楊秀芳， 王改利， 馬養(yǎng)民， 張 鑫， 劉建軍

(1.陜西科技大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院 教育部輕化工助劑化學(xué)與技術(shù)重點實驗室， 陜西 西安 710021; 2.西北農(nóng)林科技大學(xué) 林學(xué)院， 陜西 楊凌 712100)

0 引言

水楊梅(Geumaleppicum)為薔薇科(Rosaceae)水楊梅屬多年生草本植物，主要分布于我國西北、華北、東北、西南等地區(qū)[1].作為傳統(tǒng)中藥，民間以其全草或根入藥，具有清熱解毒、利尿、消腫止痛之功效[2].水楊梅的化學(xué)成分主要有三萜、黃酮、鞣質(zhì)[3-5]，該類化合物主要用于抗HIV(艾滋病毒)活性、抗HSV(皰疹病毒)活性[6，7].1994年，McCutcheon AR等[8]報道了水楊梅屬植物GeummacrophyllumWilld. var.macrophyllum的甲醇提取物具有抑制微生物生長的作用.其同屬近緣植物Geumrivale也顯示出抗微生物的活性[9]，結(jié)果表明其中的三萜類成分活性最強，其次為黃酮類和鞣質(zhì)類成分.為了進一步研究水楊梅化學(xué)成分的活性作用，本文首次對從水楊梅分離純化得到的化合物的抑菌活性和抗氧化活性進行研究，并分析其構(gòu)效關(guān)系，期望從中獲得抑菌活性或抗氧化活性好的化合物，為進一步開發(fā)利用水楊梅植物資源提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

從水楊梅中分離純化得到的β-谷甾醇、熊果酸、山奈酚、槲皮素、山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷和胡蘿卜苷[10]；從其它植物樣品中提取分離到的芹菜素、木犀草素、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷[11].

1.1.2 供試菌種

細菌5株：大腸桿菌(Esherichiacoli)、綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa)、乳鏈球菌(Streptococcuslactis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草芽孢桿菌(Bacilussubtilis)；

1.1.3 培養(yǎng)基

牛肉膏0.5 g，蛋白胨1.0 g，NaCl 0.5 g，瓊脂2.0 g，水100 mL，pH7.0～7.2，121 ℃滅菌20 min.

1.2 儀器

SW-CJ-1FD超凈工作臺(上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)、YX280B手提式壓力蒸汽滅菌鍋(上海三申醫(yī)療器械有限公司)、DH5000B電熱恒溫培養(yǎng)箱(天津市泰斯特儀器有限公司)、HZQ-Q全溫振蕩器(哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司)、DNM-9602A型酶標(biāo)分析儀(北京普朗新技術(shù)有限公司).

1.3 實驗方法

1.3.1 菌懸液制備

將在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)的大腸桿菌(E.c)、綠膿桿菌(P.a)、乳鏈球菌(S.l)金黃色葡萄球菌(S.a)、枯草芽孢桿菌(B.s)從恒溫培養(yǎng)箱中取出，在滅菌后的超凈工作臺上將以上各菌接種至配制好的液體培養(yǎng)基中，再將接菌后的液體培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至全溫振蕩器，溫度恒定在28 ℃培養(yǎng)48 h，備用.

把高溫滅過菌的培養(yǎng)基倒平板，冷卻凝固，在無菌條件下，用接種環(huán)刮取少許的細菌接種到培養(yǎng)基上，再置于37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中活化培養(yǎng)24 h.挑取少許的活化測試菌菌種放入5 mL無菌水中，搖勻，通過血球計數(shù)板配成含菌106CFU/mL的菌懸液.

1.3.2 試樣制備方法

將從水楊梅中分離純化得到的β-谷甾醇、熊果酸、山奈酚、槲皮素、山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷和胡蘿卜苷，分別稱取0.2 mg，用2 mL二甲基亞砜溶解，配制成濃度為0.1 mg/mL溶液，備用.

精確稱取山奈酚、槲皮素、山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、芹菜素、木犀草素、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷，用乙醇分別配成質(zhì)量濃度為1 000μg/mL的待測樣品1和質(zhì)量濃度為200μg/mL的待測樣品2.同時配制相同濃度的抗壞血酸和BHT乙醇溶液作為對照,備用.

DPPH溶液的配制 準(zhǔn)確稱取DPPH(1，1-二苯基-2-三硝基苯肼)0．020 0 g，無水乙醇溶解定容至100 mL容量瓶，配成濃度為0.200 mg/mL的DPPH乙醇溶液，置于冰箱中冷藏備用.

1.3.3 最小抑菌濃度(MIC)的測定

(1)取紫外消毒的96孔板，豎排依次編號A、B、C、D、E、F、G、H、I，橫排依次編號1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11(編號為A1、 A2、 A3、 A4、 A5、 A6、 A7、A8、A9、A10、A11，B1-B11……H1-H11，I1-I8).選取一種稀釋過的菌懸液，在滅菌的超凈工作臺上，將編好號的96孔板用移液槍全部注入150μL液體培養(yǎng)基.

(2)取配制好的待測β-谷甾醇樣品，用移液槍吸取150μL注入在已有菌懸液的A1孔中混勻.待菌懸液與β-谷甾醇樣品混勻后，再用移液槍從A1孔中吸取混合液體150μL，注入A2孔中混勻.再從A2孔中吸取此混合液體150μL，注入A3孔中.重復(fù)上述操作過程，直到從A11孔中吸取出150μL混合溶液棄掉.A12孔則作為生長對照.經(jīng)過此步操作A1-A11孔中β-谷甾醇樣品濃度則依次倍半稀釋.

(3)按照步驟(2)，將B1-B11注入熊果酸，C1-C11注入山奈酚，D1-D11注入槲皮素，E1-E11注入山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖苷，F(xiàn)1-F11注入槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷，G1-G11注入胡蘿卜苷.H1-H11為陽性對照，革蘭氏陽性菌注入青霉素鈉樣品溶液，革蘭氏陰性菌注入硫酸鏈霉素樣品溶液，I1-I11為空白對照.

(4)向所有板孔中加入10μL一種菌懸液.再取96孔板，按照步驟(1)～(3)把其它4種測試菌與各個待測樣品混合，完成后，將所有96孔板放入培養(yǎng)箱中，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h.

(5)通過肉眼觀察，判定該化合物的最小抑菌濃度(MIC).

1.3.4 抗氧化活性測定(DPPH法)

參考文獻[12-14]的方法并稍加改變，采用倍半稀釋法制備不同濃度待測液.

(1)取96孔板，豎排依次編號A、B、C、D、E、F、G、H，橫排依次編號1-12.將編號的所有孔板用移液槍分別注入100μL無水乙醇.

(2)取配制好的山奈酚待測樣品1，用移液槍吸取100μL注入在已有100μL無水乙醇的A1孔中混勻.從A1孔中吸取混合液體100μL，注入到A2孔中混勻.重復(fù)上述操作，直到最后從A11孔中吸取出100μL混合溶液棄掉，A12孔做空白對照.待測樣品濃度A1-A11依次倍半稀釋.按同樣方法，將B1-B11也注入山奈酚待測樣品1.其余板孔可注入其它待測樣品(如C1-C11和D1-D11為山奈酚待測樣品2；E-H為槲皮素待測樣品1，2)，同時測定.

(3)用移液槍分別吸取100μL配制好的DPPH溶液，加入到A1-A12孔中；分別吸取100μL無水乙醇，加入到B1-B12孔中.室溫下避光35 min，在517 nm波長下酶標(biāo)儀測定各個孔的吸光度.

(4)平行測定3次，按公式計算DPPH自由基清除率(E).

其中，Aj表示100μL不同濃度樣品+100μL的DPPH溶液的吸光度；Ai表示100μL不同濃度樣品+100μL溶劑(無水乙醇)的吸光度；A0表示100μL的DPPH溶液+100μL溶劑(無水乙醇)的吸光度.

(5)以試樣濃度為橫坐標(biāo)，清除率為縱坐標(biāo)，繪制散點圖.選取清除率在20%～80%的點進行線性回歸，并計算清除率為50%時的濃度值，即IC50值.

2 結(jié)果與討論

2.1 化合物的抑菌活性

水楊梅中分離得到的β-谷甾醇(Ⅰ)、熊果酸(Ⅱ)、山奈酚(Ⅲ)、槲皮素(Ⅳ)、山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖苷(Ⅴ)、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷(Ⅵ)和胡蘿卜苷(Ⅶ)的MIC測試結(jié)果見表1.山奈酚對所有測試菌均有不同程度的抑制活性，尤其是對大腸桿菌的最小抑菌濃度達到7.8μg/mL；槲皮素對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度為31.2μg/mL，對其它測試菌為125μg/mL；熊果酸、山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖苷和槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷對所有測試菌的活性均在250μg/mL左右；β-谷甾醇和胡蘿卜苷對綠膿桿菌的最小抑制濃度為250μg/mL，對其它測試菌則未顯示出抑制作用.結(jié)果表明山奈酚具有良好的抑菌作用.

表1 不同化合物對細菌最小抑菌濃度

注：Ⅷ-青霉素鈉，Ⅸ-硫酸鏈霉素,NA-未檢出.

2.2 化合物的抗氧化活性

通過DPPH法，按照1.3.4，測試不同化合物的抗氧化能力，結(jié)果見表2.

通過測定不同質(zhì)量濃度的山奈酚、槲皮素、山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷以及芹菜素、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷對DPPH自由基清除率，并計算得各化合物的IC50值.發(fā)現(xiàn)：這些黃酮類化合物的抗氧化能力由強到弱排序為槲皮素>槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷>山奈酚>木犀草素>木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷>山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖苷>芹菜素>芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷.

表2 各化合物抗氧化能力的IC50值

2.3 黃酮類化合物抗氧化能力的構(gòu)效關(guān)系

黃酮類化合物主要泛指2個苯環(huán)(A與B環(huán))通過中央三碳鏈相互連結(jié)而成的一系列化合物[15].對比各黃酮類化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)以及實驗測定結(jié)果(見表3)可以發(fā)現(xiàn)有以下構(gòu)效關(guān)系：

(1)酚羥基多，活性強，五羥基黃酮槲皮素>四羥基黃酮山奈酚和木犀草素>三羥基黃酮芹菜素.

(2)黃酮醇大于黃酮.山奈酚、槲皮素優(yōu)于芹菜素和木犀草素，特別是同為四羥基的山奈酚要大于木犀草素.

(3)B環(huán)酚羥基活性高于A環(huán)，且鄰二酚羥基最為明顯.木犀草素糖苷為A環(huán)一個羥基，B環(huán)兩個羥基，其活性大于A環(huán)兩個羥基，B環(huán)一個羥基的山奈酚糖苷.

(4)苷元的活性大于糖苷，各個黃酮苷與其苷元均是如此.

表3 黃酮類化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)及IC50值

續(xù)表3

化學(xué)結(jié)構(gòu)化合物IC50/(μg/ml)OH 57 HOOOR33'4'OHE R=OHF R=OGlc山奈酚E山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖苷F28.68358.25OH 57 HOOOR3OH 3'4'OHG R=OHH R=OGlc槲皮素G槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷H21.1628.62

3 結(jié)論

(1)水楊梅中含有豐富的具有生物活性的物質(zhì).分離純化得到的系列化合物(β-谷甾醇、熊果酸、山奈酚、槲皮素、山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷和胡蘿卜苷)對細菌均有不同的抗菌活性.相比之下，山奈酚的抑菌活性最好，對革蘭氏陽性菌和陰性菌都具有較好的活性；槲皮素的活性較山奈酚相對弱些；黃酮苷和三萜類的熊果酸對所有測試菌的活性都不強；β-谷甾醇和胡蘿卜苷這類甾體化合物基本沒有抑菌活性.

(2)黃酮類化合物因結(jié)構(gòu)不同而具有不同的抗氧化能力.從水楊梅中分離得到的黃酮醇類化合物具有良好的抗氧化性，可以作為天然的抗氧化劑植物原料開發(fā)利用.

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