李英杰，劉錚鑄*，鞏元芳*，徐桂利，張 磊，唐家明， 段玲欣，劉謝榮，郭秀玲，陸奇玉

(1.河北科技師范學(xué)院動物科技學(xué)院，秦皇島 066004；2.河北昌黎縣畜牧發(fā)展局，昌黎 066600)

狐貍Agouti基因SNPs篩查及其與毛色關(guān)聯(lián)性分析

李英杰1，劉錚鑄1*，鞏元芳1*，徐桂利1，張 磊1，唐家明1， 段玲欣1，劉謝榮1，郭秀玲2，陸奇玉2

(1.河北科技師范學(xué)院動物科技學(xué)院，秦皇島 066004；2.河北昌黎縣畜牧發(fā)展局，昌黎 066600)

旨在探究狐貍刺豚鼠基因(Agouti)多態(tài)性及其與狐貍被毛顏色之間的關(guān)系。本研究采用PCR和直接測序的方法對中國5個狐種58只狐貍的Agouti基因部分序列進(jìn)行了SNPs篩查和單倍型分析。結(jié)果表明，在已測序的58只狐貍中首次發(fā)現(xiàn)6個SNPs(g.269G>T、g.295C>T、g.325T>G、g.518G>A、g.608C>A和g.846G>A)，它們?nèi)看嬖谟趦?nèi)含子2上。狐屬的所有個體(25只)在6個位點(diǎn)全部為純合子基因型，依次為GG、CC、TT、GG、CC和GG型，而北極狐屬的所有個體(33只)在這6個位點(diǎn)則均為另一種純合子基因型，依次為TT、TT、GG、AA、AA和AA型。6個SNPs形成兩種單倍型：單倍型Ⅰ(H1：GCTGCG)和單倍型Ⅱ(H2：TTGAAA)，分布頻率分別為42.1%和57.9%。單倍型Ⅰ(H1)分布于狐屬3個狐種的所有受試個體中，單倍型Ⅱ(H2)分布于北極狐屬兩個狐種的所有受試個體中。進(jìn)一步分析沒有發(fā)現(xiàn)6個SNPs及其單倍型與狐貍毛色的明顯關(guān)聯(lián)性，但推測它們是區(qū)分狐屬和北極狐屬的重要功能位點(diǎn)和重要單倍型。

狐貍；Agouti基因；SNPs；單倍型；毛色

狐貍在動物分類學(xué)上屬于哺乳綱、食肉目、犬科動物。世界上人工飼養(yǎng)的狐貍主要有赤狐、銀黑狐和北極狐3個種，它們分屬兩個不同的屬：即狐屬(Vulpesvulpe)和北極狐屬(Alopexlagopus)[1]。狐屬中的赤狐為原始種，后突變出銀黑狐，赤狐和銀黑狐又突變出更多毛色各異的其他色型狐，統(tǒng)稱狐屬彩狐。北極狐屬中的藍(lán)狐為原始種，后突變出白色北極狐和其它色型的北極狐，統(tǒng)稱北極狐屬彩狐[2]。

Agouti基因是調(diào)控動物毛色的重要功能基因之一。該基因通常編碼Agouti信號蛋白(ASIP)，和促黑色素細(xì)胞素(MSH)競爭黑素皮質(zhì)素受體(MC1R)，黑色素細(xì)胞刺激素受體功能丟失時，黑素皮質(zhì)素受體則與Agouti信號蛋白結(jié)合，促使偽黑色素的形成，使皮毛表現(xiàn)為黃色或紅色。不同物種的Agouti基因及Agouti信號蛋白有較高的同源性，大部分動物的Agouti基因含有4個外顯子，其編碼的Agouti信號蛋白由131～133個氨基酸組成。近年來，有關(guān)人、鼠Agouti基因的研究較多[3-6]，另外，國內(nèi)外眾多學(xué)者對牛[7]、馬[8]、豬[9]、山羊[10-12]和家犬[13]的Agouti基因也做了大量研究，并已證實(shí)Agouti基因與毛色相關(guān)，但是目前對狐貍Agouti基因的相關(guān)研究相對比較薄弱。本研究以兩個狐屬(狐屬、北極狐屬)中的5個狐種共計58只狐貍為研究對象，采用PCR和直接測序的方法對這58只不同毛色狐貍Agouti基因的部分序列(包括完整外顯子2、完整內(nèi)含子2和部分外顯子3)進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性(SNPs)檢測，并進(jìn)一步對其形成的單倍型進(jìn)行分析，為將來探索狐貍毛色形成的深層次研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用58只成年狐貍來自河北省秦皇島市昌黎縣金島“狐、貉、貂育種場”，其中赤狐16只、銀黑狐2只、白銀狐7只、北極藍(lán)狐19只和北極白狐14只。所用樣品為狐貍的皮膚組織，皮膚組織取好后迅速投入液氮中，隨后保存于-20 ℃冰箱中，備用。

1.2 基因組DNA提取

基因組DNA的提取采用傳統(tǒng)的酚-氯仿抽提法[14]，TE溶解，-20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物設(shè)計和PCR擴(kuò)增

根據(jù)GenBank 數(shù)據(jù)庫中收錄的家犬Agouti基因序列(序列號：NC_006606)設(shè)計擴(kuò)增產(chǎn)物為1 497 bp的1對引物，上游：5′-GCCTGACTGCCTTT-TCTGTT-3′，下游：5′-TCTTCTTTTCCGCCTC-TTTTCT-3′，引物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體積為50 μL，其中2.5 mmol·L-1dNTPs 4 μL，10×Buffer(含Mg2+)5 μL，濃度為10 mmol·L-1的上、下游引物各1 μL，TaqDNA聚合酶(5 U·μL-1)0.5 μL，DNA模板1.5 μL(75 ng·μL-1)，加滅菌三蒸水至50 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性45 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min，34 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。每次反應(yīng)設(shè)不含模板的空白對照，擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，在自動成像儀上檢測圖像。

1.4 PCR產(chǎn)物回收、測序

將擴(kuò)增產(chǎn)物(濃度約100 ng)回收純化后，送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測序。

1.5 序列分析

將測序所得序列用BioEdit(7.0.1.1)和DNAMAN(5.2.2.0)軟件進(jìn)行比對及相似性分析，并用SHEsis軟件[15]對突變位點(diǎn)進(jìn)行單倍型分析。

2 結(jié) 果

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

對受試狐貍Agouti基因外顯子2 、內(nèi)含子2和部分外顯子3的目標(biāo)片段經(jīng)PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳檢測后，得到與目標(biāo)片段(1 497 bp)基本吻合的特異性條帶(圖1)。

2.2 狐貍Agouti基因單核苷酸多態(tài)檢測

58只狐貍Agouti基因PCR產(chǎn)物送上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司測序后，所得序列用BioEdit(Version 7.0.1.1)和DNAMAN(5.2.2.0)軟件仔細(xì)比對后，外顯子2和外顯子3區(qū)域沒有發(fā)現(xiàn)任何突變位點(diǎn)，說明狐貍Agouti基因的外顯子區(qū)域是非常保守的，但在內(nèi)含子2區(qū)域的269、295、325、518、608和846 bp處分別發(fā)現(xiàn)1個突變位點(diǎn)(SNPs)，即g.269G>T、g.295C>T、g.325T>G、g.518G>A、g.608C>A和g.846G>A(圖2)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)狐屬中的赤狐、銀黑狐和白銀狐3個狐種的所有個體(25只)在以上6個位點(diǎn)處全部為純合子基因型，依次為GG、CC、TT、GG、CC和GG型，而北極狐屬中的北極藍(lán)狐和北極白狐兩個狐種的所有個體(33只)在這些位點(diǎn)處則均為另一種純合子基因型，依次為TT、TT、GG、AA、AA和AA型。

1～10.PCR產(chǎn)物；M.DNA marker DL 20001-10.PCR products；M.DNA marker DL 2000圖1 狐貍Agouti基因部分序列電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoretogram of fox Agouti PCR products(1 497 bp)

2.3 狐貍Agouti基因單倍型分析

利用SHEsis(http：//analysis.bio-x.cn/myAnalysis.php)在線軟件對狐貍Agouti基因內(nèi)含子2的6個SNPs進(jìn)行了單倍型構(gòu)建，共獲得兩種單倍型：H1和H2，其分布頻率分別為42.1%和57.9%(表1)。如果位點(diǎn)間無連鎖，理論上6個突變位點(diǎn)應(yīng)產(chǎn)生64(26)種單倍型，而在本研究利用軟件僅檢測到兩種單倍型，說明這些位點(diǎn)間可能處于緊密連鎖不平衡狀態(tài)。

圖2 狐貍Agouti基因內(nèi)含子2的6個突變位點(diǎn)Fig.2 Six mutation sites of the fox Agouti gene intron 2

表1 狐貍Agouti基因內(nèi)含子2 的單倍型及其頻率

Table 1 Haplotype frequencies ofAgoutigene intron 2 covering the 6 polymorphic sites in foxes

單倍型種類Haplotypes單倍型序列Sequences單倍型頻率/%FrequenciesH1GCTGCG42．1H2TTGAAA57．9

2.4 各基因型和單倍型在狐貍種間和種內(nèi)的分布

各單倍型和基因型在受試狐貍種間和種內(nèi)的分布見表2。表2 表明，狐屬中的3個狐種：赤狐、銀黑狐和白銀狐的所有個體均為純合子1，且均為單倍型Ⅰ(H1)，北極狐屬中的北極藍(lán)狐和北極白狐的所有個體均為純合子2，且均為單倍型Ⅱ(H2)?；蛐秃蛦伪缎团c毛色均沒有明顯的關(guān)聯(lián)性。

表2 基因型和單倍型在受試狐貍?cè)后w間的分布

Table 2 The distribution of genotypes and haplotypes in 5 fox populations

狐貍Fox單倍型Haplotypes基因型GenotypesH1H2純合子1Homozygous1純合子2Homozygous2雜合子Heterozygotes狐屬Vulpesvulpes赤狐(紅色)Redfox1601600銀黑狐(黑色，摻雜白色針毛)Silverfox20200白銀狐(白色)Whitesilverfox70700北極狐屬Alopexlagopus北極藍(lán)狐(淺藍(lán)色)Arcticbluefox0190190北極白狐(白色)Arcticwhitefox0140140

3 討 論

本研究利用PCR擴(kuò)增和直接測序的方法對兩個狐屬5個狐種58只狐貍Agouti基因外顯子2、內(nèi)含子2和部分外顯子3序列進(jìn)行了單核苷酸多態(tài)性檢測，在外顯子2和外顯子3區(qū)域均沒有發(fā)現(xiàn)SNPs，而在內(nèi)含子2區(qū)域則發(fā)現(xiàn)6個SNPs，這6個SNPs是本研究首次從狐貍Agouti基因上發(fā)現(xiàn)的。利用在線軟件6個SNPs構(gòu)建了兩種單倍型，發(fā)現(xiàn)狐屬3個狐種(赤狐、銀黑狐和白銀狐)25個個體均屬于單倍型Ⅰ(H1)，均為純合子基因型，北極狐屬2個狐種(北極藍(lán)狐和北極白狐)33個個體均屬于單倍型Ⅱ(H2)，均為另一種純合子基因型。推測這6個SNPs和構(gòu)建的兩種單倍型均是區(qū)分狐屬和北極狐屬的主要功能位點(diǎn)和主要單倍型。本研究所用狐屬中的赤狐被毛顏色呈火紅、紅棕或灰紅，四肢及耳背呈黑褐；銀黑狐基本毛色是黑色，全身被毛均勻，摻雜白色針毛；白銀狐全身被毛白色，耳背有黑斑，鼻頭呈黑色。北極狐屬中的北極藍(lán)狐全身呈淺藍(lán)色，夏季顏色較深，冬季顏色變淺，而北極白狐則全身被毛呈白色。本研究篩查到的6個SNPs和兩種單倍型與狐貍的毛色并沒有明顯的關(guān)聯(lián)性，推測狐貍的毛色可能是由多個基因共同調(diào)控的。本研究篩查到的6個SNPs均位于狐貍Agouti基因的內(nèi)含子2上，而內(nèi)含子是真核基因的非編碼區(qū)，可被轉(zhuǎn)錄，在mRNA加工過程中被剪切掉，故在進(jìn)化過程中是喪失功能的基因部分。但內(nèi)含子的剪接增加了mRNA在核內(nèi)的穩(wěn)定性，導(dǎo)致在細(xì)胞質(zhì)中積累更多成熟的mRNA[16]。有研究表明，內(nèi)含子可能與基因的表達(dá)調(diào)控有關(guān)，內(nèi)含子對某些基因的特異性表達(dá)是必不可少的，如：豬MyHC(Myosin heavy chain)基因內(nèi)含子中含有一個重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，可以通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄的起始來增強(qiáng)基因的表達(dá)[17]。推測狐貍Agouti基因內(nèi)含子2可能也存在某些調(diào)控元件，但是該基因的內(nèi)含子序列是否是該基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄所必需的，以及本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的突變是否會引起Agouti基因表達(dá)的變化，還需進(jìn)一步深入研究證實(shí)。

4 結(jié) 論

本研究采用PCR和直接測序法首次在狐貍Agouti基因內(nèi)含子2發(fā)現(xiàn)6個SNPs(g.269G>T、g.295C>T、g.325T>G、g.518G>A、g.608C>A和g.846G>A)。狐屬中的所有個體在6個位點(diǎn)依次為GG、CC、TT、GG、CC和GG基因型，北極狐屬中的所有個體在6個位點(diǎn)則依次為TT、TT、GG、AA、AA和AA基因型。6個SNPs形成Ⅰ(H1：GCTGCG)和Ⅱ(H2：TTGAAA)兩種單倍型，其中單倍型Ⅰ(H1)分布于狐屬3個狐種的所有受試個體中，單倍型Ⅱ(H2)分布于北極狐屬2個狐種的所有受試個體中，但沒有發(fā)現(xiàn)6個SNPs及其單倍型與毛色的明顯關(guān)聯(lián)性，推測它們是區(qū)分狐屬和北極狐屬的重要功能位點(diǎn)和重要單倍型。本研究為將來探索狐貍毛色形成的深層次研究奠定了較好的理論基礎(chǔ)。

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(編輯 程金華)

SNPs Detection ofAgoutiGene and Its Associations with Coat Color in Fox

LI Ying-jie1，LIU Zheng-zhu1*，GONG Yuan-fang1*，XU Gui-li1，ZHANG Lei1， TANG Jia-ming1，DUAN Ling-xin1，LIU Xie-rong1，GUO Xiu-ling2，LU Qi-yu2

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology，HebeiNormalUniversityofScience&Technology，Qinhuangdao066004，China;2.AnimalHusbandryDevelopmentBureauofChangliCountyofHebeiProvince，Changli066600，China)

In present study，to investigate the relationship between polymorphism ofAgoutigene and coat color in fox，the whole exon 2，whole intron 2 and partial exon 3 sequence of theAgoutigene were sequenced from 58 fox samples，belonging to 5 species of 2 genera.A total of 6 SNPs(g.269G>T，g.295C>T，g.325T>G，g.518G>A，g.608C>A and g.846G>A) in intron 2 were detected firstly，revealing high genetic diversity.All individuals(n=25) ofVulpesvulpewere homozygous at the 6 sites，and the genotype were in order of GG，CC，TT，GG，CC and GG.All individuals(n=33)Alopexlagopuswere another homozygous at the 6 sites，and the genotype were in order of TT，TT，GG，AA，AA and AA.Total 2 haplotypes(H1：GCTGCG and H2：TTGAAA) were found at the 6 mutation sites and their frequencies were 42.1% and 57.9%，respectively.H1 was widely distributed in all tested individuals ofVulpesvulpes，but H2 was widely distributed in all tested individuals ofAlopexlagopus.Further analysis showed that the detected SNPs and haplotypes were not significant relation to coat color，but speculated that they may be the important functional sites and haplotypes to distinguishVulpesvulpeandAlopexlagopus.

fox；Agoutigene；SNPs；haplotype；coat color

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.09.028

2015-01-23

國家自然科學(xué)基金(31040048；31272412)；河北省高等學(xué)校創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)領(lǐng)軍人才培育計劃(LJRC004)；河北省自然科學(xué)基金(C2013407101)

李英杰(1983-)，男，河南周口人，碩士生，主要從事動物遺傳育種研究，E-mail：15810454825@126.com

*通信作者：鞏元芳，教授，E-mail：gongyuanfang_2004@163.com；劉錚鑄，教授，E-mail：liuzhengzhu@163.com

S813.3

A

0366-6964(2015)09-1692-05