區(qū)楚君，尚岱麒，吳酉芝，2，施春雷*

（1 上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院 上海200240 2 上海中僑職業(yè)技術(shù)大學(xué) 上海201319）

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，以下簡稱為金葡菌）一直以來都是我國監(jiān)測(cè)的主要食源性致病菌之一。金葡菌之所以受到廣泛的關(guān)注，是由于越來越多的案例證實(shí)，其不僅在食品中引起人群食物中毒和乳制品污染，而且在醫(yī)療過程中頻繁引起醫(yī)院和社區(qū)獲得性感染，導(dǎo)致許多疾病難以完全治愈。金葡菌一般均具有較強(qiáng)的菌膜形成能力，使其廣泛地存在于自然界的各種環(huán)境中，甚至人畜共患[3-4]。同時(shí)，菌膜被認(rèn)為是耐藥性傳播的一種潛在載體，近年來日益凸顯的細(xì)菌耐藥性問題使得越來越多研究者的目光投向具有強(qiáng)菌膜形成能力的金葡菌。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)金葡菌存在多重耐藥現(xiàn)象[5]，可能成為細(xì)菌耐藥性傳播的載體[6]，導(dǎo)致更加嚴(yán)重的耐藥性問題。由此，金葡菌被世界衛(wèi)生組織列為“高危害”監(jiān)控對(duì)象[7]，我國也逐步提高了對(duì)金葡菌的重視程度。

監(jiān)控金葡菌的前提是能夠有效鑒別、分離食品中的金葡菌。試驗(yàn)中一般依據(jù)GB 4789.10-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)》分離、鑒定食品基質(zhì)中的金葡菌。該方法的主要步驟為：將待檢測(cè)的食品放入無菌袋中，加入7.5%氯化鈉肉湯進(jìn)行增菌培養(yǎng)，然后根據(jù)Baird-Parker 瓊脂平板和血平板上劃線培養(yǎng)后的特異性現(xiàn)象鑒別、分離金葡菌。然而，本實(shí)驗(yàn)室研究人員前期試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)檢測(cè)冷凍肉（尤其是雞肉）及肉制品時(shí)，常會(huì)出現(xiàn)一層灰色物質(zhì)覆蓋在Baird-Parker 瓊脂平板上，改變了培養(yǎng)平板上可疑菌落的表觀形態(tài)（如圖1c所示），嚴(yán)重影響研究人員依據(jù)國標(biāo)進(jìn)行結(jié)果判定的準(zhǔn)確性，由此引起誤判而導(dǎo)致出現(xiàn)大量的假陰性結(jié)果。初步判斷該物質(zhì)為冷凍食品中污染的另一類背景雜菌，具有生長速度快（快于金葡菌）且擴(kuò)散性強(qiáng)的特性，不僅影響人眼判定的結(jié)果，而且在后續(xù)試驗(yàn)中無法分離單菌落，難以獲得較好的純化結(jié)果。同時(shí)該雜菌也存在溶血現(xiàn)象，在血平板上的培養(yǎng)特征與金葡差異性不大，會(huì)產(chǎn)生大量的假陽性結(jié)果，因此本試驗(yàn)不采用血平板作為選擇性平板。為了解決此類食品中存在雜菌污染無法分離金葡菌的問題，本研究根據(jù)金葡菌的生物學(xué)特性和其它文獻(xiàn)研究，優(yōu)化國家標(biāo)準(zhǔn)中的增菌方法，引入改良后的胰蛋白酶大豆瓊脂（TSA）平板分離雜菌及純化金葡菌單菌落，以降低假陰性結(jié)果的出現(xiàn)，避免多次純化而造成試驗(yàn)資源的浪費(fèi)。

圖1 金葡菌受背景雜菌干擾時(shí)在Baird-Parker 平板上的菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of S.aureus on Baird-Parker plate with the interference of background flora

有研究表明，金葡菌具有耐鹽性，在10%～15%的高鹽環(huán)境中也能生長良好[8]，且在食品中提高鹽濃度一直以來被視為抑制雜菌生長的有效手段。本試驗(yàn)通過提高增菌液中氯化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)來抑制雜菌的生長，以此改變金葡菌與雜菌的相對(duì)豐度，使得金葡菌成為增菌液中的優(yōu)勢(shì)菌，更易分離。同時(shí)，金葡菌可耐受低濃度的乙醇，0～1.5%乙醇對(duì)金葡菌生長無顯著影響[9]，甚至在2.5%～3.5%的乙醇脅迫下，金葡菌的菌膜形成能力會(huì)增加[10]。而乙醇作為一種常見的殺菌手段，絕大部分的雜菌對(duì)乙醇敏感。據(jù)此，將一定量的乙醇加入胰蛋白酶大豆瓊脂（TSA）平板中，可以達(dá)到抑制雜菌生長的作用。除了抑制雜菌生長外，在應(yīng)對(duì)雜菌的擴(kuò)散性上，考慮增加TSA 中瓊脂的含量，使其難以在培養(yǎng)基中發(fā)生遷移，實(shí)現(xiàn)雜菌的分離與金葡菌的純化。本文研究以上3 個(gè)因素（增菌液中氯化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)、TSA 中乙醇的添加量和瓊脂的添加量）對(duì)雜菌的影響，以期實(shí)現(xiàn)抑制雜菌生長和擴(kuò)散，降低金葡菌分離中出現(xiàn)假陰性結(jié)果的可能性。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

本試驗(yàn)中涉及的金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 29213、ATCC 43300、Newman、SJTUF 21456、SJTUF 21510 以及分離純化后的雜菌，均為本實(shí)驗(yàn)室保存菌株。

Baird-Parker 瓊脂（BP）、胰蛋白酶大豆肉湯（TSB）、7.5%氯化鈉肉湯，北京陸橋技術(shù)股份有限公司；95%乙醇，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；LB 平板（10 g/L 胰蛋白胨、5 g/L 酵母提取物、10 g/L 氯化鈉、15 g/L 瓊脂）；細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒，北京天根生化科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

5424D 型微量臺(tái)式離心機(jī)、Mastercycler 型PCR 擴(kuò)增儀，德國Eppendorf 公司；ES-315 型高壓蒸汽滅菌鍋，日本TOMY 公司；ZQZY-CF 型全溫恒溫培養(yǎng)搖床，上海知楚儀器有限公司；Sunrise 酶標(biāo)儀，瑞士Tecan 公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株活化及工作菌液的制備 取出-80℃超低溫冰箱保存的菌株，使用接種環(huán)在TSA 平板上劃線，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)18～24 h。在平板上挑取單菌落轉(zhuǎn)接至TSB 中，于37℃，200 r/min 條件下在搖床培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)10～12 h。取出后，10 000 r/min 離心30 s，棄去上清液，用0.85%氯化鈉的生理鹽水清洗沉淀，重復(fù)離心和清洗沉淀2 次，最后調(diào)節(jié)菌液的OD600nm 值為0.8 ±0.02。

1.3.2 確定接種比例將ATCC 29213 和雜菌調(diào)節(jié)至一致的OD600nm值，按1∶2，1∶1，2∶1 的比例，接種至10 mL 7.5%氯化鈉肉湯中，于37℃，200 r/min 條件下在搖床培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h。稀釋后涂步于BP 平板上，監(jiān)測(cè)2 種菌競(jìng)爭生長情況，根據(jù)菌落計(jì)數(shù)法的結(jié)果確定最終的接種比例。

1.3.3 增菌液優(yōu)化設(shè)置3 種分別含7.5%，10%，15%氯化鈉的肉湯。將ATCC 29213 和雜菌按1.3.2 節(jié)確定好的比例接種至10 mL 含有不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)氯化鈉的肉湯中，設(shè)置為試驗(yàn)組。并把1 μL 的ATCC 29213 菌液接種至10 mL 含有不同氯化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的肉湯中，設(shè)置為對(duì)照組。把2 組菌液同時(shí)置于37℃，200 r/min 條件下的搖床培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)18 h。培養(yǎng)結(jié)束后，劃線于BP 平板，監(jiān)測(cè)2 組的污染程度，根據(jù)菌落計(jì)數(shù)法的結(jié)果確定增菌效果。

1.3.4 TSA 分離平板優(yōu)化 根據(jù)實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)，用單因素試驗(yàn)的方法確定瓊脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)、乙醇體積分?jǐn)?shù)以及培養(yǎng)時(shí)間每個(gè)因素的取值范圍，并設(shè)計(jì)了如表1所示的正交試驗(yàn)。以擴(kuò)散半徑、計(jì)數(shù)法和劃線情況對(duì)比評(píng)價(jià)分離效果。其中，在平板中心處點(diǎn)種，培養(yǎng)結(jié)束后測(cè)量3 處中心點(diǎn)至菌落邊緣的長度，然后取平均值作為擴(kuò)散半徑。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 The design of orthogonal test

1.3.5 驗(yàn)證性試驗(yàn)

1.3.5.1 普適性試驗(yàn) 將本實(shí)驗(yàn)室保存的菌株ATCC 43300、Newman、SJTUF 21456、SJTUF 21510活化后，按1.3.2 節(jié)確定好的比例將純種金葡菌菌株與雜菌混合，然后接種至優(yōu)化后的氯化鈉肉湯中，驗(yàn)證優(yōu)化后的方法的分離效果。

1.3.5.2 采樣分離試驗(yàn) 隨機(jī)選取不同的采樣點(diǎn)進(jìn)行食品樣品的采集工作，檢測(cè)優(yōu)化后的方法在實(shí)際應(yīng)用中的分離鑒定效果。

1.3.5.3 雜菌種、屬鑒定 將雜菌劃線于改良后的TSA 平板上，挑取單菌落接種至TSB 中，于37℃，200 r/min 條件下在搖床培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)10～12 h。使用細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒完成DNA 提取。

通過16S rDNA 測(cè)序的方法確定雜菌的種、屬，通用引物序列為：27F 5’-AGAGTTT GATCMTGGCTCAG-3’，1492R 5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’。相對(duì)應(yīng)的PCR 反應(yīng)參數(shù)為：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性30 s；54℃復(fù)性30 s；72℃延伸90 s；72℃復(fù)性和延伸10 min；35個(gè)循環(huán)。

2 結(jié)果與討論

2.1 確定接種比例

BP 平板培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)不同混合接種比例的雜菌都覆蓋了整個(gè)平板表面（培養(yǎng)結(jié)果沒有明顯區(qū)別，故未放圖）。雜菌的接種比例越高，平板上的污染越明顯，越難以通過人眼辨別金葡菌菌落的典型狀態(tài)。而3 種混合接種比例（1∶2，1∶1，2∶1）分別對(duì)應(yīng)的平板上的金葡菌菌落數(shù)為1.1×107，1.5×107，7.5×106 CFU/mL。根據(jù)雜菌在BP 平板上的污染程度以及金葡菌的菌落總數(shù)，確定本試驗(yàn)中純種金葡菌和雜菌的混合接種比例為1∶1。

2.2 增菌液優(yōu)化結(jié)果

從BP 平板上的培養(yǎng)結(jié)果（表2）可以看出，10%氯化鈉肉湯比7.5%氯化鈉肉湯能夠分離出更多的金葡菌。

表2 使用不同氯化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的肉湯增菌后的平板計(jì)數(shù)結(jié)果Table 2 Colony counting results after enrichment with different NaCl mass fraction

通過計(jì)數(shù)法得到的培養(yǎng)結(jié)果顯示，使用7.5%氯化鈉肉湯增菌，對(duì)照組培養(yǎng)得到的菌落總數(shù)比試驗(yàn)組更多，說明金葡菌的生長受到了雜菌的影響。已有研究表明，金葡菌很難與基質(zhì)中的其它微生物菌群競(jìng)爭生長，即便是在更利于金葡菌生長的環(huán)境中，其它菌群也能夠以包括營養(yǎng)競(jìng)爭作用、拮抗作用和改變基質(zhì)環(huán)境（如競(jìng)爭消耗提供營養(yǎng)的底物、產(chǎn)生有機(jī)酸降低pH 值、增加氧氣的消耗以改變氧濃度和氧化還原電位等）在內(nèi)的多種方式成為優(yōu)勢(shì)菌[11]。

氯化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加至10%，試驗(yàn)組的計(jì)數(shù)結(jié)果為4.13×107CFU/mL，對(duì)照組的計(jì)數(shù)結(jié)果為4.10×107CFU/mL，兩者間相差不大，由此可以看出，氯化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)高對(duì)金葡菌的生長影響并不明顯，而對(duì)雜菌的抑制作用更強(qiáng)，使其與金葡的競(jìng)爭能力下降。已有研究表明，金葡菌菌膜形成相關(guān)基因——icaA 在鹽濃度較高的情況下表達(dá)量上升[12]，更有利于菌膜形成[13]，由此可減少高鹽濃度的影響。同時(shí)，在高氯化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的刺激下，金葡菌細(xì)胞質(zhì)膜中的脂質(zhì)成分也會(huì)出現(xiàn)變化，雙磷脂酰甘油的合成量上升[14]。此外，金葡菌菌體也會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的應(yīng)激改變，如細(xì)胞體積變大、表面積減小、細(xì)胞壁的厚度和重量增加等[15]。這些鹽脅迫反應(yīng)都能夠減弱高氯化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)金葡菌生長的影響，增加金葡菌對(duì)10%氯化鈉的耐受性。

然而當(dāng)氯化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%時(shí)，無論是BP平板的劃線結(jié)果還是計(jì)數(shù)結(jié)果都表明金葡與雜菌均受到強(qiáng)烈的抑制，僅有少數(shù)菌體幸存。

2.3 TSA 分離平板優(yōu)化結(jié)果

表3的試驗(yàn)結(jié)果表明，在培養(yǎng)基中添加乙醇和瓊脂，金葡菌生長不受抑制；而試驗(yàn)組1～5 的擴(kuò)散半徑均大于0.2 cm，且劃線結(jié)果顯示雜菌和金葡菌無法分離，表明雜菌擴(kuò)散的程度較高。對(duì)比試驗(yàn)組6 和試驗(yàn)組9，雜菌生長受到抑制，然而試驗(yàn)組6 的擴(kuò)散半徑較大，表明該分離平板條件對(duì)雜菌擴(kuò)散性的抑制作用較差。從整體試驗(yàn)結(jié)果來看，試驗(yàn)組9 的分離效果最佳，不僅抑制了雜菌的生長，同時(shí)也有效地抑制了雜菌的擴(kuò)散。

表3 TSA 分離平板優(yōu)化效果評(píng)價(jià)Table 3 Evaluation on the optimization effect of TSA separation plate

2.4 驗(yàn)證性試驗(yàn)

普適性試驗(yàn)結(jié)果顯示，4 種金葡菌（ATCC 43300、Newman、SJTUF 21456、SJTUF 21510）在BP 平板上均能被有效辨識(shí)，菌落數(shù)分別為5，14，6，6 CFU。在后續(xù)的的分離純化步驟中，金葡菌能夠在改良后的TSA 平板上形成單菌落，如圖2所示，同時(shí)雜菌與金葡菌明顯分離，沒有出現(xiàn)擴(kuò)散現(xiàn)象。

圖2 4 株金黃色葡萄球菌在改良TSA 平板上的菌落形態(tài)Fig.2 The colony morphology of 4 strains on the modified TSA plates

把優(yōu)化后的方法用于實(shí)際樣品的分離、鑒定試驗(yàn)中，通過對(duì)比可以看到，食品基質(zhì)中的金葡菌分離率由2.61%提升為19.98%（表4）。這些實(shí)際案例表明該優(yōu)化方法有效地降低了假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。

表4 方法改進(jìn)前、后金葡菌分離情況對(duì)比Table 4 Comparison of separation of S.aureus before and after the improvement of the method

通過細(xì)菌16S rDNA 測(cè)序方法鑒定了該雜菌的種屬，結(jié)果顯示該雜菌為奇異變形桿菌。

盡管冷鏈儲(chǔ)存和運(yùn)輸在一定程度上防止了食品的腐敗，但其后不恰當(dāng)?shù)谋４婧褪圪u方式卻引發(fā)了嚴(yán)重的奇異變形桿菌污染。這個(gè)問題可能成為未來冷藏和冷凍食品保藏的一大挑戰(zhàn)。

3 結(jié)論

從冷凍肉及肉制品中分離金葡菌時(shí)，增菌液中氯化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)提高到10%可以有效地抑制背景雜菌的生長，而對(duì)金葡菌影響不大。當(dāng)BP 平板上出現(xiàn)嚴(yán)重的雜菌擴(kuò)散污染時(shí)，可挑取疑似菌落劃線于含有2%乙醇和4%瓊脂的TSA 平板上，靜置培養(yǎng)18 h，由此可使金葡菌與雜菌完全分離。利用這一改進(jìn)的方法，可有效降低假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。