沈大戰(zhàn)，黃均，周榮清，2*

（1.四川大學(xué)輕工科學(xué)與工程學(xué)院，四川 成都 610065；2.制革清潔技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610065）

蠶蛹是蠶絲業(yè)的主要伴生產(chǎn)物，除18 種氨基酸組成比例符合營養(yǎng)最佳的組合模式[1-3]外，還有多種重要生理功能（如健脾、安神、益精、壯陽等），自古以來就在許多亞洲國家被廣泛使用[4-9]，在20 多年前就已被衛(wèi)生部納入食品資源。 蠶蛹水解物中必需氨基酸含量高達(dá)40%，因此蠶蛹蛋白精深加工技術(shù)研究開發(fā)及產(chǎn)物的應(yīng)用在國內(nèi)外被廣泛關(guān)注[10]。蠶蛹水解物[11-12]具有較強(qiáng)的清除自由基的能力，對DPPH 自由基、超氧陰離子自由基和羥自由基的清除率分別可達(dá)到90.19%、24.79%和37.07%。 基于酶促作用是解決蠶蛹蛋白致敏風(fēng)險的有效措施[13]，吳文湧等[14]建立了中性蛋白酶酶促水解蠶蛹工藝條件。 目前雖然有很多酶促水解蠶蛹蛋白的工藝，但迄今鮮見基于固態(tài)發(fā)酵方式制備蠶蛹多肽的研究。

本文以米曲霉（Aspergillus orzyae）為對象，探討了水解溫度、時間及加酶量等參數(shù)對脫脂蠶蛹蛋白粉水解度影響，并通過正交試驗(yàn)優(yōu)化全細(xì)胞固態(tài)培養(yǎng)降解蠶蛹蛋白的條件，并對分離純化后的多肽抗氧化性能進(jìn)行研究，為開發(fā)無臭蠶蛹蛋白肽生產(chǎn)技術(shù)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 原料與試劑

米曲霉（Aspergillu orzyae）：上海迪發(fā)釀造生物制品有限公司；脫脂蠶蛹粉：成都世煌生物科技有限責(zé)任公司；麩皮：成都牧山食品有限公司。

Sephadex G-25 凝膠樹脂、DPPH： 美國Sigma 公司；焦性沒食子酸、VC、VE、牛血清清蛋白（bovine albumin，BSA）、硫酸銅、硫酸鉀、酒石酸鉀鈉、三氯乙酸、甲醛（分析純）：四川蜀都化學(xué)試劑公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GL-20G-C 高速冷凍離心機(jī)： 上海安亭科學(xué)儀器有限公司；ST3100/F pH 計：上海奧豪斯儀器有限公司；FW100 高速萬能粉碎機(jī)：天津市泰斯特試驗(yàn)設(shè)備有限公司；FDZF-6030A 真空冷凍干燥箱： 上海博迅公司；Sephadex LH-20 葡聚糖凝膠柱層析柱（1.8 cm×25 cm）、HL-2 恒流泵、BSZ-100 自動部分收集器： 上海滬西分析儀器廠；RLPHR1-4 LSC 型冷凍干燥機(jī)：CHRIST公司。

1.3 方法

1.3.1 試驗(yàn)方法

蠶蛹粉和麩皮充分混勻后加入90%蒸餾水，121 ℃滅菌30 min。 接種1%米曲霉孢子，48 h 后倒瓶培養(yǎng)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，加入90%的生理鹽水進(jìn)行發(fā)酵，分別測定發(fā)酵產(chǎn)物水解度、多肽得率。

1.3.2 測定方法

1.3.2.1 酶活力測定

福林酚法測定中性蛋白酶酶活力[15]。

1.3.2.2 多肽得率的測定

稱取1.00 g 發(fā)酵底物， 用研缽研磨5 min 后定容50 mL，靜置30 min 后10 000 r/min 離心5 min，取10 mL濾液加入10 mL 10%三氯乙酸溶液靜置沉淀30 min，10 000 r/min 離心5 min。 取1mL 上清液用雙縮脲法測定多肽得率[16-17]。

1.3.2.3 水解度測定方法

采用pH-state 法[18]用下式計算水解度，此處水解度的含義為水解打斷的肽鍵數(shù)目占原料蛋白質(zhì)中總肽鍵數(shù)的百分?jǐn)?shù)。

水解度/%=（C×V）/（α×mp×htot）×100

式中：C、V 分別為水解過程中所加NaOH 的濃度（mol/L）和體積（mL）；mp為原料中蛋白質(zhì)質(zhì)量g；htot為1 g 原料蛋白質(zhì)中所含肽鍵的毫摩爾數(shù)，取為7.8 mmol/g 蛋白；α 為氨基的平均解離度，可按α=（10pH-pK）/（1+10pH-pK）（pH 為水解溶液的pH 值；pK 為α-氨基的解離度的負(fù)對數(shù)，此處取值為7.0）。

1.3.3 蠶蛹多肽工藝的優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以水解溫度、水解時間、加酶量為正交試驗(yàn)的影響因素，以多肽得率和水解度為評價指標(biāo)，采用L9（33）正交設(shè)計確定米曲霉水解蠶蛹蛋白制備多肽的最佳工藝。 正交試驗(yàn)因素和水平見表1。

表1 蠶蛹水解工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for technology optimization of silkworm pupa meal

1.3.4 多肽純化

1.3.4.1 多肽純化方法

將多肽提取液過濾后用Sephadex G-25 葡聚糖凝膠樹脂進(jìn)行純化，在上樣濃度0.6 mg/mL、上樣量1 mL的條件下，用流速為1.2 mL/min 的去離子水進(jìn)行洗脫，并在檢測波長為280 nm 的條件下，收集洗脫后的純化多肽樣品， 用冷凍干燥器將純化多肽制備為粉末，并配制不同濃度多肽溶液進(jìn)行抗氧化性能測定[19]。

1.3.4.2 純化多肽抗氧化性能力測定

1）DPPH 自由基清除能力的測定

DPPH 自由基清除能力的測定參照Atoui 等[20]的方法。 按式（1）計算其對DPPH 自由基清除率。

DPPH 自由基清除率/% = [1-（AI-AJ）/A0]×100 （1）

式中：AI為2 mL 樣品液的吸光度；AJ為2 mL 乙醇+2 mL 樣品液的吸光度；A0為2 mL 樣品溶液+2 mL DPPH 溶液的吸光度。

2）羥自由基（·OH）清除能力

參照張宏梅等[21]的方法測定羥自由基（·OH）清除能力。 按式（2）計算·OH 清除率。

式中：A樣為樣品的吸光度；A損為雙氧水+測試溶劑的吸光度；A未為蒸餾水+測試溶劑的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每個樣品3 次平行檢測，結(jié)果采用SPSS19.0 軟件對各項(xiàng)指標(biāo)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

各因素對蠶蛹蛋白水解度及多肽得率的影響見圖1。

圖1 各因素對蠶蛹蛋白水解度及多肽得率的影響Fig.1 Influence of three factors on silkworm pupa protein degree of hydrolysis and peptide yield

由圖1a 可知，多肽得率隨著水解溫度的升高呈現(xiàn)先降低后升高再降低的趨勢，而水解度卻隨著水解溫度的升高呈現(xiàn)遞增的趨勢。 在25℃恒溫培養(yǎng)水解過程中，多肽得率達(dá)到最大為18.23 mg/mL，而水解度卻在45 ℃水解過程中達(dá)到最大為12.35%。這是因?yàn)樵谝欢ǖ乃鈼l件下， 溫度是影響酶促反應(yīng)的主要因素，隨著溫度的升高其酶促反應(yīng)速度加快，水解度逐漸增大，但過高溫度會導(dǎo)致多肽被分解轉(zhuǎn)化為氨基酸， 不利于多肽的制備，因此選擇水解溫度25、30、35 ℃進(jìn)行正交試驗(yàn)。

由圖1b 可知隨著水解時間的延長，多肽得率和水解度均呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢，這是因?yàn)榍捌诰w生長繁殖且不斷產(chǎn)生蛋白酶水解蠶蛹蛋白，所以水解度和多肽得率均在增加， 水解度在第4 天達(dá)到最大14.32%，而多肽得率在第5 天達(dá)到最大值11.82 mg/mL。繼續(xù)水解多肽得率降低，因?yàn)樗獬跗谖⑸锷L代謝僅需少許蛋白用于自身的生長繁殖消耗，但到了發(fā)酵后期底物消耗較大雖然仍有部分大分子蛋白尚未被水解， 但部分分子量小的多肽被微生物優(yōu)先利用，因此出現(xiàn)多肽得率下降的趨勢[22-23]。 若繼續(xù)水解肽類物質(zhì)可能迅速減少， 因此選擇水解時間3、4、5 d 進(jìn)行正交試驗(yàn)。

由圖1c 可知，水解度和多肽得率隨加酶量的增加均先增加后降低，在加酶量2 368 U/g 時，多肽得率達(dá)到最高為10.54 mg/mL。在相同時間內(nèi)隨著加酶量的升高其水解程度更為徹底，在加酶量為2 895 U/g 時水解度達(dá)到最大10.51%，而其水解程度越大所產(chǎn)生多肽的含量就會相應(yīng)減少[24-25]。 而另一方面由于微生物發(fā)酵制備多肽是一個動態(tài)的過程，在水解過程中過量的酶分子又會抑制中間產(chǎn)物向酶解反應(yīng)終產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化，即其水解度和多肽的含量就會略有降低。 因此最佳加酶量選擇為2 368 U/g， 并選擇加酶量為2 150、2 368、2 632 U/g 進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

正交試驗(yàn)結(jié)果見表2， 以多肽得率和水解度為指標(biāo)的方差分析結(jié)果分別見表3 和表4。

表2 蠶蛹水解工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation technology optimization of silkworm pupa meal

表3 以多肽得率為評價指標(biāo)的正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results using flavonoids content as evaluation index

表4 以水解度為評價指標(biāo)的正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal experiments results using degree of hydrolysis as evaluation index

由表2 可知，影響多肽得率的各因素的主次順序?yàn)锽＞A＞C，影響水解度的各因素的順序?yàn)锽＞A＞C。 由表3 可知，水解溫度、水解時間均對多肽得率有顯著性影響（P<0.05）。由表4 可知，水解時間、水解溫度均對水解度有顯著性影響（P＜0.05），加酶量對水解度和多肽得率的影響均不顯著（P＞0.05）。綜合考慮，選擇最優(yōu)組合為A2B1C2，即水解溫度30 ℃、水解時間3 d、加酶量2 368 U/g，并在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，其多肽得率為21.35 mg/mL，其水解度為4.58%，優(yōu)于正交試驗(yàn)的各組合。 因此全細(xì)胞固態(tài)培養(yǎng)水解蠶蛹蛋白的最優(yōu)工藝條件選擇為水解溫度30℃、水解時間3d、加酶量2368 U/g。

2.3 蠶蛹多肽分離純化效果

多肽洗脫圖譜如圖2 所示。

圖2 蠶蛹多肽洗脫圖譜Fig.2 Eluction chart of polypeptide

有兩個組分的肽段被分離，且組分Ⅱ峰高明顯大于組分Ⅰ。閔建華等[26]使用Sephadex G-25 交聯(lián)葡聚糖凝膠柱分離蠶蛹蛋白水解液后也得到兩個不同組分，但其組分Ⅰ為主要成分。 而趙鵬等[27]將蠶蛹蛋白水解液用Sephadex G-25 交聯(lián)葡聚糖凝膠柱分離后，得到3 個較明顯的峰。 這可能是由水解產(chǎn)生的肽單位的分子大小差異產(chǎn)生的結(jié)果。

2.4 純化多肽清除自由基的能力

2.4.1 純化多肽DPPH 自由基清除能力

將純化后多肽組分Ⅰ和組分Ⅱ與VC、VE進(jìn)行抗氧化活性比較，結(jié)果見圖3。

從圖3 可知，組分Ⅰ抗氧化性優(yōu)于組分Ⅱ，但均低于對照組抗氧化性。 在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，隨著蠶蛹多肽濃度的升高， 蠶蛹多肽對DPPH 自由基清除率線性增加，當(dāng)蠶蛹多肽濃度為0.6 mg/mL 時，組分Ⅰ和組分Ⅱ?qū)PPH 自由基清除率達(dá)到37%、36%，但遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于VC、VE的抗氧化能力。

圖3 多肽對DPPH 自由基的清除率Fig.3 Scavenging rate of DPPH free radical by polypeptide

2.4.2 純化多肽·OH 清除能力

純化多肽對·OH 的清除率結(jié)果如圖4 所示。

圖4 多肽對·OH 的清除率Fig.4 Scavenging rate of·OH by polypeptide

當(dāng)純化多肽濃度在0.4 mg/mL～0.6 mg/mL 范圍時，組分Ⅰ和組分Ⅱ?qū)ΑH 清除能力顯著高于對照組VC和VE，多肽濃度在0.6 mg/mL 時，組分Ⅰ和組分Ⅱ?qū)ΑH 的清除率分別為83%、94%，且組分Ⅱ在不同濃度下對·OH 的清除率均高于對照組VC和VE。 蠶蛹蛋白水解制備的多肽具有較好的抗氧化能力，尤其·OH 的清除能力較強(qiáng)。

3 結(jié)論

本研究以蠶蛹粉和麩皮為原料，通過單因素和正交試驗(yàn)對蠶蛹粉水解條件進(jìn)行優(yōu)化，得到制備蠶蛹多肽的最優(yōu)水解條件為：水解時間3 d、水解溫度30 ℃、加酶量2368U/g。在此優(yōu)化條件下多肽得率為21.35mg/mL，水解度為4.58%。蠶蛹多肽具有較強(qiáng)的·OH 清除能力，清除率達(dá)到94%。 此工藝制備多肽雖然水解時間稍長， 但此水解工藝簡便且可以得到安全無臭多肽產(chǎn)品，在一定程度上為蠶蛹資源的開發(fā)和利用提供理論和技術(shù)支撐。