此菌絲生長(zhǎng)量較少，而8～9天菌絲培養(yǎng)時(shí)間過長(zhǎng)，開始逐漸衰老自溶，菌球變大變松，產(chǎn)量下降。因此，多種因素綜合考慮以培養(yǎng)7天最有利于菌絲的生長(zhǎng)。

表1 不同pH值對(duì)蛹蟲草菌絲生長(zhǎng)量的影響

表2 不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)蛹蟲草菌絲生長(zhǎng)量的影響

表3 不同培養(yǎng)溫度對(duì)蛹蟲草菌絲生長(zhǎng)量的影響

表4 不同裝液量對(duì)蛹蟲草菌絲生長(zhǎng)量的影響

2.3 不同培養(yǎng)溫度對(duì)蛹蟲草菌絲生長(zhǎng)量的影響

蛹蟲草菌絲在15～30℃下均能生長(zhǎng)，但溫度的高低對(duì)菌絲的產(chǎn)量起著決定性作用。由表3可看出在22℃時(shí)，菌絲干重最高。在18～22℃之間菌絲生長(zhǎng)量隨著溫度的升高而增加,當(dāng)溫度達(dá)到26℃時(shí)，由于溫度過高不適宜菌絲生長(zhǎng)，所以菌絲產(chǎn)量較低。

2.4 不同裝液量對(duì)蛹蟲草菌絲生長(zhǎng)量的影響

培養(yǎng)基裝液量的多少直接影響振蕩培養(yǎng)的效果，不同液體體積在規(guī)定空間（250毫升）內(nèi)的振蕩效果差異較大，另外，較多的裝液量也會(huì)給搖床增加負(fù)擔(dān)。由表4看出菌絲生長(zhǎng)量隨著裝液量的增加而減少，兩者呈反比。分析原因，裝液量少時(shí)有足夠的剩余空間為培養(yǎng)基提供溶氧，利于菌絲生長(zhǎng)。裝液量在100毫升時(shí)菌絲干重最大（0.4414克/100毫升），裝液量在120毫升時(shí)菌絲生長(zhǎng)量與100毫升時(shí)差別不明顯，但考慮到經(jīng)濟(jì)問題認(rèn)為100毫升為最佳。

2.5 不同振頻對(duì)蛹蟲草菌絲生長(zhǎng)量的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明：在相同時(shí)間內(nèi)，振蕩頻率越大菌絲生長(zhǎng)量越多，在120～140轉(zhuǎn)/分鐘之間時(shí)菌絲生長(zhǎng)量最高，菌球也較為均勻，濃密，但當(dāng)振蕩頻率到達(dá)160轉(zhuǎn)/分鐘時(shí)菌絲體結(jié)球狀不好，出現(xiàn)塊狀菌絲聚集象限，不利于生長(zhǎng)，因此，綜合考慮以120～140轉(zhuǎn)/分鐘最為適合。

表5 不同振頻對(duì)蛹蟲草菌絲生長(zhǎng)量的影響

3 結(jié)論

對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析來(lái)看，蛹蟲草菌絲發(fā)酵始期階段在弱酸條件下生長(zhǎng)較好，pH值在7.0時(shí)菌絲生長(zhǎng)量達(dá)到最高峰，超過7.0時(shí)菌絲生長(zhǎng)量減少，菌絲產(chǎn)量減低；菌絲培養(yǎng)的最佳時(shí)間為7天，在第7天時(shí)測(cè)得菌絲干重最高，說明菌絲以完成對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，產(chǎn)量達(dá)到頂峰，如果繼續(xù)培養(yǎng)，菌絲將進(jìn)入衰老階段，生長(zhǎng)量不再增加；溫度因素實(shí)驗(yàn)分析表明，在各處理之間菌絲產(chǎn)量沒有差異，菌絲在18～26℃之間均能正常生長(zhǎng)，但在22℃時(shí)菌絲產(chǎn)量最高；蛹蟲草菌絲最佳的裝液量為100毫升/瓶，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)裝液量在100毫升時(shí)瓶?jī)?nèi)的溶氧量最高，對(duì)菌絲生長(zhǎng)提供充足的氧分，菌絲生長(zhǎng)量最高，菌絲質(zhì)量最好；在不同振頻對(duì)蛹蟲草菌絲生長(zhǎng)量的影響試驗(yàn)中，分析得搖床振蕩頻率在80～140轉(zhuǎn)/分鐘范圍內(nèi)菌絲產(chǎn)量逐漸增加，在140轉(zhuǎn)/分鐘時(shí)菌絲產(chǎn)量最高。