譚燕，肖紫鳴，李小林，張潔，宋文軍，魏紀(jì)平，喬長晟

（天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津 300134）

大腸桿菌O157：H7 和鼠傷寒沙門氏菌是食物中毒暴發(fā)的病原體，大多數(shù)新鮮農(nóng)產(chǎn)品容易受到病原體的污染，從而導(dǎo)致食源性疾病的暴發(fā)[1-2]。 沙門氏菌是一種革蘭氏陰性菌，屬于腸桿菌科，是引起食源性疾病的主要原因[3-4]。 據(jù)統(tǒng)計分析，1996 年～2015 年的沙門氏菌食物中毒事件166 起，累計發(fā)病8 996 人[5]。 在沙門氏菌2 500 多種血清型中，少于100 種會導(dǎo)致大多數(shù)人感染，鼠傷寒沙門氏菌引發(fā)的污染常占前兩位[6-7]。 感染鼠傷寒沙門氏菌輕至腸炎，臨床表現(xiàn)為腹瀉、惡心嘔吐，重至敗血癥和全身系統(tǒng)性播散引起的內(nèi)臟損害等癥狀[8-9]。 食源性致病菌的檢測顯得尤為重要。 近年來，隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展和應(yīng)用，研究者發(fā)現(xiàn)致病性細(xì)菌的致病力是大量細(xì)菌毒力相關(guān)基因相互作用的結(jié)果[10-13]。 近幾年來基于分子生物學(xué)技術(shù)中的聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測[14]較于傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)檢測得到更多的應(yīng)用。 聚合酶鏈反應(yīng)檢測方法不僅準(zhǔn)確、靈敏，還能比傳統(tǒng)的微生物檢測更快速。 但是目前聚合酶鏈反應(yīng)檢測鼠傷寒沙門氏菌存在靈敏度不高，準(zhǔn)確性不夠等缺點(diǎn)。 為了提高檢測鼠傷寒沙門氏菌的準(zhǔn)確性和靈敏度，本研究用多重聚合酶鏈法對鼠傷寒沙門氏菌的多種毒力基因進(jìn)行檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試劑與菌種

Premix Tap（TaKaRa Tap Version 2.0 plus dye）、Ta-KaRa 試劑盒、TIANGEN D2000 Marker：天根生化科技（北京） 有限公司；Solarbio 50хTAE 緩沖液、Solarbio Goldview I 核酸染料、葡萄糖瓊脂：北京索萊寶科技有限公司。 試驗(yàn)菌株信息見表1。

表1 菌株信息Table 1 Strain information

1.1.2 儀器

22331-Hambug 型PCR 儀： 蘇州東勝興業(yè)科學(xué)儀器有限公司；Tanon-1600 型凝膠成像儀：上海天能科技有限公司；DYY-6C 型電泳儀：Bio-Rad 公司；MiniSpin plus 型離心機(jī)：美國eppendorf 公司；Nano-600 型超微量紫外分光計：美國DeNovix 公司；HHS-6S 型恒溫水浴鍋：北京市長鳳儀器儀表公司；HNY-211B 型恒溫培養(yǎng)振蕩器：天津市歐諾儀器儀表有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA 模板的制備

取單菌落鼠傷寒沙門氏菌于無菌的液體（Laria-Bertain，LB） 培養(yǎng)基中36 ℃、180 r/min 培養(yǎng)12 h，取1 mL 菌液12 000 r/min 離心2 min，棄上清液。在沉淀中加入180 μL 的緩沖液GL、20 μL 的蛋白酶K 溶液（20 mg/mL）和10 μL 的核糖核酸酶A（10 mg/mL）充分振蕩混勻，于56 ℃水浴溫育10 min，加入200 μL的緩沖液GB 和200 μL 的無水乙醇， 充分吸打混勻，將核酸純化柱安裝在接收管上，溶液移至核酸純化柱中，12 000 r/min 離心2 min，棄濾液。將500 μL 的緩沖液WA 加入至核酸純化柱，12 000 r/min 離心1 min，棄濾液。 將700 μL 的緩沖液WB 加入至核酸純化柱中，12 000 r/min 離心1 min， 棄濾液。 沿核酸純化柱管壁四周加入緩沖液WB，將核酸純化柱安置于接收管上，12 000 r/m 離心2 min。 將核酸純化柱置于新的1.5 mL離心管上， 加入100 μL 加熱至65 ℃的洗脫緩沖液，室溫24 ℃靜置5 min。 12 000 r/min 離心2 min 后洗脫DNA，得到100μL 沙門氏菌DNA 模板。 用超微量紫外分光計測提取的鼠傷寒沙門氏菌的核酸濃度。

1.2.2 引物設(shè)計與制備

通過查詢資料選取鼠傷寒沙門氏菌的毒力島基因mgtC、inva、mogA、sseL、araB 為本研究的目的基因， 其中mogA、sseL、araB、mgtC 是沙門氏菌的核心蛋白基因，毒力島SPI-1 編碼inva 基因， 毒力島SPI-2 編碼sseL 基因， 毒力島SPI-3 編碼mgtC 基因， 毒力島SPI-5 編碼araB 基因。 引物通過參考文獻(xiàn)[15-16]和應(yīng)用Primer6.0 設(shè)計獲得，并由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物序列見表2。

表2 引物序列Table 2 Primer sequence

1.2.3 單重PCR 反應(yīng)體系的建立

參考文獻(xiàn)[17]，初步建立單重PCR 反應(yīng)體系（25 μL）。樣品DNA 模板1 μL、正向引物和反向引物各0.5 μL、Premix Tap 12.5 μL、ddH2O 補(bǔ)齊至25 μL。 PCR 擴(kuò)增條件參數(shù)：94 ℃預(yù)變性5 min，之后開始擴(kuò)增循環(huán)，每個循環(huán)的程序?yàn)椋?4 ℃變性30 s，分別在56.2、57.2、57.8、58.7 ℃下退火30 s、72 ℃延伸30 s、30 個循環(huán)，72 ℃延伸10 min，降溫結(jié)束。 分別取上述PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL點(diǎn)樣于1.5%瓊脂糖凝膠，130 V 恒壓，20 min 電泳完成后放入凝膠成像儀，觀察電泳條帶是否清晰、是否有雜帶出現(xiàn)，目標(biāo)條帶是否擴(kuò)增出來。

根據(jù)對PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳圖進(jìn)行分析，確定反應(yīng)體系的最佳退火溫度。

1.2.4 多重PCR 反應(yīng)體系的優(yōu)化

在單重PCR 的反應(yīng)條件下，將沙門氏菌的6 對毒力基因按照引物的DNA 解鏈溫度Tm 值、引物之間的交叉污染等因素進(jìn)行多重PCR 的試驗(yàn)設(shè)計，選擇退火溫度相近，引物長度不在同一區(qū)間的引物。多重PCR反應(yīng)體系參考方法[18-19]（50 μL）：樣品DNA 模板各2 μL、正向引物和反向引物各1 μL、Premix Tap 25 μL、ddH2O補(bǔ)齊至50 μL。PCR 擴(kuò)增條件參數(shù)：94 ℃變性5 min，開始擴(kuò)增循環(huán)， 每個擴(kuò)增循環(huán)的程序?yàn)椋?4 ℃變性30 s、57.2 ℃下退火30 s、72 ℃延伸30 s、30 個循環(huán)， 然后72 ℃延伸10 min，降溫結(jié)束。

根據(jù)以上體系做響應(yīng)面優(yōu)化，見表3。

表3 響應(yīng)面優(yōu)化反應(yīng)體系Table 3 Response surface optimization reaction system

分別取上述PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL 點(diǎn)樣于1.5%瓊脂糖凝膠，130 V 恒壓20 min。 電泳完成后放入凝膠成像儀，觀察電泳條帶是否清晰、是否有雜帶出現(xiàn)，目標(biāo)條帶是否擴(kuò)增出來，引物之間是否有交叉污染。

1.2.5 特異性驗(yàn)證

在沙門氏菌DNA 模板里混合單增李斯特菌和大腸桿菌作為陰性對照，ddH2O 為空白對照，在單重PCR條件下進(jìn)行PCR 反應(yīng)，以鑒定該方法的特異性。

1.2.6 靈敏度檢測

分別用無菌ddH2O 將提取的沙門氏菌DNA 濃度為0.165 ng/mL 進(jìn)行10 倍梯度稀釋為0.165、0.165×10-1、0.165×10-2、0.165×10-3、0.165×10-4、0.165×10-5、0.165×10-6、0.165×10-7ng/mL， 再將梯度稀釋后的DNA作為模板，通過優(yōu)化后的反應(yīng)程序進(jìn)行擴(kuò)增，檢測該方法的靈敏性。

1.2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

本研究中的所有試驗(yàn)，均重復(fù)3 次，以驗(yàn)證試驗(yàn)方法的重復(fù)性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本試驗(yàn)采用Design-expert 響應(yīng)面分析軟件對多重PCR 方法的建立及優(yōu)化進(jìn)行設(shè)計和分析，采用凝膠成像儀對PCR 產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳后的膠進(jìn)行觀察并另存為圖片，再采用iSee 軟件對圖片進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 單重PCR 反應(yīng)條件的確定

采用1.2.2 中表2 引物建立單重PCR 反應(yīng)體系檢測鼠傷寒沙門氏菌的mgtC、inva（214）、inva（284）、mogA、sseL、araB 毒力基因。 沙門氏菌毒力基因在不同溫度下的電泳圖見圖1。

圖1 沙門氏菌毒力基因在不同溫度下的電泳結(jié)果Fig.1 Electrophoresis of Salmonella virulence genes at different temperatures

由圖1 可知，圖1B 的條帶較清晰，無雜帶出現(xiàn)，說明單重PCR 反應(yīng)的最佳體系為模板1 μL、正向引物和反向引物各0.5 μL、Premix Tap 12.5 μL、ddH2O 補(bǔ)齊至25 μL。 單重PCR 反應(yīng)的方法的最佳退火溫度為57.2 ℃。

2.2 多重PCR 反應(yīng)體系的優(yōu)化

本研究采用響應(yīng)面方法對多重PCR 反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，退火溫度、引物添加量和模板添加量對多重PCR 方法特異性的影響見圖2， 并根據(jù)圖2 的試驗(yàn)結(jié)果，對其進(jìn)行重復(fù)驗(yàn)證，重復(fù)驗(yàn)證結(jié)果見圖3。

圖2 多重PCR 方法響應(yīng)面優(yōu)化Fig.2 Multiplex PCR method response surface optimization

圖3 多重PCR 方法重復(fù)性Fig.3 Repeatability of multiple PCR method

由圖2、圖3 可知，泳道9 的條帶最為清晰且無交叉污染。 所以多重PCR 方法的最佳反應(yīng)體系為DNA 2 μL、 上下引物各0.8 μL、Premix Tap 25 μL、ddH2O 18.2 μL。 Tm 值為56 ℃。

2.3 特異性驗(yàn)證

采用鼠傷寒沙門氏菌的mgtC、inva（214）、inva（284）、mogA、sseL、araB 毒力基因引物進(jìn)行單重PCR 擴(kuò)增。驗(yàn)證單重PCR 方法檢測鼠傷寒沙門氏菌的mgtC、inva（214）、inva（284）、mogA、sseL、araB 毒力基因的特異性結(jié)果見圖4。

由圖4 可知， 沙門氏菌的毒力基因均擴(kuò)增出目的條帶，陰性對照無有效擴(kuò)增條帶，說明本研究的方法可用于鼠傷寒沙門氏菌的特異性檢測。

圖4 單重PCR 特異性分析Fig.4 Specific analysis of single PCR

2.4 靈敏度檢測

采用鼠傷寒沙門氏菌mgtC、mogA、araB 毒力基因引物進(jìn)行多重PCR 擴(kuò)增以檢測本研究的靈敏度。多重PCR 方法檢測鼠傷寒沙門氏菌mgtC、mogA、araB 毒力基因的靈敏度的結(jié)果見圖5。

圖5 多重PCR 靈敏度Fig.5 Multiplex PCR sensitivity

由圖5 可知該方法能檢測的最低靈敏度為0.016 5 ng/μL。 賀晨、劉駱強(qiáng)等[20-21]等研究的沙門氏菌的最低檢測限均為0.02 ng/μL，然而劉菲菲[22]研究的沙門氏菌最低檢測限度為1ng/μL。 由此可知該方法的靈敏度好。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)通過建立單重PCR 檢測沙門氏菌毒力基因的試驗(yàn)方法建立多重PCR 快速檢測多種毒力基因的試驗(yàn)方法。 在6 對特異性引物中進(jìn)行多重PCR 反應(yīng)， 篩選出mgtC、mogA、araB 3 種毒力基因進(jìn)行多重PCR 反應(yīng)的特異性強(qiáng)、無交叉污染，該方法能檢測的最低靈敏度為0.016 5 ng/μL。

本試驗(yàn)的單重PCR 方法可以同時檢測沙門氏菌毒力島編碼的基因mgtC、inva、mogA、sseL、araB， 由于引物之間的交叉污染，本研究中建立的多重聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）只能同時檢測3 種鼠傷寒沙門氏菌毒力基因mgtC、mogA、araB。 若食品中能同時檢測出mgtC、mogA、araB 基因，則該食品中的沙門氏菌毒性較強(qiáng)。但是該方法檢測范圍有限，只能對mgtC、mogA、araB 3 種基因進(jìn)行檢測。 本研究檢測方法特異性強(qiáng)、靈敏度高，重復(fù)性好，可以實(shí)現(xiàn)快速檢測食品中鼠傷寒沙門氏菌3 種毒力基因， 對預(yù)防控制鼠傷寒沙門氏菌對食品污染引起的食品安全問題具有很好的應(yīng)用前景。