劉金玉，季超，靳佳瑞，張芹，郝韞，解玉鑫，馮宇賾，李娟，伍志強(qiáng)，汪星宇，鄭文杰*

（1.天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津 300387；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)云南生物資源保護(hù)與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650201）

虹鱒肌肉中蛋白含量、脂肪含量以及必需氨基酸含量均高于青魚、草魚、鰱魚等幾種常見的淡水魚[1-2]，其骨中蛋白質(zhì)和脂肪含量分別為20.69%和22.8%，不飽和脂肪酸含量為83.54%，均高于一般魚類[3]，所以虹鱒的需求量及產(chǎn)量都與日俱增；根據(jù)聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織漁業(yè)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)， 從2008 年到2018 年全球虹鱒產(chǎn)量已從67.732 萬噸增長(zhǎng)到84.919 6 萬噸； 就我國(guó)而言，2017 年我國(guó)冷水魚產(chǎn)量在5 萬噸左右， 其中虹鱒約占3.860 6 萬噸[4]。作為美味又富有營(yíng)養(yǎng)的食品而言，虹鱒食用方法很多，主要的商品有生魚片、罐頭、魚糜、煙熏制品等，虹鱒魚皮還可以用作膠原蛋白的提取[5]。由于部分商品在加工過程中形態(tài)學(xué)特征受到不同程度的破壞，通過商品形態(tài)無法對(duì)其是否源自虹鱒進(jìn)行判別[6]，所以常用核酸與蛋白質(zhì)等方法對(duì)其真實(shí)性加以鑒別。 因蛋白質(zhì)具有組織特異性且在食品加工過程中的高溫、 高壓以及高鹽處理可能會(huì)使其發(fā)生變性，檢測(cè)的準(zhǔn)確性會(huì)受到影響[7]。 因此，基于核酸的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測(cè)方法成為目前用于水產(chǎn)品鑒別的主要方法。

實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time fluorescence PCR，RT-PCR）檢測(cè)在食品及魚類產(chǎn)品中應(yīng)用已較為廣泛。 李秋陽等[8]對(duì)熒光定量PCR 檢測(cè)在食品中的應(yīng)用做了相應(yīng)的介紹，方軍等[9]利用實(shí)時(shí)熒光PCR 建立了對(duì)魚翅這種加工要求較高的產(chǎn)品的檢測(cè)方法，方法較為穩(wěn)定可行；郭鳳柳等[10]也開發(fā)了針對(duì)摻假肉類的PCR 檢測(cè)方法；ZHAO 等[11]進(jìn)行了以PCR-測(cè)流免疫分析法鑒定驢肉源性的研究；史瑩瑩等[12]建立了實(shí)時(shí)熒光定量PCR 鑒定肉制品中牛源性成分及其含量方法；羅建興等[13]利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法檢測(cè)對(duì)食品中鵪鶉源性成分進(jìn)行檢測(cè)；汪藝等[14]對(duì)水產(chǎn)品中的鱈魚建立了實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)能快速鑒定3 種鱈魚。 李進(jìn)波等[15]用實(shí)時(shí)熒光PCR 法鑒定食品中鮭亞科魚成分，并可用于市場(chǎng)上鮭科魚及產(chǎn)品的檢測(cè)。

本研究以虹鱒為研究對(duì)象，利用線粒體基因具有編碼效率高、在不同區(qū)域進(jìn)化速度存在差異和母性遺傳等特點(diǎn)[16-17]，針對(duì)虹鱒較其它魚類在線粒體基因組上保守度相對(duì)較高的ATP6 設(shè)計(jì)特異性引物和探針[18-19]，建立針對(duì)虹鱒源性成分的實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè)技術(shù)，可用于檢測(cè)市售的三文魚產(chǎn)品是否含有虹鱒源性成分。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

待檢測(cè)樣品： 市售的三文魚片4 份和網(wǎng)購的虹鱒魚籽、煙熏、烤制及虹鱒生魚片等18 份，詳見表1。

表1 待檢測(cè)樣品列表Table 1 List of samples to be tested

10 份虹鱒魚樣品： 青海民澤龍羊峽公司提供；帶魚、大黃魚、中國(guó)蘆花、尼羅羅非魚、草魚、鲅魚、大眼鱖、鯽魚、石斑、藍(lán)鰭金槍魚、黃鰭金槍魚、大目金槍魚、長(zhǎng)鰭金槍魚、錦鯉、大西洋鮭、多寶魚、鯧魚17 種非靶標(biāo)魚樣品：市售。

動(dòng)物組織基因組提取試劑盒：天根生化科技有限公司；引物和探針：由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.2 儀器與設(shè)備

LightCyclerR480 II 實(shí)時(shí)熒光定量PCR： 美國(guó)Roche 公司；3K15 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)： 曦瑪離心機(jī)（揚(yáng)州）有限公司；HH-S3 數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇市金南儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的制備

取0.1 g 樣品，加入600 μL 去離子水，在5 000 r/min條件下勻漿40 s。

1.3.2 DNA 的提取

將分別勻漿后的樣品，在6 000 r/min 條件下離心1 min，棄上清液留沉淀，使用動(dòng)物組織基因組提取試劑盒進(jìn)行樣品DNA 的提取，作為PCR 擴(kuò)增的模板。

特異性試驗(yàn)樣品準(zhǔn)備：用青海民澤龍羊峽公司提供的10 份虹鱒魚樣品和本研究中收集的其它17 個(gè)非靶標(biāo)魚類組織提取的DNA 來研究該方法的特異性。選取不同虹鱒魚的DNA 樣品10 份，經(jīng)DNA 條形碼技術(shù)驗(yàn)證后的帶魚、大黃魚、中國(guó)蘆花、秋刀魚、尼羅羅非魚、草魚、鲅魚、大眼鱖、石斑、藍(lán)鰭金槍魚、黃鰭金槍魚、大目金槍魚、長(zhǎng)鰭金槍魚、比目魚、鯉魚、大西洋鮭魚、鯽魚DNA 樣品各1 份備用。

DNA 靈敏度試驗(yàn)樣品準(zhǔn)備：選取青海民澤龍羊峽公司提供的虹鱒魚樣品的DNA，原始濃度為50 ng/μL，用去離子水分別稀釋為10、1、0.1、0.01、0.001ng/μL 備用，其中50、10、1、0.1 ng/μL 每個(gè)濃度做4 次重復(fù)試驗(yàn)；0.01、0.001 ng/μL 做8 次重復(fù)試驗(yàn)驗(yàn)證。

1.3.3 引物設(shè)計(jì)和選擇

從NCBI 數(shù)據(jù)庫中下載虹鱒、 大西洋鮭、 大馬哈魚、帝鮭、石斑、帶魚等25 種線粒體基因組全序列，利用Geneious Prime 2019 版對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)分析， 比對(duì)結(jié)果表明ATP6 基因在虹鱒中具有一定的保守性，利用軟件Primer Premier 5.0 設(shè)計(jì)引物。 引物和探針序列如表2 所示。

表2 虹鱒引物及探針Table 2 Primers and probes for Oncorhynchus mykis

利用DNA 條形碼技術(shù)對(duì)樣品進(jìn)行驗(yàn)證[20-22]，對(duì)收到樣品進(jìn)行針對(duì)線粒體COX I 基因的部分特異區(qū)段的通用（＞99%）引物FISH F/R[23]測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov）進(jìn)行序列比對(duì)，選取相似度最高的結(jié)果進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建。

1.3.4 PCR 擴(kuò)增

實(shí)時(shí)熒光PCR 反應(yīng)體系為20 μL ∶0.2 μL 的TaKaRa Ex Taq HS（5 U/μL），4 μL 的10×Ex Taq Buffer，3 μL的dNTP 混合液（2.5 mmol/L），0.4 μL 的ATP6-F（10 μmol/L），0.4 μL 的ATP6-R （10 μmol/L），0.6 μL 的Probe（10 μmol/L），9.4 μL 的無菌水，2 μL 的DNA。

參照LightCycler480 II 實(shí)時(shí)熒光PCR 儀使用說明書及TAKARA 公司TaKaRa Ex TaqRHot Start Version推薦的反應(yīng)程序，設(shè)置反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性30 s，1 個(gè)循環(huán)；95 ℃變性10 s，60 ℃退火延伸30 s，40 個(gè)循環(huán)；40 ℃冷卻30 s，1 個(gè)循環(huán)。

2 結(jié)果分析

2.1 樣品真實(shí)性鑒定

利用DNA 條形碼技術(shù)驗(yàn)證收集樣品真實(shí)性和準(zhǔn)確性的結(jié)果如圖1 和表3 所示。 本研究所收集樣品和NCBI 數(shù)據(jù)庫序列比對(duì)相似度達(dá)99.9%。

表3 18 種魚類樣品名稱及測(cè)序結(jié)果Table 3 Names and sequencing results of 18 fish samples

圖1 18 份樣品的線粒體上COX I 的最大似然法和鄰接法分子進(jìn)化樹Fig.1 The maximum likelihood and neighbor joining molecular evolutionary trees of COX I on the mitochondria of 18 samples

2.2 特異性試驗(yàn)

選取青海不同虹鱒養(yǎng)殖場(chǎng)的虹鱒10 份，市售不同種類的魚17 份，用引物ATP6-F/R 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，結(jié)果如圖2 所示。

圖2 虹鱒源性成分檢測(cè)的特異性試驗(yàn)Fig.2 Specific detection of rainbow trout-origin components

在32 個(gè)循環(huán)之前只對(duì)虹鱒進(jìn)行了擴(kuò)增， 對(duì)其它（大西洋鮭魚、帶魚、大黃魚、中國(guó)蘆花、秋刀魚、尼羅羅非魚、草魚、鲅魚、大眼鱖、石斑、藍(lán)鰭金槍魚、黃鰭金槍魚、大目金槍魚、長(zhǎng)鰭金槍魚、比目魚、錦鯉、鯽魚）17種魚、空白對(duì)照未見擴(kuò)增曲線，說明該方法特異性良好，可用于虹鱒源性的樣品的檢測(cè)判定值為32 個(gè)循環(huán)，在32 個(gè)循環(huán)之前出現(xiàn)明顯擴(kuò)增曲線的，判定為陽性；在32 個(gè)循環(huán)之前未出現(xiàn)明顯擴(kuò)增曲線的，判定為陰性。

2.3 DNA 靈敏度試驗(yàn)

驗(yàn)證TaqMan 探針方法的DNA 靈敏度結(jié)果如圖3 所示。

由圖3 可知，在這6 個(gè)濃度梯中50、10、1、0.1 ng/μL在32 個(gè)循環(huán)前有擴(kuò)增，0.01、0.001 ng/μL 在32 個(gè)循環(huán)之前無擴(kuò)增，表明本方法的靈敏度為0.1 ng/μL。

圖3 DNA 濃度靈敏度試驗(yàn)Fig.3 Sensitivity of different DNA concentration

2.4 市售樣品的檢測(cè)結(jié)果

對(duì)表1 中1 號(hào)～22 號(hào)樣品的檢測(cè)結(jié)果如圖4 所示。

由圖4 可知，2 份市售三文魚生魚片和8 份網(wǎng)購的三文魚及制品在32 個(gè)循環(huán)之前出現(xiàn)明顯擴(kuò)增曲線，判定為陽性即檢出虹鱒源性成分， 另外2 份市售三文魚生魚片和10 份網(wǎng)購的三文魚及制品在循環(huán)之前未出現(xiàn)明顯擴(kuò)增曲線的，判定為陰性即未檢出虹鱒源性成分；對(duì)擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行測(cè)序分析，測(cè)序結(jié)果與測(cè)試結(jié)果一致。

圖4 市售樣品檢測(cè)的DNA 擴(kuò)增譜圖Fig.4 DNA amplification profile of commercially available samples

3 結(jié)論

本研究首先對(duì)收集的樣品用線粒體COX I 基因的部分特異區(qū)段設(shè)計(jì)的引物FISH F/R 進(jìn)行擴(kuò)增測(cè)序，驗(yàn)證了收集樣品的真實(shí)性；進(jìn)而通過設(shè)計(jì)虹鱒特異性的引物探針， 建立了針對(duì)虹鱒源性成分的實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè)方法，利用17 種市場(chǎng)常見魚類進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明本方法特異性良好，并根據(jù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)設(shè)定32 個(gè)循環(huán)以后出峰的是未檢出樣品，為陰性；經(jīng)DNA 梯度稀釋驗(yàn)證本方法的靈敏度為0.1 ng/μL， 對(duì)市售22 份標(biāo)有鮭科魚源性成分的樣品進(jìn)行測(cè)試，表明本方法可用于對(duì)市售產(chǎn)品中虹鱒源性成分的鑒別，同時(shí)也表明虹鱒是市售三文魚的主要魚種之一。