王 曉，俞 英

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院農(nóng)業(yè)部畜禽遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室&畜禽育種國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，北京 100193)

中國(guó)北方奶牛金葡菌乳房炎感染現(xiàn)狀及耐藥性和流行類型研究進(jìn)展

王 曉，俞 英*

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院農(nóng)業(yè)部畜禽遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室&畜禽育種國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，北京 100193)

奶牛乳房炎，尤其是由金黃色葡萄球菌(金葡菌)感染引起的隱性乳房炎是最難以防控的奶牛常見(jiàn)病。近五年來(lái)，本課題組對(duì)中國(guó)北方六個(gè)省市九個(gè)荷斯坦牛場(chǎng)的生產(chǎn)群高體細(xì)胞數(shù)(SCC)和低SCC奶牛以及臨床乳房炎奶牛進(jìn)行了十一批次采樣，共采集奶樣1 112頭份，分離出191株金葡菌，所檢測(cè)牛的平均金葡菌感染率達(dá)11.7%，其中生產(chǎn)群奶牛金葡菌感染率為12.4%，臨床乳房炎牛為10.8%。對(duì)這些金葡菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)以及毒素基因檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)氯霉素和阿米卡星對(duì)金葡菌有較強(qiáng)抑制性，毒素基因檢出率最高者是殺白細(xì)胞素基因PVL(70.2%)。依據(jù)金葡菌PFGE分型結(jié)果繪制中國(guó)北部及華東地區(qū)奶牛乳源金葡菌的流行圖譜。結(jié)合國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究結(jié)果，對(duì)比分析了國(guó)內(nèi)外奶牛金葡菌乳房炎的感染情況以及金葡菌的耐藥性、毒素基因和流行類型，并提出了降低奶牛感染金葡菌乳房炎的相關(guān)策略。

奶牛乳房炎；金黃色葡萄球菌；耐藥性；流行類型

奶牛乳房炎(mastitis)又稱乳腺炎，是奶牛最常見(jiàn)、危害最大的疾病之一，目前全球每年因該病造成的損失約350億美元[1-2]。奶牛乳房炎不僅影響奶牛的產(chǎn)奶量、降低原料奶的品質(zhì)，還會(huì)影響奶牛正常生理功能，延長(zhǎng)產(chǎn)后發(fā)情時(shí)間，嚴(yán)重的會(huì)造成奶牛過(guò)早淘汰而增加牛群更替成本。奶牛乳房炎以隱性乳房炎發(fā)病率最高、危害最大，此類患病牛沒(méi)有明顯肉眼可見(jiàn)的臨床癥狀，但已然是牛群的乳房炎感染源。全球約三分之一以上的奶?；加胁煌潭鹊碾[性乳房炎，我國(guó)奶牛隱性乳房炎的發(fā)病率高達(dá)25%～68%[3]。金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，S.aureus，簡(jiǎn)稱金葡菌)是導(dǎo)致奶牛隱性乳房炎的主要致病菌[4]。該菌具有較強(qiáng)的免疫抑制特征和耐藥性，由其引起的奶牛乳房炎難以治愈，治愈后復(fù)發(fā)率高，因此一旦發(fā)現(xiàn)金葡菌感染牛，通常只能淘汰，造成較大經(jīng)濟(jì)損失。我國(guó)北方是中國(guó)奶牛的主要養(yǎng)殖區(qū)，對(duì)我國(guó)奶業(yè)發(fā)展具有舉足輕重的地位。作者對(duì)我國(guó)北方六個(gè)省市的荷斯坦牛金葡菌乳房炎的感染現(xiàn)狀，結(jié)合國(guó)內(nèi)外其他相關(guān)研究對(duì)金葡菌的耐藥性、毒力基因種類和流行類型等進(jìn)行了綜述，并對(duì)降低奶牛金葡菌乳房炎感染的策略和方法進(jìn)行了總結(jié)和討論。

1 金葡菌基本特性及奶牛金葡菌乳房炎

1.1 金葡菌的耐藥性

金葡菌極易產(chǎn)生耐藥性，對(duì)常用的多種抗菌藥都不敏感[4]。近年來(lái)隨著抗菌藥的過(guò)度使用及濫用，金葡菌的多重耐藥性問(wèn)題也不斷加劇。目前，多個(gè)國(guó)家報(bào)道了奶牛奶樣中金葡菌多重耐藥現(xiàn)象，因此金葡菌的多重耐藥性已經(jīng)成為公共關(guān)注的社會(huì)問(wèn)題[5-7]。其中耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicilin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA)隨著抗菌藥的過(guò)度使用不斷出現(xiàn)。MRSA具有多重耐藥性是因其遺傳決定子mecA基因編碼青霉素結(jié)合蛋白2a，從而使金葡菌與β-內(nèi)酰胺類抗菌藥的親和力降低，造成對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗菌藥耐藥[8]。因此，對(duì)奶牛金葡菌多重耐藥性進(jìn)行研究和防控已經(jīng)非常必要。

1.2 金葡菌的毒素基因

金葡菌是一種環(huán)境型傳染性致病菌，可產(chǎn)生多種毒素。其中腸毒素(enterotoxins，SEs)為超抗原家族成員，是引起食物中毒的主要因子[9]，主要包括腸毒素A(SEA)、B(SEB)、C(SEC)、D(SED)、E(SEE)、G(SEG)、H(SEH)、I(SEI)和J(SEJ)等[10]。剝落毒素(exfoliative toxins，ETs)和休克綜合征毒素-1(toxic shock syndrome toxin-1，TSST-1)同為超抗原家族成員，也是引起食物中毒的主要因子[11]。ETs包括剝落毒素A(ETA)和剝落毒素B(ETB)，常引起表皮散熱功能失調(diào)[12-13]。TSST-1是休克綜合征毒素中最重要的一種，通常引起局部或者全身的中毒休克綜合征[14]。殺白細(xì)胞素(panton-valentine leukocidin，PVL)可殺死白細(xì)胞和巨噬細(xì)胞或破壞其功能，使細(xì)菌被吞噬后仍可在細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)繁殖，導(dǎo)致約40%的金葡菌乳房炎感染牛乳汁中體細(xì)胞數(shù)(somatic cell count,SCC)低于20萬(wàn)·mL-1[15]。

1.3 奶牛金葡菌乳房炎的致病機(jī)制

金葡菌通過(guò)奶牛的乳頭導(dǎo)管或乳房皮膚外傷等因素進(jìn)入奶牛的乳房組織，經(jīng)過(guò)一系列宿主—病原互作反應(yīng)引起乳腺發(fā)生炎癥反應(yīng)。金葡菌進(jìn)入奶牛乳腺后，首先表達(dá)鐵離子獲得受體(如IsdB)和錳離子上調(diào)受體(如ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)，為其在宿主體內(nèi)生長(zhǎng)繁殖獲得鐵離子和錳離子等最基本的營(yíng)養(yǎng)元素。其次，為了定居在宿主體內(nèi)并進(jìn)行繁殖，金葡菌黏附在宿主細(xì)胞膜表面。有黏附作用的金葡菌黏附素包括纖連蛋白結(jié)合蛋白A、B(FnBPA和FnBPB)，凝集因子A、B(ClfA和ClfB)，膠原蛋白結(jié)合蛋白(Cna)和表面蛋白A(SasA)等。為了在奶牛乳腺內(nèi)定居繁殖，金葡菌還有一系列逃避宿主細(xì)胞吞噬的機(jī)制，如莢膜多糖可阻隔抗體和其表面蛋白的接觸，從而阻止抗體介導(dǎo)的調(diào)理吞噬作用等[12-15]。因此，金葡菌具有較強(qiáng)的免疫抑制特征，常引起無(wú)明顯外觀變化而產(chǎn)奶量已顯著降低的隱性乳房炎。

目前關(guān)于臨床乳房炎牛的金葡菌感染情況及耐藥性報(bào)道較多[16-18]，但針對(duì)生產(chǎn)群泌乳牛的金葡菌研究報(bào)道較少[19]。

2 我國(guó)北方奶牛金葡菌乳房炎感染現(xiàn)狀

在生產(chǎn)群泌乳牛中，未被發(fā)現(xiàn)的金葡菌乳房炎隱性感染牛極易通過(guò)擠奶工、擠奶設(shè)備、蚊蠅叮咬等感染其他奶牛，因此宜盡早發(fā)現(xiàn)金葡菌感染牛，并及時(shí)隔離切斷金葡菌感染源，避免易感牛群的感染。

2.1 臨床乳房炎牛與生產(chǎn)群泌乳牛的金葡菌感染率

2009年至2013年間，本課題組分別從中國(guó)北方陜西省、北京市、黑龍江省、天津市、山西省和遼寧省六個(gè)省市及地區(qū)的9個(gè)奶牛場(chǎng)進(jìn)行11批次(A、B、C、D、E、F、G、H、I、J和K批次)的奶樣采集，采用無(wú)菌法采集了新鮮奶樣1 112頭份[20-23]。依據(jù)GB/T 4789.10-2008國(guó)標(biāo)方法對(duì)這些奶樣進(jìn)行金葡菌分離純化及特異基因的分子鑒定[20-23]，每份奶樣分離到1～2株菌，一共檢測(cè)出191株金葡菌，其中從A、B、C、D、E、F、G、H、I、J和K批次中分別分離出69、27、10、18、4、4、7、4、4、22和22株金葡菌(表1)。在這十一次采樣中，共采集生產(chǎn)群泌乳牛奶樣595頭份，乳房炎牛奶樣517頭份，其中生產(chǎn)群泌乳牛奶樣的平均金葡菌檢出率為12.4%，而乳房炎牛奶樣的平均金葡菌檢出率低于生產(chǎn)群泌乳牛，為10.8%，其中A、C和D批次臨床乳房炎牛奶樣的金葡菌檢出率均低于泌乳牛。分析其原因可能有兩種，其一是所采集臨床乳房炎牛已接受過(guò)抗菌藥等治療，其二是所檢測(cè)臨床乳房炎牛主要由其他類型病原感染所致。不同奶樣來(lái)源間比較，金葡菌檢出率最高者為北京地區(qū)某牛場(chǎng)的乳房炎牛奶樣(50.0%)，檢出率最低的為天津地區(qū)某牛場(chǎng)采集的泌乳牛奶樣(3.9%)。

表1 中國(guó)北方地區(qū)六省市荷斯坦牛奶樣金葡菌檢出率

Table 1 Detection rate ofS.aureusfrom Chinese Holstein milk samples in Northern China

采樣批次Batches采樣牛場(chǎng)Dairyfarms采樣時(shí)間Samplingtime樣品數(shù)Numberofsamples陽(yáng)性奶樣數(shù)(感染率/%)Positivesamples(Detectionrate，%)泌乳牛Milkingcows乳房炎牛Mastitiscows泌乳牛Milkingcows乳房炎牛Mastitiscows全部奶樣(感染率/%)Allsamples(Detectionrate，%)金葡菌數(shù)NumberofS．a(chǎn)ureus其他研究OtherresearchesA陜西2009．0111917623(19．3)26(14．8)295(14．6)69B北京一2011．020158015(9．5)158(9．5)27C黑龍江一2012．0341503(7．3)2(4．0)91(5．5)10D黑龍江二2012．0326783(11．5)6(7．7)104(8．7)18[17]E天津一2012．105004(8．0)050(8．0)4F天津一2012．1110304(3．9)0103(3．9)4[24]G山西2013．0179414(5．1)3(7．3)120(5．8)7[25]H遼寧一2013．062644(15．4)030(13．3)4I遼寧一2013．071002(20．0)010(20．0)4[26]J北京二2013．0783416(19．3)1(25．0)87(19．5)22[27]K北京三2013．0758611(19．0)3(50．0)64(21．9)22總計(jì)Total11批次9個(gè)牛場(chǎng)2009?201359551774(12．4)56(10．8)1112(11．7)191

不同國(guó)家和地區(qū)奶牛的金葡菌檢出率也有所變化。德國(guó)奶牛的金葡菌檢出率相對(duì)較低，研究者對(duì)6 915頭份無(wú)乳房炎的臨產(chǎn)母牛奶樣進(jìn)行金葡菌分離鑒定，檢出率為4.0%；1 325頭份初產(chǎn)牛和乳房炎牛奶樣的金葡菌檢出率為7.3%～11.5%[24]。比利時(shí)奶牛的金葡菌檢出率也不高，SCC大于25萬(wàn)的25 660份乳區(qū)奶樣的金葡菌檢出率為7.6%[25]。而埃塞俄比亞北部的奶牛金葡菌檢出率較高，采用美國(guó)加利福尼亞乳房測(cè)試法(Californian mastitis test，CMT)鑒定出的乳房炎陽(yáng)性牛的金葡菌檢出率高達(dá)41.7%，臨床乳房炎牛的金葡菌檢出率為27.3%[26]。在愛(ài)爾蘭，研究者發(fā)現(xiàn)SCC大于20萬(wàn)的285頭份奶樣的金葡菌檢出率為21%[27]。我國(guó)南方浙江省地區(qū)，890頭份奶牛的乳房炎陽(yáng)性乳區(qū)的奶樣金葡菌檢出率為12.2%[17]。本課題組所檢測(cè)的我國(guó)北方九個(gè)奶牛場(chǎng)荷斯坦牛的金葡菌感染率介于3.9%～21.9%，平均金葡菌感染率為11.7%，略低于浙江省檢測(cè)牛群，與德國(guó)初產(chǎn)牛和乳房炎牛的金葡菌檢出率相近。

2.2 高SCC與低SCC奶牛的金葡菌感染率

牛乳中體細(xì)胞數(shù)(somatic cell count，SCC)是指每毫升乳汁中體細(xì)胞的數(shù)量，健康牛乳汁中的SCC為乳腺正常脫落的上皮細(xì)胞，通常小于5萬(wàn)·mL-1。乳腺發(fā)生炎癥后，牛乳中SCC通常會(huì)劇增，主要成分是來(lái)自血液的白細(xì)胞。許多國(guó)家將SCC作為奶牛乳房炎的重要監(jiān)測(cè)指標(biāo)，目前我國(guó)對(duì)于健康牛、隱性乳房炎牛及乳房炎陽(yáng)性牛的SCC界定標(biāo)準(zhǔn)分別為低于10萬(wàn)·mL-1、20～50萬(wàn)·mL-1及高于50萬(wàn)·mL-1。

據(jù)報(bào)道，近40%的金葡菌乳房炎感染牛的乳汁SCC低于20萬(wàn)·mL-1[15]，這些帶菌牛易被誤認(rèn)為健康牛而成為整個(gè)牛群的金葡菌感染源。為分析我國(guó)北方生產(chǎn)群泌乳牛的金葡菌感染情況，結(jié)合乳房炎監(jiān)測(cè)指標(biāo)SCC，進(jìn)一步對(duì)采樣批次C、D、E、F、G、H、I、J和K的泌乳牛進(jìn)行高SCC和低SCC牛的金葡菌感染率分析。其中高SCC和低SCC牛的劃分標(biāo)準(zhǔn)是相鄰兩個(gè)測(cè)定日的SCC差值高低[22-23]：如果SCC2- SCC1≤μ且SCC2≤μ、SCC1≤μ，則該牛為低SCC牛；如果SCC2-SCC1>μ且SCC2>μ、SCC1≤μ，則為高SCC牛。其中，SCC1為采樣日前一月的SCC測(cè)定日記錄，SCC2為采樣月的SCC值，μ為該牛場(chǎng)SCC的平均值。

采樣批次E、F、G、J和K的高SCC牛奶樣金葡菌檢出率要高于低SCC牛奶樣，可見(jiàn)多數(shù)牛場(chǎng)的高SCC牛比低SCC牛的金葡菌分離率高(圖1)。D、H和I批次的低SCC牛奶樣沒(méi)有分離出金葡菌，D和I批次的高SCC牛奶樣有較高的金葡菌檢出率，分別為40%和50%(圖1)。因此，依據(jù)SCC差值法所確定的高SCC牛比低SCC牛更可能是金葡菌感染的隱性乳房炎牛，對(duì)于這些高SCC牛應(yīng)及時(shí)進(jìn)行乳樣的金葡菌檢測(cè)，防止其從隱性乳房炎發(fā)展成臨床乳房炎。值得注意到是，C、J和K三場(chǎng)(批次)的低SCC牛奶樣的金葡菌分離率(20.8%～37.5%)要高于所檢測(cè)牛的平均水平(11.7%)，這些低SCC?；诔Ｒ?guī)SCC指標(biāo)不易發(fā)現(xiàn)是金葡菌隱性乳房炎感染牛，因此應(yīng)特別關(guān)注分離出金葡菌的低SCC牛，避免其成為難以防控的金葡菌感染源。

圖1 C-K批次高SCC和低SCC牛奶樣的金葡菌感染率Fig.1 Detection rate of S.aureus isolated from cow milk samples with high and low SCC from C to K sampling batches

3 奶牛乳源金葡菌的耐藥性

目前金葡菌乳房炎牛的治療效果不穩(wěn)定，治愈后復(fù)發(fā)率高，分離純化出的乳源金葡菌存在較強(qiáng)耐藥性現(xiàn)象，作者通過(guò)藥敏試驗(yàn)檢測(cè)了乳源金葡菌的耐藥性。根據(jù)CLSI(Clinical and Laboratory Standards Institute)標(biāo)準(zhǔn)，采用紙片擴(kuò)散法和瓊脂稀釋法檢測(cè)了B、C、D、I、J和K批次奶樣的38種抗菌藥的藥敏性[20，23](表2)。在這些抗菌藥中，21種為獸用臨床抗菌藥、17種為非獸用臨床抗菌藥(《中華人民共和國(guó)獸藥典》(2010版)和《獸藥手冊(cè)》)[28-29]。

通過(guò)兩種藥敏試驗(yàn)方法發(fā)現(xiàn)，所檢測(cè)的全部金葡菌對(duì)氯霉素和萬(wàn)古霉素敏感，對(duì)阿米卡星和頭孢哌酮的敏感性也較高。但金葡菌的耐藥性也相當(dāng)突出，其中北京地區(qū)B、J和K批次奶樣所分離出的金葡菌對(duì)復(fù)方新諾明有較高耐藥性，耐藥率分別為80%、100%和100%。J和K批次奶樣的金葡菌對(duì)環(huán)丙沙星(100%和100%)和頭孢西丁(90.9%和95.5%)的耐藥率較高，而B批次奶樣中的金葡菌對(duì)環(huán)丙沙星(16%)和頭孢西丁(20%)的耐藥率較低(表2)。黑龍江地區(qū)C、D批次奶樣分離出的金葡菌對(duì)頭孢類、大環(huán)內(nèi)酯類、氟喹諾酮類和氨基糖苷類抗菌藥都敏感，其耐藥率明顯低于B、J、K場(chǎng)。青霉素類和頭孢類抗菌藥同屬β-內(nèi)酰胺類抗菌藥，對(duì)革蘭陽(yáng)性菌有明顯的抗菌效果，其中頭孢類抗菌藥作為高效金葡菌抗菌藥，有更好的殺菌效果。如表2所示，金葡菌對(duì)頭孢類抗菌藥的耐藥率為0%～4.0%，明顯低于青霉素類抗菌藥(21.8%～33.7%)，但頭孢西丁的耐藥率較高，達(dá)51.5%，這可能與該類抗菌藥過(guò)度使用有關(guān)。

國(guó)內(nèi)其他相關(guān)研究也發(fā)現(xiàn)浙江、河北等省市地區(qū)奶牛乳源金葡菌具有較強(qiáng)耐藥性。其中，浙江省金華市和臺(tái)州市泌乳牛奶樣分離的金葡菌對(duì)氯霉素有較高耐藥率(61.1%和62.5%)，而杭州市和寧波市分離的金葡菌對(duì)氯霉素的耐藥率較低(13.2%和20.0%)。金華、臺(tái)州、杭州和寧波這四個(gè)地區(qū)分離的金葡菌對(duì)環(huán)丙沙星(22.2%、12.5%、5.3%和0%)和頭孢西丁的耐藥率較低(5.6%、0%、2.6%和0%)，此結(jié)果與北京地區(qū)B批次奶樣金葡菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果類似[17]。對(duì)內(nèi)蒙古、河北和黑龍江三省的835頭份奶樣分離的236株金葡菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，環(huán)丙沙星和頭孢西丁的耐藥率分別為20.3%和22.0%[18]。張靜等通過(guò)藥敏試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，44株來(lái)自泌乳牛奶樣的金葡菌和57株來(lái)自臨床乳房炎牛奶樣的金葡菌對(duì)氯霉素的耐藥率分別為11.4%和28.1%，其中泌乳牛奶樣金葡菌的耐藥率均為0%，而乳房炎牛奶樣金葡菌對(duì)環(huán)丙沙星和頭孢西丁的耐藥率分別為24.6%和19.3%[30]。

采樣批次B、J和K是來(lái)自北京地區(qū)三個(gè)荷斯坦牛場(chǎng)的奶樣，這些奶樣的金葡菌感染率有較大差異、分離出的金葡菌對(duì)環(huán)丙沙星和頭孢西丁的耐藥率也各不相同，因此應(yīng)針對(duì)不同牛場(chǎng)有效使用藥物，避免抗菌藥濫用。目前，氯霉素和阿米卡星對(duì)中國(guó)北方地區(qū)分離的金葡菌有較強(qiáng)的抑制性，因此推薦將這些抗菌藥作為所檢測(cè)牛場(chǎng)的金葡菌乳房炎牛治療藥物。

4 奶牛乳源金葡菌的毒素基因及流行類型

4.1 奶牛乳源金葡菌的毒素基因

檢測(cè)乳源金葡菌的毒素基因有利于分析其毒素及毒性。對(duì)A、B、C和D四批次奶樣分離到的124株乳源金葡菌進(jìn)行了毒素基因檢測(cè)[20-21]，其中腸毒素基因檢出率達(dá)44.4%；未檢測(cè)出SEE、TSST-1、ETA和ETB基因；編碼殺白細(xì)胞素的PVL基因檢出率最高，平均為70.2%，其在C場(chǎng)奶樣金葡菌的檢出率達(dá)100%。值得注意的是，在A批次分離出的69株金葡菌中，有5株來(lái)自臨床乳房炎牛奶樣的金葡菌含有mecA基因(7.2%)，為MRSA菌株，而其他奶樣金葡菌未檢測(cè)出mecA基因(表3)。

表3 A、B、C和D批次奶樣金葡菌毒素基因檢測(cè)結(jié)果

Table 3 Detection results of toxic genes ofS.aureusisolated from A，B，C and D milk samples

毒素基因Toxicgenes不同批次金葡菌數(shù)(檢出率/%)No．ofS．a(chǎn)ureus(Detectionrate，%)indifferentbatchA(n=69)B(n=27)C(n=10)D(n=18)總計(jì)(n=124)Total(n=124)其他研究OtherresearchesmecA5(7．2)0005(4．0)SEA4(5．8)001(5．6)5(4．0)SEB3(4．3)02(20)05(4．0)SEC02(7．4)04(22．2)6(4．8)SED5(7．2)3(11．1)06(33．3)14(11．3)SEE00000SEG002(20)2(11．1)4(3．2)SEH003(30)6(33．3)9(7．3)SEI001(10)01(0．8)SEJ2(2．9)6(22．2)03(16．7)11(8．9)TSST?100000ETA00000ETB00000PVL47(68．1)20(74．1)10(100)10(55．6)87(70．2)[19][30][37][38]

一些金葡菌含有多種毒素基因。其他研究文獻(xiàn)用于對(duì)比分析本課題組研究結(jié)果

SomeS.aureusisolates contain various toxic genes.The other references from other research teams are used for comparing

mecA是葡萄球菌基因組上一段可移動(dòng)DNA片段(Staphylococcalcassette chromosome mec，SCCmec)上的基因，SCCmec很容易整合到金葡菌基因組上。該SCCmec上的mecA基因在金葡菌中編碼青霉素結(jié)合蛋白2a，對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素藥產(chǎn)生耐藥性[31-32]，導(dǎo)致牛場(chǎng)出現(xiàn)較嚴(yán)重的耐甲氧西林金葡菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA)。目前已經(jīng)有大量研究報(bào)道了mecA陽(yáng)性的MRSA菌株[5-7，33]，對(duì)mecA陰性的MRSA菌也有相關(guān)研究報(bào)道[34]，這些mecA陰性的MRSA主要是因?yàn)榻鹌暇泻信cmecA基因功能相似的mecC基因，從而導(dǎo)致對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗菌藥的耐藥性[35-36]。因此，所有檢測(cè)到的金葡菌感染牛應(yīng)及時(shí)隔離，盡早檢測(cè)金葡菌的各類毒素基因和mecA及mecC基因，以確定金葡菌的毒性，避免MRSA感染同群其他牛。

張靜等對(duì)44株泌乳牛奶樣金葡菌和57株臨床乳房炎奶樣金葡菌進(jìn)行mecA基因及毒素基因檢測(cè)，其中6株來(lái)自臨床乳房炎奶牛的金葡菌檢測(cè)到mecA基因；此外腸毒素基因檢出率達(dá)72.2%，高于本課題組的檢出率(44.4%)；PVL基因在泌乳牛奶樣金葡菌中的檢出率顯著高于乳房炎牛，分別為84.0%和19.3%[30]，其中泌乳牛的PVL基因檢出率與本課題組結(jié)果相近(70.2%)。S.C.Wang等對(duì)內(nèi)蒙古和上海地區(qū)的泌乳牛奶樣金葡菌進(jìn)行毒素基因檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)63.6%的金葡菌含有一種以上的腸毒素基因[19]，高于本課題組的檢出率。B.Günaydin等對(duì)土耳其牛場(chǎng)的研究發(fā)現(xiàn)其奶源金葡菌中存在SEC、SED、SEG、SEI、SEJ和TST基因，其中檢出率最高的是SEG和SEI基因[37]。S.I.Salasia等研究發(fā)現(xiàn)，印度尼西亞瓜哇島分離到的奶牛乳源金葡菌主要含有SEB、SEG、SEH和SEI基因，而在德國(guó)海賽地區(qū)主要含有SEC、SED、SEG、SHE、SEI、SEJ和TST基因，但這兩個(gè)地區(qū)的金葡菌都不含有SEA和SEE基因[38]。

4.2 奶牛乳源金葡菌的流行類型

中國(guó)北方地區(qū)不同牛場(chǎng)間乳源金葡菌的耐藥性和毒素基因種類有所不同，除治療乳房炎時(shí)使用抗菌藥種類及劑量不同外，另一個(gè)原因是各牛場(chǎng)的金葡菌流行類型有所不同。

脈沖場(chǎng)凝膠電泳(pulsed-field gel electrophoresis，PFGE)是金葡菌基因分型的“黃金標(biāo)準(zhǔn)“，具有較好的分型性、分辨力和重復(fù)性，能較好地反映金葡菌類型與流行病學(xué)的相關(guān)性，現(xiàn)廣泛用于確定不同地區(qū)金葡菌流行類型，分析金葡菌傳染源及不同牛場(chǎng)間的交叉?zhèn)魅究赡苄訹20，22]。

圖2顯示了中國(guó)西北、東北、華北及華東四個(gè)地區(qū)奶牛乳源金葡菌的主要PFGE分型圖譜?？梢钥闯觯膫€(gè)地區(qū)金葡菌的PFGE分型有所差別，其中東北地區(qū)的黑龍江省和華北地區(qū)的北京市之間差異相對(duì)較小，西北地區(qū)山西省和華東地區(qū)的浙江省差異較大。C和D批次奶樣來(lái)源于黑龍江省的兩個(gè)牛場(chǎng)，其分離出的金葡菌PFGE分型結(jié)果相似性很高[20]。其中黑龍江一(C批次)分離的2株金葡菌和黑龍江二(D批次)分離的8株金葡菌都屬于PFGE分型的P3類型[20]，說(shuō)明兩場(chǎng)之間的金葡菌可能存在交叉感染現(xiàn)象，該類型金葡菌可能是黑龍江省金葡菌型奶牛乳房炎的流行株(10/28)[20]。今后將對(duì)分離出的其余金葡菌進(jìn)行PFGE分型，以確定所測(cè)牛場(chǎng)金葡菌型乳房炎的流行類型，為中國(guó)北方地區(qū)荷斯坦牛金葡菌乳房炎的防控提供重要數(shù)據(jù)。

5 防控奶牛感染金葡菌乳房炎的方法展望

金葡菌為環(huán)境型傳染性病原，為胞內(nèi)菌，具有強(qiáng)耐藥性，加強(qiáng)管理牛場(chǎng)環(huán)境及牛體衛(wèi)生只能治標(biāo)，防控奶牛感染金葡菌乳房炎的治本方法目前包括：1)研發(fā)奶牛金葡菌乳房炎免疫制劑、卵黃抗體、抗菌肽等生物制劑[39-41]；2)挖掘和鑒定牛群中帶有抗金葡菌乳房炎的主效基因的牛并加以有效利用。

5.1 抗金葡菌乳房炎的生物制劑

免疫制劑、抗菌肽等生物制劑對(duì)奶牛金葡菌乳房炎防治具有廣闊的應(yīng)用前景，但是生物制劑尚處于試驗(yàn)研究階段，而且局限于金葡菌保護(hù)性抗原的篩選和鑒定。進(jìn)一步研究應(yīng)借助小鼠試驗(yàn)?zāi)Ｐ停_定金葡菌保護(hù)性抗原，進(jìn)而研制出相應(yīng)的疫苗[42]。

5.2 抗金葡菌乳房炎的細(xì)胞因子及主效基因

同一牛群不同個(gè)體的金葡菌乳房炎抗性存在差異，可用于挖掘和鑒定抗金葡菌乳房炎的候選主效基因。L.Jiang等研究發(fā)現(xiàn)，IL-6(interleukin 6)、IL-8等基因在炎癥和免疫反應(yīng)通路中富集，其編碼的白介素與奶牛乳房炎有關(guān)[43]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，金葡菌陽(yáng)性牛和陰性牛血清中的IL-17和干擾素γ(interferon-γ，IFN-γ)含量存在顯著差異[44]。研究還發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期被金葡菌感染乳區(qū)的牛奶細(xì)胞中的IL-1β基因表達(dá)上調(diào)[45]，IL-8基因的表達(dá)則明顯減少甚至不表達(dá)[46-47]。因此編碼這些細(xì)胞因子的基因可作為奶?？菇鹌暇榉垦椎暮蜻x基因。作者前期在中國(guó)荷斯坦牛乳房炎抗性性狀的全基因組關(guān)聯(lián)分析(genome-wide association study，GWAS)中發(fā)現(xiàn)，14號(hào)染色體上與體細(xì)胞評(píng)分(somatic cell score，SCS)育種值顯著關(guān)聯(lián)的SNP(P=1.24×10-10)位于TRAPPC9基因中，該基因AA基因型的SCS育種值極顯著高于GG基因型(P<0.001)[48]。董易春在另一個(gè)奶牛群體中(n=314)發(fā)現(xiàn)相似結(jié)果[49]，并初步進(jìn)行了功能驗(yàn)證，該基因與金葡菌乳房炎抗性的關(guān)系還需進(jìn)一步深入研究[44]。

圖2 中國(guó)部分地區(qū)荷斯坦牛乳源金葡菌的PFGE分型結(jié)果Fig.2 PFGE patterns of S.aureus strains isolated from milk samples of Chinese Holstein in different regions of China

6 結(jié) 論

奶牛金葡菌感染引起的乳房炎具有不易發(fā)現(xiàn)，耐藥性強(qiáng)，治愈率低，復(fù)發(fā)率高等特點(diǎn)，尤其以金葡菌隱性乳房炎最為棘手。我國(guó)北方地區(qū)生產(chǎn)群泌乳牛及臨床乳房炎牛奶樣的平均金葡菌感染率為11.7%，不同牛場(chǎng)間的金葡菌流行類型不同。鑒于12.8%的生產(chǎn)群泌乳牛也檢測(cè)到金葡菌，因此應(yīng)基于SCC測(cè)定日記錄初步判定隱性乳房炎奶牛[50]，再依據(jù)相鄰兩月SCC差值變化[21-23]進(jìn)一步判斷金葡菌感染的隱性乳房炎牛，然后通過(guò)金葡菌培養(yǎng)及鑒定，及早判斷被金葡菌感染的低SCC隱性乳房炎牛。研制新型生物制劑以及通過(guò)分子抗病育種手段鑒定和利用抗金葡菌乳房炎的主效基因是今后提高奶牛乳房健康性狀的重要措施[51]。

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(編輯 白永平)

Infectious Status of Mastitis in Dairy Cattle Induced byStaphylococcusaureusand Its Advances on Epidemiological Patterns and Antimicrobial Resistance in Northern China

WANG Xiao，YU Ying*

(KeyLaboratoryofAnimalGenetics，BreedingandReproduction，MinistryofAgriculture&NationalEngineeringLaboratoryforAnimalBreeding，CollegeofAnimalScienceandTechnology，ChinaAgriculturalUniversity，Beijing100193，China)

Bovine mastitis，especially subclinical mastitis that induced byStaphylococcusaureus(S.aureus)，is the most common disease，which is very difficult to prevent and control in dairy industries.In recent five years，our research group has collected 1 112 milk samples from nine dairy farms in Northern China，which included lactating cows with high and low somatic cell counts(SCC) as well as clinical mastitis cows within eleven sampling batches.A total of 191 strains ofS.aureuswere isolated and identified in the detected Northern dairy cattle and the average infectious ratio of mastitis infected byS.aureuswas 11.7%(the lactating cattle was 12.4% and the clinical mastitis cattle was 10.8%).Antimicrobial susceptibility test and toxic genes detection revealed that Chloramphenicol，Amikacin and Cefoperazone had strong inhibitory effects onS.aureusmastitis， the highest detection rate of the toxic genes was panton-valentine leukocidin gene(70.2%).Pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) analysis revealed the epidemical patterns ofS.aureusin mastitis cattle in Northern and Eastern China.Combined with the related studies from domestic and foreign countries，the review systematically compared and analyzed the infectious ratio，the antibiotic resistance，the main toxic genes，the epidemical patterns ofS.aureusmastitis.The strategies to prevent and control the incidence ofS.aureusmastitis in dairy cattle were also discussed.

mastitis of dairy cattle；Staphylococcusaureus；antimicrobial resistance；epidemiological pattern

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.09.001

2015-01-09

國(guó)家自然科學(xué)基金(31272420)；農(nóng)業(yè)部奶業(yè)體系項(xiàng)目(CARS-37-04B)；十二五國(guó)家科技支持項(xiàng)目(2011BAD28B02)；“863”重大項(xiàng)目(2008AA101002)；教育部基本科研項(xiàng)目(2011JS006；Z109021306)；長(zhǎng)江學(xué)者與創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃(IRT1191)

王 曉(1988-)，男，山東即墨人，碩士生，主要從事動(dòng)物分子數(shù)量遺傳學(xué)研究，E-mail：wangxiao880923@gmail.com

*通信作者：俞 英(1972-)，女，云南陸良人，副教授，博導(dǎo)，主要從事動(dòng)物分子抗病育種及表觀遺傳調(diào)控研究，E-mail：yuying@cau.edu.cn

S857.26；S852.611

A

0366-6964(2015)09-1477-12