韋張其 王潔慧 劉國慶

摘要 [目的]提高生物質(zhì)秸稈降解速度，能夠更加充分地利用微生物資源。[方法]以黑翅土白蟻菌圃為菌源，采用平板稀釋法初篩分離得到降解纖維素的目標(biāo)菌株，再復(fù)篩得到最優(yōu)菌株FUN-ce4，然后對其進(jìn)行ITS序列分析鑒定以及酶穩(wěn)定性研究。[結(jié)果]菌株FUN-4歸屬于栓孔菌屬（Trametes）。經(jīng)對酶活性研究，菌株FUN-4在溫度為60 ℃、pH為4、發(fā)酵時(shí)間為6 d時(shí)酶活相對較高;而溫度為40 ℃、最適pH為5時(shí)酶活相對較穩(wěn)定。[結(jié)論]白蟻菌圃中存在活性較高的纖維素降解菌株，可以成為高活性木質(zhì)纖維素降解酶的重要來源。

關(guān)鍵詞 白蟻菌圃;纖維素酶;分離;鑒定;酶活

Abstract [Objective]To improve the degradation rate of biomass straw and make full use of microbial resources.[Method]The target strains degrading cellulose from termite combsare was isolated by plate dilution method，and then the optimal strain FN-4 was rescreened from the target strains，and ITS sequence analysis was conducted combining with the research of the enzymatic activity.[Result]The strain FN-4 was identified as Trametes.The enzymatic activity research experiment showed that the enzymatic activity of strain FUN-4 was relatively high when the temperature was 60 ℃，the pH was 4，and the fermentation time was 6 days.When the temperature was 40 ℃ and the pH was 5，the enzyme activity was relatively stable.[Conclusion]There are high activity cellulose degrading strains in termites fungus gardens，which can be an important source of high activity lignocellulosic degrading enzymes.

Key words Termite combsare;Cellulase;Screening;Identification;Enzymatic activity

白蟻生物系統(tǒng)顯示了高效生物轉(zhuǎn)化木質(zhì)纖維素的能力[1]。白蟻之所以能食木是因?yàn)樗芸科潴w內(nèi)的微生物群將木材中纖維素和半纖維素消化成能夠被機(jī)體吸收的物質(zhì)[2]。在白蟻的蟻巢中存在“菌圃”這一特殊的結(jié)構(gòu)，其主要組成成分是未被完全消化的植物，白蟻和菌圃真菌之間較好的協(xié)同作用能夠高效利用木質(zhì)纖維素[3]。

目前，關(guān)于白蟻共生微生物降解木質(zhì)纖維素研究主要集中在白蟻腸道菌功能，并分離出其中的產(chǎn)酶基因進(jìn)行基因組分析[4-8]，而關(guān)于菌圃真菌降解纖維素的研究較少。該研究以黑翅土白蟻菌圃為研究對象，篩選出高產(chǎn)纖維素酶真菌并研究其纖維素酶活性及穩(wěn)定性，從而發(fā)掘具有應(yīng)用價(jià)值的纖維素降解真菌。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株。黑翅土白蟻及其菌圃，購于江西省白蟻活體實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 培養(yǎng)基。

①羧甲基纖維素-剛果紅培養(yǎng)基：CMC-Na 2.0 g，（NH4）2SO4 2.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，K2HPO4 1.0 g，NaCl 0.5 g，剛果紅 0.4 g，瓊脂 20.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH自然。②PDA培養(yǎng)基：200 g馬鈴薯，葡萄糖2 g，瓊脂2 g。③發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基：秸稈粉 5.0 g，蛋白胨 2.0 g，KH2PO4 2.0 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.4 g，NaCl 0.5 g，蒸餾水1 000 mL，pH自然。各培養(yǎng)基按配方配制后，加熱攪勻，分裝至錐形瓶中，加塞、包扎，121 ℃滅菌20 min左右后取出錐形瓶搖勻，冷卻后貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 主要試劑及設(shè)備。

試劑：剛果紅染色液、氯化鈉脫色液、檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液、DNS試劑等。

主要設(shè)備：分析天平、高速離心機(jī)、立式壓力蒸汽滅菌鍋、紫外可見光分光光度計(jì)、電熱恒溫培養(yǎng)箱等。

1.2 方法

1.2.1 菌圃中降解纖維素的菌株篩選。

取0.5 g菌圃碾碎，放入50 mL無菌離心管中，加入適量無菌水，于8 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心15 min。取 1 mL 靜置后的上清液分別稀釋至10-1、10-2、10-3、10-4和10-5倍，涂抹至羧甲基纖維素-剛果紅培養(yǎng)基平板上，30 ℃培養(yǎng)7 d。選取生長良好且透明水解圈較大的菌株接種于PDA培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)5 d，至在每個(gè)平板上都可看到單一形態(tài)的菌落。選取單菌落打孔接種于羧甲基纖維素培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)3 d后，量取1 mg/mL的剛果紅染液15 mL染色15 min，用1 mol/L NaCl溶液脫色后，根據(jù)透明圈的大小，選出酶活最大的菌株（暫命名為FUN-4）進(jìn)行分子鑒定和酶活性分析。

1.2.2 菌圃中降解纖維素的菌株鑒定。

1.2.2.1 形體觀察。

將純化菌株用黏片法，粘取菌絲于載玻片上，用顯微鏡和電鏡觀察其形態(tài)特征，鑒定參照文獻(xiàn)[9-10]提供的方法進(jìn)行。

1.2.2.2 ITS序列分析鑒定[11]。FUN-ce4菌株基因組DNA采用E.Z.N.A.Stool DNA Kit試劑盒提取。

PCR反應(yīng)體系：PhusionHot Start Flex 2× Master Mixart Version 12.5 μL、Forward Primer（1 μmol/L）2.5 μL、Reverse Primer（1 μmol/L）2.5 μL、模板DNA 50 μL、加ddH2O 25 μL。

PCR反應(yīng)程序：預(yù)變性98 ℃ 30 s;變性98 ℃10 s，退火54 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 45 s，35個(gè)循環(huán);最后延伸72 ℃ 10 min;保持4 ℃。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，并對目標(biāo)片段進(jìn)行回收，回收采用AMPure XT beads回收試劑盒。將PCR產(chǎn)物送至杭州聯(lián)川生物測序。將測序結(jié)果提交GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast，從GenBank數(shù)據(jù)庫中搜索相關(guān)菌株的ITS相應(yīng)序列，采用MEGA 5.0鄰接法建進(jìn)化樹，進(jìn)行分離菌株菌種的鑒定。

1.2.3 菌株纖維素酶活研究。

1.2.3.1 粗酶液的制備。

將FUN-4菌株接種于液體PDA培養(yǎng)基中，30 ℃搖床180 r/min培養(yǎng)3 d。按10%接種量接入裝有100 mL發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，30 ℃搖床180 r/min培養(yǎng)。分別在2、3、4、5、6、7 d取粗酶液測定纖維素酶活。纖維素酶是一組酶的總稱，是一種復(fù)合酶，主要由外切β-葡聚糖酶、內(nèi)切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶等組成[12-13]，因此纖維素酶活分別由微晶纖維素酶活、羧甲基纖維素酶活和濾紙條酶活反映。

1.2.3.2 纖維素酶活的測定。

（1）羧甲基纖維素酶活力[14]。取100 μL 粗酶液加入1% CMC溶液（溶于pH為4.5的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液），50 ℃條件下反應(yīng)30 min（以100 ℃條件下反應(yīng)30 min的酶液作為滅活對照組），然后加入1 mL DNS試劑充分搖勻并沸水煮5 min，冷水冷卻后在OD540下測定吸光度。

（2）濾紙酶活力[15]。取500 μL粗酶液加入1 500 μL緩沖液和1 cm×6 cm的濾紙（需卷成），在恒溫水浴鍋中預(yù)熱5 min，50 ℃條件下反應(yīng)60 min（以100 ℃條件下反應(yīng)60 min的酶液作為滅活對照組），然后加入2 mL DNS試劑充分搖勻并沸水煮5 min，冷水冷卻后在OD540下測定吸光度。

（3）微晶纖維素酶（Avicel）活力。取100 μL粗酶液加入400 μL緩沖液和1%微晶纖維素在恒溫水浴鍋中預(yù)熱5 min，50 ℃條件下反應(yīng)60 min（以100 ℃條件下反應(yīng)60 min的酶液作為滅活對照組），然后加入1 mL DNS試劑，充分搖勻并沸水煮5 min，冷水冷卻后在OD540下測定吸光度。

酶活力單位定義[16]：50 ℃恒溫條件下，以水解反應(yīng)中1 min 催化底物水解形成1 μmol還原糖的酶量為1個(gè)酶活單位（U）。

1.2.4 FUN-ce4菌株產(chǎn)纖維素酶穩(wěn)定性研究。

在不同pH緩沖液體系和不同溫度下測定酶活力和殘余活力，分析其對酶促反應(yīng)和酶穩(wěn)定性的影響，以達(dá)到最佳產(chǎn)酶條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌圃中降解纖維素的菌株篩選

2.1.1 純化。

從5個(gè)梯度的羧甲基纖維素-剛果紅培養(yǎng)基中選取6個(gè)生長良好且具有較大透明圈的菌株進(jìn)行純化，得到4株菌株，分別暫命名為FUN-1、FUN-2、FUN-3、FUN-4（圖1）。

觀察到這些菌落均生長較快且菌落較大，質(zhì)地疏松，呈棉絮狀和絨毛狀，不透明，顏色有純白、乳白、黃色、綠色。菌落與培養(yǎng)基連接比較緊密，不易挑取。

2.1.2 復(fù)篩。

挑取純化后的菌株單菌落接種于羧甲基纖維素培養(yǎng)基，經(jīng)剛果紅染液染色后NaCl溶液脫色，得到FUN-1、FUN-2、FUN-3、FUN-4各菌株的剛果紅水解圈（圖2）。

測量各菌株的菌落直徑和透明圈直徑，比較菌株活性（表1）。通過分離純化篩選最終得到酶活較強(qiáng)的菌種FUN-ce4，并進(jìn)行分子學(xué)鑒定和酶穩(wěn)定性分析。

2.2 菌種的分類鑒定

2.2.1 菌株形態(tài)鑒定。鏡檢圖中可以看到有比較粗壯的菌絲，許多偏透明的孢子，長長的分生孢子梗頭部有一個(gè)頂囊（圖3），菌落形態(tài)和鏡檢結(jié)果可以初步確定為霉菌。

2.2.2 ITS分子鑒定。

將擴(kuò)增后的ITS進(jìn)行凝膠電泳檢測。由圖4可知，序列2為所挑選菌株目的條帶片段。由PCR擴(kuò)增得到的目的片段長度約353 bp。在GenBank的Blast中對該序列進(jìn)行同源性比較（圖5），結(jié)果顯示FUN-4菌株ITS基因序列與毛栓菌（Trametes hirsuta）同源性為96%，初步鑒定為栓菌屬。

2.3 菌株纖維素酶活的測定及纖維素酶穩(wěn)定性研究

2.3.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制作。

該葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2=0.999 6，擬合程度較好，得到的回歸方程為y=4.815 4x-0.024 8（圖6）?？捎迷摲匠逃?jì)算對應(yīng)的葡萄糖含量，代入方程中計(jì)算酶活。

2.3.2 發(fā)酵時(shí)間對酶活力的影響。

羧甲基纖維素酶活隨著時(shí)間延長逐漸增大，但在第6天之后酶活升高不明顯（圖7），考慮到時(shí)間成本，選擇第6天為最優(yōu)發(fā)酵時(shí)間;濾紙條酶活和微晶纖維素酶活較低，兩者相差較小，且在第6天達(dá)到最大值，可能是由于羧甲基纖維素酶抑制了兩者的活性。因此，選擇第6天為發(fā)酵時(shí)長。

2.3.3 溫度和pH對酶活力的影響。羧甲基纖維素酶、濾紙條酶、微晶纖維素酶的酶活均在60 ℃時(shí)達(dá)到峰值，分別為1.020、0.094和0.246 U/mL。在30～50 ℃，濾紙條酶幾乎不顯示活性，80 ℃時(shí)微晶纖維素酶活有超過羧甲基纖維素酶活的趨勢（圖8）。羧甲基纖維素酶、濾紙條酶、微晶纖維素酶的酶活隨緩沖液pH升高均先增大后減小，在pH為4時(shí)達(dá)到最高值，分別為0.755、0.067、0.153 U/mL，但濾紙條酶活隨緩沖液pH升高變化不明顯（圖9）。

2.3.4 溫度和pH對酶活穩(wěn)定性的影響。

從圖10可見，保存在較低溫度下的酶穩(wěn)定性較好，在40 ℃時(shí)酶活最穩(wěn)定，羧甲基纖維素酶、濾紙條酶、微晶纖維素酶的酶活分別為1.123、0.117、0.373 U/mL，相對酶活力分別為93.89%、96.38%和95.64%。羧甲基纖維素酶穩(wěn)定性隨溫度升高變化最大，超過50 ℃后酶活驟降。濾紙條酶活較低，但穩(wěn)定性好。從圖11可見，羧甲基纖維素酶、濾紙條酶、微晶纖維素酶的酶活pH為5時(shí)酶活最穩(wěn)定，分別為0.660、0.060、0.148 U/mL，相對酶活力分別為87.4%、86.4%、96.7%。羧甲基纖維素酶對pH較為敏感，濾紙條酶活和微晶纖維素酶活均較低，但穩(wěn)定性好，在不同pH緩沖液下保存酶活變化較小，pH為3～7時(shí)均能保持60%以上活性。

3 小結(jié)

該研究以白蟻菌圃為菌源，相比主流研究將菌源聚集在土壤、白蟻腸道、腐爛木材等更具有創(chuàng)新性。試驗(yàn)從菌圃中提取篩選出1株高產(chǎn)纖維素酶真菌，為后續(xù)白蟻菌圃混合菌群分離純化提供參考。通過分子學(xué)初步鑒定其高產(chǎn)纖維素酶菌株為栓孔菌屬，栓孔菌屬隸屬于擔(dān)子菌門、傘菌亞門、傘菌綱、多孔菌目、多孔菌科，屬于白腐菌的一大類，擔(dān)子門白腐真菌近年來作為產(chǎn)漆酶的重要優(yōu)質(zhì)菌源而被廣泛研究[17-20]，從而為生物降解提供了重要途徑與方法。后續(xù)可對所產(chǎn)纖維素酶的酶活及穩(wěn)定性進(jìn)行初步探索，以期為其開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

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