胡馨月，張維，趙行，李若敏，周振，胡圣男，盤(pán)賽昆，2，3，4*

（1.江蘇海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 連云港 222005；2.江蘇海洋大學(xué)江蘇省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)建設(shè)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 連云港 222005；3.江蘇海洋大學(xué)江蘇省海洋生物資源與環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 連云港 222005；4.江蘇海洋大學(xué)江蘇省海洋資源開(kāi)發(fā)研究院，江蘇 連云港 222005）

滸苔（Enteromorpha spp.），俗稱苔條，屬于綠藻門(mén)、綠藻綱、石莼目、石莼科滸苔屬藻類植物，主要成分是多糖類和粗纖維，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富，具有獨(dú)特的風(fēng)味，深受消費(fèi)者的喜愛(ài)[1-2]，目前已廣泛應(yīng)用于食品、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥等行業(yè)[3-4]。多糖（polysaccharides）是由單糖通過(guò)糖苷鍵以線性或分支的方式連接而成，是構(gòu)成生命活動(dòng)的重要大分子化合物[5]，具有多種生理活性[6]，如抗腫瘤、抗病毒、抗氧化和增強(qiáng)免疫力等[7-8]。

低聚糖（oligosaccharides）是由少數(shù)分子的單糖（2個(gè)～10 個(gè)）縮合而形成的，又稱寡糖[9]，具有降血糖、調(diào)節(jié)腸道菌群、增強(qiáng)免疫力、抗氧化等生物活性。 其結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、分子量較小，具有低熱量、穩(wěn)定性好、無(wú)毒等良好的特性，在對(duì)人體的免疫性及預(yù)防疾病等方面發(fā)揮重要作用[10]。 低聚糖還具有很好的抗氧化性[11]，在保護(hù)水果風(fēng)味、色澤及維生素方面十分有利。 低聚糖普遍存在于自然界，主要來(lái)源于植物，通常以天然植物多糖進(jìn)行降解得到。 低聚糖制備方法有酶解、酸解、物理降解、酶縮合等[12-14]。 酸解法是最簡(jiǎn)單有效的一種降解方法，糖苷鍵容易在酸性條件下斷裂，從而將多糖大分子裂解為不同聚合度的分子片段。 控制酸的濃度、反應(yīng)時(shí)間和溫度，可調(diào)整多糖降解的程度，從而得到目標(biāo)分子量的寡糖混合物[15]。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)滸苔低聚糖的研究較少，本文研究一種適合滸苔多糖水解成具有抗氧化性的低聚糖的制備工藝，以羥自由基清除率為指標(biāo)，通過(guò)單因素試驗(yàn)確定多糖酸水解適宜條件，采用響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化水解工藝，為滸苔低聚糖的開(kāi)發(fā)和利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

滸苔（Enteromorpha prolifera）：市售。

纖維素酶（8×104U/g）：張家港金源生物化工有限公司；酒石酸鉀鈉、苯酚、3，5 二硝基水楊酸、正丁醇、鐵氰化鉀：分析純，南京化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AF-O6A 新型密封式粉碎機(jī)： 奧力中藥機(jī)械有限公司；ZNC-701 超微粉碎機(jī)： 北京興時(shí)利和發(fā)展有限公司；752N 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)： 上海奧普勒儀器有限公司；SevenEasy pH 計(jì)： 梅特勒-托利多儀器有限公司；ENCL-G-3 恒溫磁力攪拌器：上海易研實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 原材料處理

滸苔→自來(lái)水洗凈→電熱鼓風(fēng)干燥箱烘干4 h→密封式粉碎機(jī)粉碎→過(guò)80 目篩→超微粉碎機(jī)粉碎→滸苔粉

1.3.2 纖維素酶輔助提取多糖

滸苔粉→加水[料液比1∶15（g/mL）]→調(diào)pH 值至4.5→加入纖維素酶攪勻→45 ℃保溫6 h→加水調(diào)pH值至9→80 ℃保溫5 h→離心（4 000 r/min，15 min）→取上清液→Sevag 法脫蛋白[16]→離心→取上清液→濃縮→加無(wú)水乙醇→冷藏過(guò)夜→離心取沉淀→真空干燥→滸苔多糖聚糖水解液

1.3.3 單因素試驗(yàn)

參考文獻(xiàn)[17]，以葡萄糖當(dāng)量（dextrose equivalent，DE）值和羥自由基清除率為指標(biāo)，考察料液比、溫度、時(shí)間、鹽酸濃度對(duì)滸苔多糖酸水解的影響。 試驗(yàn)設(shè)計(jì)為：料液比1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60（g/mL），溫度60、65、70、75、80 ℃，時(shí)間1、2、3、4、5 h，鹽酸濃度0、0.5、1、1.5、2 mol/L，每組重復(fù)3 次。

1.3.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用Design-Expert8.0.6 軟件系統(tǒng)的Box-Behnken 中心試驗(yàn)組合設(shè)計(jì)模塊，以料液比、溫度、鹽酸濃度3 個(gè)因素為自變量，羥自由基清除率為因變量，采用三因素三水平優(yōu)化滸苔抗氧化的條件，因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.3.5 指標(biāo)測(cè)定

1.3.5.1 多糖含量的測(cè)定

采用蒽酮-硫酸法[18]測(cè)定多糖含量，吸取1 mL滸苔上清液于50 mL 容量瓶稀釋，吸取稀釋液2 mL，測(cè)定吸光度，根據(jù)樣品溶液的吸光度查標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)得含糖量，按式（1）計(jì)算。

式中：c 為從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的糖濃度，mg/mL；V樣液總為上清液總體積，mL；V1為測(cè)定時(shí)取用體積，mL；m 為樣品質(zhì)量，mg。

1.3.5.2 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

采用Bradford 法[16]測(cè)定多糖粗提液中蛋白質(zhì)，取3支10 mL 具塞試管，各吸取滸苔上清液0.1 mL 和蒸餾水0.9 mL，加入5 mL 考馬斯亮藍(lán)G-250 蛋白試劑，充分混勻， 放置2 min 后用1 cm 比色皿在595 nm 下比色，記錄吸光值A(chǔ)595nm，以蒸餾水試管作空白，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線查得待測(cè)樣品上清液中蛋白質(zhì)含量（μg）。

1.3.5.3 還原糖含量的測(cè)定

還原糖(以葡萄糖計(jì))測(cè)定：參考文獻(xiàn)[19]的3，5-二硝基水楊酸（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）法進(jìn)行。DE值[20]：又叫葡萄糖當(dāng)量值，是還原糖（以葡萄糖計(jì)）占溶液中干物質(zhì)的百分比。 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算樣品中還原糖含量，按式（2）計(jì)算。

式中：c 為查標(biāo)準(zhǔn)曲線得到水解液中還原糖濃度，mg/mL；d 為稀釋倍數(shù)；m 為樣品質(zhì)量，mg；v 為溶解樣品的蒸餾水體積，mL。

1.3.5.4 抗氧化活性檢測(cè)

采用水楊酸法，參照文獻(xiàn)[21]的方法，測(cè)定羥自由基的清除能力（scavenging activity，SA），用%表示，按式（3）計(jì)算。

式中：A0為空白對(duì)照液的吸光值；Am為加入多糖后的吸光值；An為不加H2O2時(shí)多糖的吸光值。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Origin 2018 軟件作圖；響應(yīng)曲面分析結(jié)果用Design-Expert 8.0 軟件進(jìn)行優(yōu)化及分析；采用SPSS 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，蒽酮-硫酸法測(cè)得的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1，回歸方程為：y=10.321x+0.007 9，R2=0.999 2。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of glucose

2.2 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線

以牛血清蛋白（bovine albumin，BSA）為標(biāo)準(zhǔn)，所得蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2， 回歸方程為y=0.008 2x+0.015 4，R2=0.998 9。

圖2 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Protein standard curve

2.3 還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

采用DNS 法測(cè)定還原糖量，所得還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3，回歸方程為y=0.582 7x-0.014 7，R2=0.999 1。 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出樣品還原糖濃度，根據(jù)公式計(jì)算DE 值。

圖3 還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Sugar standard curve

2.4 酸水解單因素試驗(yàn)

2.4.1 料液比對(duì)多糖酸水解的影響

料液比對(duì)多糖酸水解的影響見(jiàn)圖4。

圖4 料液比對(duì)多糖酸水解的影響Fig.4 Effect of solid-liquid ratio of acid hydrolysis of polysaccharides

如圖4 所示， 隨著溶劑體積的增加，DE 值和SA值呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)；料液比為1∶40（g/mL）時(shí)，DE 值和SA 值達(dá)到最大，之后呈下降趨勢(shì)[10]。 故選擇料液比為1∶40（g/mL）進(jìn)行下一步的響應(yīng)面試驗(yàn)。

2.4.2 溫度對(duì)多糖酸水解的影響

溫度對(duì)多糖酸水解的影響見(jiàn)圖5。

圖5 溫度對(duì)多糖酸水解的影響Fig.5 Effect of temperature on acid hydrolysis of polysaccharides

如圖5 所示， 隨著水解溫度的升高，DE 值和SA值呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)， 在水解溫度為70 ℃時(shí)，DE 值和SA 值達(dá)到最高； 隨著水解溫度不斷升高，DE 值和SA值呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。 這是由于溫度過(guò)高引起多糖的降解，溫度是反應(yīng)的重要參數(shù)，較高的反應(yīng)溫度利于反應(yīng)的進(jìn)行， 但是生成低聚糖是多糖水解的中間階段，水解反應(yīng)的最終結(jié)果是生成單糖。 制備低聚糖一般需要降低溫度，使水解反應(yīng)溫和進(jìn)行，盡量減少單糖的產(chǎn)生[9]。 故選擇水解溫度為70 ℃進(jìn)行下一步的響應(yīng)面試驗(yàn)。

2.4.3 時(shí)間對(duì)多糖酸水解的影響

時(shí)間對(duì)多糖酸水解的影響見(jiàn)圖6。

圖6 時(shí)間對(duì)多糖酸水解的影響Fig.6 Effect of the extract time on the acid hydrolysis of polysaccharides

如圖6 所示，隨著水解時(shí)間的延長(zhǎng)，DE 值和SA 值呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)；在水解時(shí)間為2 h 時(shí)，達(dá)到最高。 時(shí)間少于2 h 時(shí)，反應(yīng)不充分，DE 值和SA 值較低；但隨著水解時(shí)間不斷增加， 低聚糖在酸催化下繼續(xù)酸解為單糖，導(dǎo)致DE 值呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)[5，10]。 方差分析表明，時(shí)間的變化對(duì)SA 值無(wú)顯著性影響。

2.4.4 鹽酸濃度對(duì)多糖酸水解的影響

鹽酸濃度對(duì)多糖酸水解的影響見(jiàn)圖7。

鹽酸常用于酸解制備低聚糖，易去除、易揮發(fā)、價(jià)格低廉[22]。如圖7 所示，隨著鹽酸濃度的升高，DE 值和SA 值呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)； 在鹽酸濃度為1 mol/L 時(shí)，DE值和SA 值達(dá)到最高。 隨著鹽酸濃度不斷升高，DE 值呈現(xiàn)平緩的趨勢(shì)。 考慮到成本和環(huán)境污染的問(wèn)題，故選擇鹽酸濃度為1 mol/L 進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

圖7 鹽酸濃度對(duì)多糖酸水解的影響Fig.7 Effect of concentration of hydrochloric acid to acid hydrolysis of polysaccharides

2.5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.5.1 模型方程建立與分析

通過(guò)對(duì)單因素試驗(yàn)結(jié)果的方差分析，篩選出對(duì)指標(biāo)有顯著影響的因素， 并確定其條件范圍。 運(yùn)用Design-Expert8.0.6 軟件系統(tǒng)的Box-Behnken 模塊進(jìn)行中心試驗(yàn)組合設(shè)計(jì)，試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Response surface and results

將表2 中滸苔羥自由基清除率對(duì)自變量料液比、溫度、鹽酸濃度進(jìn)行回歸擬合后，得到的回歸方程：羥自由基清除率（SA）/%=78.45-1.61A-0.59B+9.29C-28.45A2-8.54B2-11.25C2+2.54AB+1.70AC+3.46BC。 對(duì)模型進(jìn)行方差分析，如表3 所示。

表3 模型回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果和方差結(jié)果分析Table 3 Regression coefficient significance test results and the results of analysis of variance

模型P<0.01，具有極顯著性，失擬項(xiàng)P=0.61，大于0.05，失擬項(xiàng)不顯著，表明未知因素對(duì)響應(yīng)值的影響較小，R2=0.897，表明該模型具有良好的擬合度。 對(duì)回歸模型進(jìn)行分析，在該模型下自變量C 對(duì)羥自由基清除率影響顯著。 從F 值可以得出：C＞A＞B，即鹽酸濃度＞料液比＞溫度。

2.5.2 響應(yīng)面分析

根據(jù)響應(yīng)面選擇的回歸模型繪制響應(yīng)面圖，見(jiàn)圖8。

如圖8 所示， 等高線的形狀表示兩因素之間的影響強(qiáng)弱，橢圓表示兩因素交互作用較強(qiáng)，圓則代表較弱[22]。 綜合看出，隨著溶劑量的增多，多糖酸水解后的羥自由基清除率不斷升高，但是羥自由基清除率達(dá)到最大后繼續(xù)增加溶劑的量， 羥自由基清除率會(huì)下降；隨著溫度的升高，多糖酸水解后的羥自由基清除率不斷升高，但是隨著濃度的不斷升高，羥自由基清除率會(huì)下降；隨著鹽酸濃度的不斷升高，多糖酸水解后的羥自由基清除率不斷升高， 但是隨著鹽酸濃度的不斷升高，羥自由基清除率會(huì)下降。 對(duì)回歸模型進(jìn)行數(shù)學(xué)分析，得到多糖酸水解最佳條件為料液比1∶39.7（g/mL）、溫度為69.7 ℃、鹽酸濃度為1.41 mol/L，在此條件下羥自由基清除率為80.40%。

圖8 各因素交互作用的響應(yīng)面圖Fig.8 Response surface diagram of interaction of various factors

2.5.3 工藝驗(yàn)證

結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)需要， 將工藝調(diào)整為料液比1∶40（g/mL）、溫度70 ℃、鹽酸濃度1.4 mol/L、時(shí)間2 h，在此條件下測(cè)出羥自由基清除率分別為78.81%、80.22%、80.27%，平均值為（79.76±0.82）%，與預(yù)測(cè)值相差很小。

3 結(jié)論

本文以滸苔為研究對(duì)象，采取纖維素酶輔助提取滸苔粗多糖，通過(guò)酸水解提取低聚糖，結(jié)果表明滸苔低聚糖具有良好的抗氧化能力。 通過(guò)回歸模型的分析，以羥自由基清除率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，經(jīng)優(yōu)化工藝為料液比1∶40（g/mL）、溫度為70 ℃、鹽酸濃度為1.4 mol/L，羥自由基清除率模型預(yù)測(cè)為80.4%，實(shí)測(cè)值為（79.76±0.82）%，說(shuō)明響應(yīng)面優(yōu)化所得到的工藝可靠，具有實(shí)用價(jià)值，為滸苔資源的綜合利用提供參考。