王鼎 徐曉玲 朱冠霞 程國平 毛偉敏

根據(jù)2015年版WHO肺癌分類標(biāo)準(zhǔn)，肺浸潤(rùn)性黏液腺癌（invasive mucinous adenocarcinoma，IMA）是腺癌的一種少見亞型[1]，僅占所有肺腺癌的1.5%～10%[2-4]。IMA具有獨(dú)特的遺傳和生存特征，與非黏液腺癌（nonmucinous adenocarcinoma，NMA）相比，IMA 預(yù)后更差，且缺乏有效的治療手段[4-5]。此外，IMA的基因突變譜以及免疫檢查點(diǎn)狀態(tài)也與NMA有所不同[6-7]。而表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）和間變性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase，ALK）是肺腺癌中重要的治療靶點(diǎn)[8]，針對(duì)IMA這個(gè)特殊的肺腺癌亞型，本研究旨在探討EGFR基因突變和ALK重排在IMA中的表達(dá)及與臨床病理特征的關(guān)系。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 選取2010年1月至2015年12月中國科學(xué)院大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院收治的IMA患者101例。其中穿刺樣本13例，手術(shù)樣本88例；男49例（48.5%），女52例（51.5%）；年齡 29～79（57.86±9.1）歲，≥58歲 53例（52.5%），＜58歲 48例（47.5%）；有吸煙史 40例（39.6%），無吸煙史61例（60.4%）；黏液腺癌類型：純黏液腺癌 61例（60.4%），混合癌40例（39.6%）；T分期：Tx 8例（7.9%），T127例（26.7%），T257例（56.4%），T35例（5.0%），T44例（4.0%）；N 分期：Nx 9例（8.9%），N059例（58.4%），N17例（6.9%），N223例（22.8%），N33例（3.0%）；M分期：有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移13例（12.9%），無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移88例（87.1%）；有脈管瘤栓11例（12.9%），無脈管癌栓90例（85.1%）；有神經(jīng)浸潤(rùn)7例（6.9%），無神經(jīng)浸潤(rùn)94例（93.1%）。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）穿刺樣本及手術(shù)樣本的病理診斷結(jié)果均為IMA，且患者病歷資料完整；（2）若為手術(shù)樣本，則術(shù)前未行放化療、生物治療或免疫治療等抗腫瘤治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）5年內(nèi)同時(shí)患有其他類型的惡性腫瘤患者；（2）其他瘤種轉(zhuǎn)移而來的患者；（3）術(shù)前行新輔助化療的患者。收集所有患者手術(shù)切除的肺癌組織標(biāo)本或穿刺活檢標(biāo)本，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋。101例患者中共 67例行EGFR和（或）ALK檢測(cè)，其中EGFR/ALK均行檢測(cè)32例，僅行EGFR檢測(cè)20例，僅行ALK檢測(cè)15例；未參與檢測(cè)34例。

1.2 方法

1.2.1 EGFR基因突變檢測(cè) 應(yīng)用突變擴(kuò)增系統(tǒng)PCR法。根據(jù)FFPE DNA提取試劑盒（廈門艾德生物醫(yī)藥科技股份有限公司）說明書分離和純化腫瘤組織中的DNA。隨后使用人類EGFR基因突變檢測(cè)試劑盒（廈門艾德生物醫(yī)藥科技股份有限公司）鑒定EGFR基因突變，檢測(cè)位點(diǎn)為EGFR基因中的18-21外顯子。PCR如下進(jìn)行：95℃ 5 min進(jìn)行初始溫育，47個(gè)循環(huán)，95℃持續(xù)25 s，93℃持續(xù)25 s。嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行結(jié)果判定，如果擴(kuò)增循環(huán)數(shù)（cycle threshold，Ct）值為 0 或 Ct值＞30，則實(shí)驗(yàn)結(jié)果判為野生型，反之則為突變型。

1.2.2 ALK重排陽性的檢測(cè)和評(píng)估 應(yīng)用VENTANA ALK免疫組化法。石蠟樣本4 μm厚連續(xù)切片，烤箱烘干。ALK表達(dá)的免疫組化染色在Benchmark XT自動(dòng)染色系統(tǒng)（美國羅氏公司）中進(jìn)行。兔ALK單克隆抗體（D5F3）（美國文塔納醫(yī)療系統(tǒng)公司）孵育15 min，使用具有信號(hào)放大的Optiview DAB免疫組化檢測(cè)試劑盒（瑞士羅氏公司）進(jìn)行檢測(cè)。由兩位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理學(xué)醫(yī)生進(jìn)行獨(dú)立判讀，細(xì)胞質(zhì)中具有顆粒狀結(jié)構(gòu)的強(qiáng)烈棕色染色判讀為ALK陽性，而微弱的細(xì)胞質(zhì)染色判讀為陰性。若兩者判讀結(jié)果不一致時(shí)則兩位病理醫(yī)師進(jìn)行共同閱片，商議后做出一致決定。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料組間比較采用x2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

52例行EGFR檢測(cè)的IMA患者中，EGFR突變陽性率為23.1%（12/52）；47例行ALK檢測(cè)的IMA患者中，ALK重排陽性率為27.7%（13/47）；32例EGFR/ALK均行檢測(cè)的IMA患者中，僅1例（3.1%）EGFR/ALK檢測(cè)同時(shí)陽性。EGFR基因突變僅與性別有關(guān)，在女性患者中表達(dá)率更高（P＜0.05），而與年齡、吸煙史、黏液腺癌類型、T分期、N分期、M分期、脈管瘤栓和神經(jīng)浸潤(rùn)均無關(guān)（均P＞0.05）。ALK重排陽性僅與T分期有關(guān)，T分期越高越傾向于發(fā)生ALK重排（P＜0.05），而與性別、年齡、吸煙史、黏液腺癌類型、N分期、M分期、脈管瘤栓和神經(jīng)浸潤(rùn)均無關(guān)（均P＞0.05），見表1。

表1 EGFR突變和ALK重排與IMA患者的臨床病理特征的關(guān)系（例）

3 討論

由于IMA是肺腺癌中的少見類型，目前，全球針對(duì)IMA的研究尚少。IMA的分子表達(dá)譜與其他類型的肺腺癌不盡相同，最近的高通量分析揭示了IMA中的幾種基因異常，包括鼠類肉瘤病毒癌基因（KRAS）、B-Raf原癌基因絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（BRAF）、ERBB2和磷脂酰肌醇-3-激酶α亞單位（PI3KCA）突變以及神經(jīng)調(diào)節(jié)素 1（NRG1）、NTRK1、ALK、RET 和 ERBB4 重排[9-10]。EGFR突變?cè)贗MA中相對(duì)少見，僅0%～5%[9-10]。以往研究顯示，靶向治療EGFR突變或ALK重排的肺腺癌具有不錯(cuò)的療效，但針對(duì)IMA的療效數(shù)據(jù)仍有限[11]。此外，IMA很少出現(xiàn)p53突變，與NMA相比腫瘤負(fù)荷更低[10]。IMA主要發(fā)生在非重度吸煙者中，很少表達(dá)程序性死亡配體-1（PD-L1）[12-14]。但這些研究樣本量都太小，需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

本研究結(jié)果顯示，IMA患者中吸煙比例為39.6%（40/101），而Duruisseaux等[15]報(bào)道的25例IMA患者中吸煙比例達(dá) 60%（15/25），Yoshizawa等[16]報(bào)道的 13 例IMA患者中吸煙比例達(dá)76.9%（10/13），因此吸煙與IMA之間的相關(guān)性仍需更大樣本量的研究。本研究中，IMA患者的EGFR突變更常見于女性，這與Wang等[17]對(duì)于肺腺癌的研究相一致。此外，ALK重排更常見于T分期更高的患者。因此對(duì)于T分期偏高的IMA患者，更應(yīng)進(jìn)行ALK檢測(cè)，以免錯(cuò)過黃金位點(diǎn)的治療機(jī)會(huì)。在所有進(jìn)行檢測(cè)患者中，僅有1例EGFR和ALK檢測(cè)同時(shí)呈陽性的患者，這在Wang等[17]的研究里同樣罕見。

本研究為國內(nèi)少有的大樣本IMA相關(guān)的回顧性研究，為臨床醫(yī)師對(duì)IMA這種少見類型提供了理論參考。研究結(jié)果期待更大的樣本量、更多中心的研究來進(jìn)一步驗(yàn)證。