王華麗，王一瑋，王萌，耿偉濤，王金菊，賈龍剛，王艷萍*

（1.國(guó)家食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中心，北京 100022；2.天津科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300457）

多肽類(lèi)物質(zhì)自從被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，已被證明具有多種生物活性，如抗氧化、抗菌、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（angiotensin-converting enzyme，ACE）抑制、抗腫瘤、抗炎、增強(qiáng)免疫等。玉米肽主要來(lái)源于玉米籽粒經(jīng)食品工業(yè)生產(chǎn)或釀酒工業(yè)提純后的玉米淀粉或玉米蛋白粉。 據(jù)報(bào)道，玉米肽具有許多生物活性，如抗腫瘤[1-4]、抗氧化[5-7]、促進(jìn)酒精代謝[8-9]、抗高血壓[10-12]、降低血糖[13]、抗疲勞[14]、保肝護(hù)肝[15-16]等，特別是玉米肽的保肝護(hù)肝作用，如玉米肽可以減輕Con A 誘導(dǎo)的肝損傷[17]、對(duì)脂多糖和卡介苗誘導(dǎo)的小鼠肝損傷有保護(hù)作用[18]、玉米寡肽可以預(yù)防由四氯化碳引起的早期肝損傷[19]等。

在研究中發(fā)現(xiàn)，玉米蛋白的酶解產(chǎn)物肽具有很好的抗人肝癌細(xì)胞HepG2 生長(zhǎng)的活性，但其結(jié)構(gòu)和組成及作用機(jī)制尚不清楚。 本研究對(duì)玉米蛋白水解物進(jìn)行分離和純化， 篩選出具有抗腫瘤細(xì)胞HepG2 的活性肽，研究其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，并初步研究了其對(duì)HepG2 細(xì)胞抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米肽原料： 武漢新生肽生物科技有限公司；噻唑藍(lán)[3-（4，5-dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT]、 二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）：美國(guó)Sigma 公司；雙抗（青霉素-鏈霉素）、高糖DMEM 完全培養(yǎng)液、1640 完全培養(yǎng)液：美國(guó)Gibco 生物科技公司；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）： 美國(guó)Hyclone 生物科技公司；5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）：上海生工生物工程有限公司；其它所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

ThermoFisher Multiskan GO 全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀、 尼康Nikon ECLIPSE Ti-S 熒光倒置顯微鏡、150i 型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱：美國(guó)Thermo 公司；BS-100A 型自動(dòng)部份收集器：上海滬西分析儀器廠(chǎng)有限公司；YZ1515x 型恒流泵： 蘭格恒流泵有限公司；DELTA-320pH 計(jì)： 法國(guó)METTLER－TOLEDO 公司；HR60-ⅡA2 型生物安全柜： 青島海爾股份有限公司；AF100 電子制冰機(jī)：SANYO 制冰系統(tǒng)有限公司；JA2003 型電子分析天平：上海精科天平廠(chǎng)；RE-3000 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀： 上海亞榮生化儀器廠(chǎng)。

1.3 方法

1.3.1 分離純化

將玉米肽溶解在0.05 mol/L 的Tris-HCl 緩沖溶液中，加到DEAE-FF 柱（1.5 cm×10 cm）上，并以4 mL/min的流速加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mol/L 的NaCl-Tris-HCl 溶液，用作洗脫液，每40 min 一個(gè)梯度。 洗脫液由自動(dòng)收集器以2 min 的間隔自動(dòng)收集。 并通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè)每管吸光度。 根據(jù)峰圖收集玉米肽組分，濃縮并冷凍干燥。

用Sephadex G-15 柱（1.0 cm×70 cm）進(jìn)一步純化得到的玉米肽組分，將玉米肽溶解在蒸餾水中，并用蒸餾水以1 mL/min 的流速洗脫該柱。 洗脫液為蒸餾水，收集與上述相同。 收集純化的玉米肽組分，濃縮并冷凍干燥。

1.3.2 結(jié)構(gòu)鑒定

使用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜電噴霧法（liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry，LC-ESI-MS/MS）進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。使用de novo 數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)進(jìn)行解析。

1.3.3 多肽合成

委托江蘇強(qiáng)耀公司，采用固態(tài)合成的方法進(jìn)行多肽合成。

1.3.4 細(xì)胞培養(yǎng)

人肝癌細(xì)胞株HepG2 培養(yǎng)在含10% 胎牛血清（FBS）和1%雙抗溶液（青霉素-鏈霉素混合溶液）的DMEM 培養(yǎng)基中， 人正常肝細(xì)胞株L-02 培養(yǎng)在血清含量和抗生素含量與上述條件相同的1640 培養(yǎng)基中，置于培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)傳代[20-21]。

1.3.5 細(xì)胞活力測(cè)定

用MTT 法分析玉米肽對(duì)HepG2 癌細(xì)胞的殺傷作用[22]。胰酶消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，加入完全培養(yǎng)液制成單細(xì)胞懸液，按照血細(xì)胞計(jì)數(shù)法調(diào)整細(xì)胞密度為5×104個(gè)/mL。將細(xì)胞接種到96 孔板中，常規(guī)培養(yǎng)24 h，每孔加入200 μL 含有不同濃度待測(cè)樣品和陽(yáng)性對(duì)照（5-FU 的細(xì)胞培養(yǎng)液）， 空白組只加入200 μL 基礎(chǔ)培養(yǎng)液，每組6 個(gè)平行。培養(yǎng)24 h，吸去廢棄培養(yǎng)液，每孔加入5 mg/mL MTT 溶液20 μL 和180 μL 基礎(chǔ)培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后，吸出舊培養(yǎng)液，加入磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS） 沖洗， 每孔加入150 μL DMSO，置于酶標(biāo)儀中孵育10 min，測(cè)試其在570 nm 處的吸光度值，按照下式計(jì)算抑制率。

式中：A對(duì)照和A空白分別表示陽(yáng)性對(duì)照組和空白組在570 nm 處的吸光度值。

1.4 數(shù)據(jù)分析

本研究中獲得的所有數(shù)據(jù)將使用統(tǒng)計(jì)程序Excel進(jìn)行分析，SPSS 結(jié)果以平均±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。 不同處理之間的差異性顯著通過(guò)方差分析（analysis of variance，ANOVA），用Fisher 最小顯著性差異方法進(jìn)行顯著性比較，顯著性水平為p<0.05 或p<0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米肽的分離純化

2.1.1 離子交換層析分離玉米肽

實(shí)驗(yàn)室前期采用MTT 比色法檢測(cè)樣品對(duì)不同癌細(xì)胞的抑制率， 對(duì)19 種生物活性肽或蛋白進(jìn)行了初篩，發(fā)現(xiàn)玉米低聚肽對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制率較高，且對(duì)人正常肝細(xì)胞的毒性較小。 本研究在前期工作基礎(chǔ)上，對(duì)玉米肽進(jìn)行分離和純化。

玉米肽經(jīng)DEAE-FF 離子交換層析分離后得到兩個(gè)組分，如圖1 所示，命名為D-1 和D-2。收集D-1 和D-2 組分，冷凍干燥后置于-20 ℃低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 玉米肽經(jīng)DEAE-FF 陰離子交換柱洗脫曲線(xiàn)Fig.1 Chromatomap of corn peptide separated by DEAE-FF

2.1.2 分子篩層析方法分離玉米肽

玉米肽經(jīng)DEAE-FF 陰離子交換柱分離出來(lái)的兩個(gè)組分D-1 和D-2， 使用Sephadex G-15 分子篩層析進(jìn)一步分離。經(jīng)Sephadex G-15 分子篩層析，以D-1 為分離樣品，檢測(cè)波長(zhǎng)為214 nm，分離出兩個(gè)組分，命名為D-1-1 和D-1-2。經(jīng)Sephadex G-15 分子篩層析，以D-2 為分離樣品，檢測(cè)波長(zhǎng)為214 nm，分離出兩個(gè)組分，命名為D-2-1 和D-2-2。 收集D-1-1、D-1-2、D-2-1 和D-2-2 組分， 冷凍干燥后置于-20 ℃低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

具體分離曲線(xiàn)見(jiàn)圖2 和圖3。

圖2 D-1 經(jīng)Sephadex G-15 分離曲線(xiàn)Fig.2 Chromatomap of D-1 separated by Sephadex G-15

圖3 D-2 經(jīng)Sephadex G-15 分離曲線(xiàn)Fig.3 Chromatomap of D-2 separated by Sephadex G-15

Sephadex G-15 分子篩層析的分離范圍在分子量1 500 Da 以下，所以D-1-1、D-1-2、D-2-1 和D-2-2 4 個(gè)組分內(nèi)的肽理論上應(yīng)該是分子量比較小的玉米肽。

2.2 不同組分對(duì)HepG2 的抑制作用

采用MTT 法檢測(cè)溶于不含胎牛血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)液、 濃度為1 000 μg/mL 的D-1、D-2、D-1-1、D-1-2、D-2-1 和D-2-2 6 個(gè)玉米肽組分對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2 的抑制作用以及對(duì)人正常肝細(xì)胞L-02 的毒性作用，結(jié)果如圖4 所示。

圖4 對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2 和人正常肝細(xì)胞L-02 生長(zhǎng)的抑制率Fig.4 Inhibition rate of growth of human liver cancer cell HepG2 and human normal liver cell L-02

由圖4 可知，作用時(shí)間為24 h 時(shí)，濃度為1000μg/mL的D-1、D-2、D-1-1、D-1-2、D-2-1 和D-2-2 6 種玉米肽不同組分對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2 細(xì)胞均有抑制作用，其中D-2-2 對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2 抑制率最高，接近陽(yáng)性對(duì)照抑癌藥物5-FU。 而且D-2-2 對(duì)人正常肝細(xì)胞的毒性作用低于5-FU。 所以選擇D-2-2 進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定與抑制HepG2 活性的研究。

2.3 抑制HepG2 活性肽的結(jié)構(gòu)分析

玉米活性肽的結(jié)構(gòu)分析結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 玉米活性肽的結(jié)構(gòu)分析Table 1 Potentially active peptides

圖5 和圖6 分別為液相分離D-2-2 組分的總離子流圖和LPPYLP 的二級(jí)質(zhì)譜圖。

圖5 D-2-2 組分總離子流圖Fig.5 D-2-2 components total ion chromatography diagram

圖6 LPPYLP 的二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.6 Tandem mass spectrum of LPPYLP

D-2-2 組分分析中， 相對(duì)豐度排名前5 的肽段有LPPYLP、LPFYPQ、LPPYLSP、LAPPYY、LPPYY，可以分析出這5 條肽段都含有脯氨酸、 亮氨酸和酪氨酸，且“LP”這個(gè)片段出現(xiàn)頻率較高。氨基酸結(jié)構(gòu)為“LPPYLP”的玉米肽多肽匹配度及相對(duì)豐度均較高，組成該肽的氨基酸均為疏水性氨基酸且其氨基酸序列中脯氨酸占比為50%，亮氨酸占比為33%。 最終篩選出氨基酸結(jié)構(gòu)為“LPPYLP”的玉米肽，命名為CPs-6，研究其對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2 的抗腫瘤活性。

2.4 玉米六肽CPs-6 的抑制HepG2 活性驗(yàn)證

通過(guò)固相合成法按照之前篩選出CPs-6 的氨基酸結(jié)構(gòu)LPPYLP 進(jìn)行了合成， 得到了純度≥95%的合成肽CPs-6，采用MTT 法檢測(cè)活性，結(jié)果如圖7 所示。

圖7 CPs-6、CP、D-2-2 組分對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2、Hep3B 和人正常肝細(xì)胞L-02 的抑制率Fig.7 Inhibition rate of CPs-6，CP，D-2-2 components on human liver cancer cells HepG2，Hep3B and human normal liver cells L-02

作用濃度為1 000 μg/mL，作用時(shí)間為24 h 時(shí)，玉米六肽CPs-6 相比分離前的玉米肽，對(duì)HepG2 細(xì)胞的抑制率由30%提高到50%，提高了20%。 對(duì)Hep3B 細(xì)胞的抑制率由10%提高到42%， 抗腫瘤活性提高了32%。 玉米六肽CPs-6 相比較D-2-2 組分對(duì)L-02 的毒性由36%降低到17%，損傷減少了19%。

3 結(jié)論

采用離子交換和葡聚糖凝膠層析方法分離、純化玉米肽的混合物，鑒定出其中具有抑制HepG2 細(xì)胞生長(zhǎng)活性的玉米活性短肽，其一級(jí)結(jié)構(gòu)為L(zhǎng)PPYLP（CPs-6）；以5-Fu 為對(duì)照，玉米六肽CPs-6 在1 000 μg/mL，作用24 h， 對(duì)HepG2 細(xì)胞的抑制率達(dá)到50%；對(duì)Hep3B 細(xì)胞的抑制率為42%，且對(duì)人正常肝細(xì)胞的毒性作用依然維持在一個(gè)比較低的水平。 本研究結(jié)果為玉米肽的護(hù)肝保肝作用提供了理論依據(jù)，為肝癌的治療藥物和預(yù)防肝病的功能性食品的開(kāi)發(fā)提供了理論基礎(chǔ)。