龔國(guó)利，王 娜， 劉麗麗， 游銀偉

(1.陜西科技大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院， 陜西 西安 710021； 2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 高新技術(shù)研究中心， 山東 濟(jì)南 250100)

0 引言

粘細(xì)菌是一類(lèi)普遍存在于土壤、堆肥及腐敗的樹(shù)皮中的原核生物[1]，屬于革蘭氏陰性細(xì)菌，具有復(fù)雜的多細(xì)胞行為[2].粘細(xì)菌是生物活性物質(zhì)的生產(chǎn)者，能夠產(chǎn)生廣泛的具有活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物，同時(shí)也是天然藥物的優(yōu)良資源之一.纖維堆囊菌是粘細(xì)菌中唯一能降解纖維素的種群[3]，從中發(fā)現(xiàn)了許多作用機(jī)制獨(dú)特、結(jié)構(gòu)新穎的生物活性物質(zhì)，引起了學(xué)者研究的興趣.

埃博霉素(epothilone)是一類(lèi)粘細(xì)菌纖維堆囊菌產(chǎn)生的天然大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)物質(zhì)[4,5]，是一種新型的抗腫瘤藥物.它的作用機(jī)制與紫杉醇相同，通過(guò)促微管聚合作用抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[6,7]，但它在水溶性、安全性以及抗腫瘤活性等方面優(yōu)于紫杉醇[8].埃博霉素化學(xué)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，易于進(jìn)行修飾，引起了生物、醫(yī)學(xué)、制藥及有機(jī)合成等學(xué)科領(lǐng)域的高度重視.埃博霉素A和埃博霉素B是纖維堆囊菌產(chǎn)生的兩種主要產(chǎn)物[9]，因其在埃博霉素的類(lèi)似物中活性較高而被廣泛研究，其中埃博霉素B活性更高，大量體外實(shí)驗(yàn)的評(píng)價(jià)顯示了埃博霉素B是紫杉醇最具希望的替代者[10].2007年，施貴寶公司開(kāi)發(fā)的埃博霉素B衍生物L(fēng)xabepilone獲得FDA批準(zhǔn)在美國(guó)上市，在治療乳腺癌方面具有明顯的效果[11].

目前，埃博霉素產(chǎn)量低，不穩(wěn)定，受培養(yǎng)條件和環(huán)境等因素的影響很大，這些因素為其開(kāi)發(fā)和應(yīng)用帶來(lái)了很大的困難，所以在發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程中，主要通過(guò)菌種選育和優(yōu)化發(fā)酵工藝條件來(lái)提高埃博霉素產(chǎn)量.微生物發(fā)酵的生產(chǎn)水平不僅取決于生產(chǎn)菌種本身的性能，而且要賦予合適的環(huán)境條件才能夠使它的生產(chǎn)能力充分表現(xiàn)出來(lái)，這兩個(gè)環(huán)節(jié)是相輔相成的.

為了提高埃博霉素B的產(chǎn)量，降低生產(chǎn)成本，本實(shí)驗(yàn)在前期優(yōu)化培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，為其規(guī)?；a(chǎn)奠定了基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

纖維堆囊菌SoF5-76(Sorangium cellulosum SoF5-76)本實(shí)驗(yàn)室保存菌.來(lái)源：由本實(shí)驗(yàn)室從土壤中篩選，經(jīng)過(guò)基因組重組技術(shù)選育獲得，埃博霉素B產(chǎn)量為14.3 mg/L[12].

1.1.2 培養(yǎng)基

(1)CNST培養(yǎng)基： KNO30.05%， Na2HPO40.025%，MgSO4·7H2O 0.1%， FeCl30.001%， 微量元素液1 mL/L， 瓊脂2 %， pH 7.2.

(2)M26培養(yǎng)基：馬鈴薯淀粉0.8%，大豆蛋白胨0.2%，葡萄糖 0.2%， 酵母粉0.2%， MgSO40.1%，CaCl20.1%， EDTA-Fe3+1 mL/L， pH 7.2.

(3)發(fā)酵培養(yǎng)基：馬鈴薯淀粉3.9 g/L，脫脂奶粉2.2 g/L，無(wú)水氯化鈣1.3 g/L，葡萄糖1 g/L，豆餅粉1.5 g/L，七水硫酸鎂2.5 g/L，EDTA-Fe3+3 mL/L，微量元素(TE )0.5 mL/L，pH 7.2，樹(shù)脂XAD-16 2% .1×105Pa高壓蒸汽滅菌20 min.

1.1.3 主要試劑與儀器

(1)主要試劑：Epothilone B標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于Singma公司；XAD-16樹(shù)脂購(gòu)于美國(guó)Sigma公司.

(2)儀器： Waters-2487-2420-1525高效液相色譜儀，美國(guó)Waters公司.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)方法

(1)種子培養(yǎng)：將保藏在固體斜面培養(yǎng)基中的菌種接入放有已滅菌濾紙片的CNST平板上，倒置于恒溫培養(yǎng)箱中在30 ℃條件下培養(yǎng)5～7 d后，轉(zhuǎn)接于 M26培養(yǎng)基中，裝液量為50/250 mL三角瓶，在30 ℃、170 r/min的條件下?lián)u床培養(yǎng)72 h后，得到作為發(fā)酵培養(yǎng)的種子液.

(2)發(fā)酵培養(yǎng)：以5%(V/V)接種量將所得種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行搖床培養(yǎng)，發(fā)酵體系為300 mL三角瓶裝液量為50 mL，在30 ℃、170 r/min的條件下?lián)u床培養(yǎng)5 d.

1.2.2 埃博霉素B提取及含量測(cè)定

(1)埃博霉素B提?。喊l(fā)酵結(jié)束后，收集樹(shù)脂，用10倍體積甲醇振蕩浸提24 h后，棄去樹(shù)脂，甲醇浸提液放入真空干燥箱中烘干，再加入500μL甲醇復(fù)溶，轉(zhuǎn)移到離心管中.

(2)埃博霉素B檢測(cè)：采用HPLC定量分析，液相色譜條件為：色譜柱,YWG，C18，10μm，250×4.6 mm；Waters-2487高效液相色譜儀；UV紫外檢測(cè)器；檢測(cè)波長(zhǎng),249 nm;流動(dòng)相,甲醇∶水=65∶35(體積比)；上樣體積,20μL;時(shí)間,30 min;流速,1 mL/min.埃博霉素B的定量采用本實(shí)驗(yàn)室用的標(biāo)準(zhǔn)曲線，方程如下：

Y=0.132X+0.003 5

采用HPLC檢測(cè)埃博霉素B所得的峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算成埃博霉素B產(chǎn)量.

1.2.3 發(fā)酵條件優(yōu)化

(1)單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì).采用單因素試驗(yàn)，分別考察發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH、裝液量、轉(zhuǎn)速、接種量、種齡、溫度和發(fā)酵時(shí)間對(duì)埃博霉素B產(chǎn)量的影響.

(2)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì).在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取部分對(duì)埃博霉素B產(chǎn)量影響較大的因素(初始pH、裝液量、接種量、溫度)進(jìn)一步進(jìn)行發(fā)酵條件的優(yōu)化，每個(gè)因素設(shè)定三個(gè)水平，采用四因素三水平正交設(shè)計(jì)L9(34)進(jìn)行試驗(yàn).正交試驗(yàn)因子與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1.

表1 正交試驗(yàn)因子與水平設(shè)計(jì)

2 結(jié)果與討論

2.1 不同單因素對(duì)埃博霉素B發(fā)酵產(chǎn)量的影響

2.1.1 培養(yǎng)基初始pH對(duì)埃博霉素B產(chǎn)量的影響

pH是影響微生物正常生理活動(dòng)的一個(gè)重要指標(biāo)[13]，纖維堆囊菌培養(yǎng)的pH范圍是中性的，為了確定菌株發(fā)酵產(chǎn)埃博霉素B的最佳pH，選擇了初始pH為5.0、5.8、6.6、7.4、8.2的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行試驗(yàn)，其他培養(yǎng)條件保持不變，即種齡為72 h，接種量5%(V/V)，裝液量為50 mL /250 mL，在30 ℃、170 r/min的條件下?lián)u床培養(yǎng)5 d.試驗(yàn)結(jié)果如圖1所示.分析可知，在發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH為7.4時(shí)，埃博霉素B產(chǎn)量達(dá)到最大值為28.02 mg/L.

圖1 培養(yǎng)基初始pH對(duì)埃博 霉素B產(chǎn)量的影響

2.1.2 裝液量對(duì)埃博霉素B產(chǎn)量的影響

在微生物發(fā)酵過(guò)程中，控制溶氧，滿足生產(chǎn)菌對(duì)養(yǎng)分的需求，是提高發(fā)酵水平的關(guān)鍵因素之一[14].搖瓶發(fā)酵時(shí)，培養(yǎng)基的裝液量與搖床轉(zhuǎn)速基本可以反映溶氧水平.在初始pH 7.4、轉(zhuǎn)速170 r/min、種齡為72 h、接種量5%(V/V)、溫度30 ℃、發(fā)酵時(shí)間為5 d的條件下，本次試驗(yàn)通過(guò)改變250 mL搖瓶裝液量，研究不同裝液量對(duì)埃博霉素B發(fā)酵產(chǎn)量的影響.實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2.結(jié)果顯示，裝液量對(duì)埃博霉素B產(chǎn)量影響顯著，裝液量為20 mL時(shí)，雖然溶解氧量充足，但由于養(yǎng)分不足，菌體生長(zhǎng)緩慢，導(dǎo)致埃博霉素B產(chǎn)量較低.隨著裝液量增加，養(yǎng)分充足，埃博霉素B產(chǎn)量開(kāi)始增加，裝液量增加到50 mL時(shí)，產(chǎn)量達(dá)到最大為28.53 mg/L.繼續(xù)增加裝液量，由于溶解氧不足，菌體生長(zhǎng)受限制，發(fā)酵產(chǎn)量開(kāi)始下降.故選取50 mL為最適裝液量.

圖2 裝液量對(duì)埃博霉素B產(chǎn)量的影響

2.1.3 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)埃博霉素B產(chǎn)量的影響

搖床轉(zhuǎn)速同樣影響發(fā)酵液中氧氣的溶解量.在初始pH為7.4、裝液量為50/250 mL、種齡為72 h、接種量5%(V/V)、溫度30 ℃、發(fā)酵時(shí)間為5 d的條件下，改變轉(zhuǎn)速(140 r/min、160 r/min、180 r/min、200 r/min、220 r/min)，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng).發(fā)酵結(jié)束后進(jìn)行埃博霉素B檢測(cè)，結(jié)果如圖3所示.經(jīng)分析可知，當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速較低時(shí)，發(fā)酵液中溶解氧量不足，不利于菌體生長(zhǎng)，導(dǎo)致埃博霉素B發(fā)酵產(chǎn)量較低，當(dāng)轉(zhuǎn)速達(dá)到200 r/min時(shí)，產(chǎn)量達(dá)到最大值為29.81 mg/L.隨著轉(zhuǎn)速繼續(xù)升高，發(fā)酵產(chǎn)量開(kāi)始下降，可能是由于轉(zhuǎn)速過(guò)高，使部分菌受到破壞，從而使發(fā)酵產(chǎn)量下降.所以選取200 r/min為搖床轉(zhuǎn)速的最優(yōu)值.

圖3 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)埃博霉素B產(chǎn)量的影響

2.1.4 種齡對(duì)埃博霉素B產(chǎn)量的影響

在發(fā)酵過(guò)程中，種齡能夠影響種子的質(zhì)量及接入發(fā)酵培養(yǎng)基的效果，生命力旺盛的種子有利于菌體生長(zhǎng)，老化的種子不利于菌體的生長(zhǎng)繁殖，會(huì)影響菌株發(fā)酵產(chǎn)量.在初始pH為7.4、裝液量為50/250 mL、轉(zhuǎn)速為200 r/min、接種量為5%(V/V)、溫度為30 ℃、發(fā)酵時(shí)間為5 d的條件下，本試驗(yàn)選取不同種齡的種子進(jìn)行搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖4.經(jīng)分析可知，種齡在36～60 h變化時(shí)，埃博霉素B產(chǎn)量隨之增加，在60 h時(shí)，達(dá)到最大值為30.16 mg/L.種齡繼續(xù)增大，埃博霉素B產(chǎn)量先緩慢下降，然后迅速降低.故最適種齡為60 h.

圖4 種齡對(duì)埃博霉素B產(chǎn)量的影響

2.1.5 接種量對(duì)埃博霉素B產(chǎn)量的影響

在抗生素發(fā)酵過(guò)程中，采用較大的接種量可以縮短菌體增殖時(shí)間，提高抗生素產(chǎn)量.但是接種量過(guò)大會(huì)使菌體生長(zhǎng)過(guò)快，造成營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)缺乏或溶氧不足，影響抗生素的合成.為了提高埃博霉素B產(chǎn)量，必須選擇合適的接種量.在初始pH為7.4、裝液量為50/250 mL、轉(zhuǎn)速為200 r/min、種齡為60 h、溫度為30 ℃、發(fā)酵時(shí)間為5 d的條件下，研究不同接種量對(duì)埃博霉素B產(chǎn)量的影響.由圖5可知，當(dāng)接種量為2%時(shí)，由于菌體數(shù)量限制使得埃博霉素B產(chǎn)量較低，隨著接種量增大，產(chǎn)量緩慢增加，當(dāng)接種量為8%時(shí)，產(chǎn)量達(dá)到最大值為30.63 mg/L.接種量繼續(xù)增大，產(chǎn)量卻隨之降低.因此本試驗(yàn)選取8%為最適接種量.

圖5 接種量對(duì)埃博霉素B產(chǎn)量的影響

2.1.6 溫度對(duì)埃博霉素B產(chǎn)量的影響

在初始pH為7.4、裝液量為50/250 mL、轉(zhuǎn)速為200 r/min、種齡為60 h、接種量為8%(V/V)、發(fā)酵時(shí)間為5 d的條件下，研究不同溫度對(duì)埃博霉素B產(chǎn)量的影響.由圖6可知，低溫不利于纖維堆囊菌發(fā)酵產(chǎn)埃博霉素B，隨著溫度升高，菌體代謝加快，埃博霉素B產(chǎn)量大幅度提高，當(dāng)溫度達(dá)到30 ℃時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)量最高為30.15 mg/L.隨著溫度繼續(xù)升高，產(chǎn)量卻大幅度降低，故最適溫度為30 ℃.

圖6 溫度對(duì)埃博霉素B產(chǎn)量的影響

2.1.7 發(fā)酵時(shí)間對(duì)埃博霉素B產(chǎn)量的影響

埃博霉素B為纖維堆囊菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物，穩(wěn)定期開(kāi)始大量積累，同時(shí)接種量也對(duì)發(fā)酵時(shí)間有一定的影響.本次試驗(yàn)在初始pH為7.4、裝液量為50/250 mL、轉(zhuǎn)速為200 r/min、種齡為60 h、接種量為8%(V/V)、溫度為30 ℃的條件下，進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，分別培養(yǎng)3、4、5、6、7 d后進(jìn)行埃博霉素B檢測(cè)，試驗(yàn)結(jié)果如圖7.結(jié)果分析可知，發(fā)酵時(shí)間為6 d時(shí)，埃博霉素B產(chǎn)量達(dá)到最高31.28 mg/L.繼續(xù)增加培養(yǎng)時(shí)間，產(chǎn)量基本保持不變，故最適發(fā)酵時(shí)間為6 d.

圖7 發(fā)酵時(shí)間對(duì)埃博霉素B產(chǎn)量的影響

2.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)上述單因素試驗(yàn)結(jié)果，初始pH、裝液量、接種量、溫度對(duì)纖維堆囊菌發(fā)酵產(chǎn)埃博霉素B的影響較大，將這4個(gè)因素進(jìn)一步通過(guò)四因素三水平L9(34)正交試驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化，得到最優(yōu)組合.正交試驗(yàn)結(jié)果以及直觀分析結(jié)果見(jiàn)表2.

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

由表2可知，RA>RD>RB>RC，即選取的4個(gè)因素對(duì)埃博霉素B產(chǎn)量影響的主次關(guān)系為：初始pH>溫度>裝液量>接種量，表明發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH對(duì)埃博霉素B發(fā)酵產(chǎn)量影響最為顯著，最不顯著的影響因子為接種量.此外從表中還可以看出發(fā)酵條件的最優(yōu)組合為：A2B2C3D2，即初始pH為7.4，裝液量為50 mL/250 mL，接種量為10%，溫度為30 ℃.由于正交試驗(yàn)表中沒(méi)有符合此發(fā)酵條件的方案，所以按照上述得到的最優(yōu)發(fā)酵條件做驗(yàn)證試驗(yàn).

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

在上述所得到的最優(yōu)發(fā)酵條件下進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，同時(shí)將優(yōu)化前的發(fā)酵條件即在初始pH為7.2、種齡為72 h、接種量5%(V/V)、裝液量為50 mL/300 mL、溫度30 ℃、轉(zhuǎn)速170 r/min、發(fā)酵時(shí)間5 d的條件下作為對(duì)照.試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3.由表3可知，最優(yōu)發(fā)酵條件下埃博霉素B的產(chǎn)量為35.24 mg/L，與優(yōu)化前(29.95 mg/L)相比產(chǎn)量提高了17.67%.

表3 驗(yàn)證試驗(yàn)

3 結(jié)論

纖維堆囊菌易受菌體本身以及環(huán)境條件的影響，進(jìn)而影響菌體的生物合成能力.為了提高埃博霉素B的產(chǎn)量，以降低生產(chǎn)成本，本試驗(yàn)在前期優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化.首先采用單因素試驗(yàn)考察初始pH、裝液量、轉(zhuǎn)速、種齡、接種量、溫度、發(fā)酵周期7個(gè)因素對(duì)埃博霉素B產(chǎn)量的影響，得到各因子的最優(yōu)水平.在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，將對(duì)埃博霉素B影響較大的因素(初始pH、裝液量、接種量、溫度)進(jìn)一步進(jìn)行正交試驗(yàn)，得到最優(yōu)組合.最終確定最優(yōu)發(fā)酵條件為:初始pH7.4、裝液量50 mL、轉(zhuǎn)速200 r/min、種齡60 h、接種量10%、溫度30 ℃、發(fā)酵周期6 d.在此最優(yōu)條件下進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，埃博霉素B產(chǎn)量達(dá)到35.24 mg/L，比優(yōu)化前(29.95 mg/L)提高了17.67%.

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