田春花，魏景坤，馬 釗，馬 璞，金 秋，馬鴻云

(寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，寧夏銀川 750002)

近年來，子宮內(nèi)膜癌發(fā)病率隨女性肥胖率升高而上升，并出現(xiàn)年輕化趨勢[1]。研究表明14.0 %子宮內(nèi)膜癌患者為育齡女性，其中70.0 %仍有生育要求[2]。手術治療方案往往易導致患者喪失生育能力，還需要進一步探索研究[3-4]。為滿足子宮內(nèi)膜癌患者的生育愿望，左炔諾孕酮宮內(nèi)緩釋系統(tǒng)常被用作藥物治療方式，并被多個指南列為首選治療方案[5]。目前，如何確定合適劑量的左炔諾孕酮是臨床關注熱點。本研究旨在對比不同劑量的左炔諾孕酮對子宮內(nèi)膜癌細胞株的作用，從而確定抑制子宮內(nèi)膜癌細胞的最佳局部左炔諾酮的藥物劑量。

1 材料與方法

1.1材料 人類子宮內(nèi)膜癌細胞系Ishikawa(BNCC338359，北納生物)。

1.2實驗試劑 左炔諾孕酮(型號：S1727，Selleckchem)：50 mg HCY干粉中加入1.6 mL DMSO溶解，得100 mM母液，-20 ℃分裝保存，根據(jù)實驗需求劑量進行稀釋。

1.3試驗方法 CCK-8(Cell Counting Kit-8)檢測(KGA317凱基生物)：將子宮內(nèi)膜癌細胞株消化、重懸、計數(shù)同時鋪96孔板(其中細胞密度為5×103個/孔)，等待子宮內(nèi)膜癌細胞貼壁后，按照實驗設計劑量分組處理。處理24 h和48 h后，向待測孔加入10 μL CCK-8(KGA317，凱基生物)反應2 h，采用酶標儀(SAFIREII TECAN)在波長450 nm處測吸光值并計算細胞的存活率。流式細胞檢測：(1)樣品預處理。棄子宮內(nèi)膜癌細胞株上清液，每孔加1 mL PBS(KGB5001凱基生物)潤洗后滴加200 μL含EDTA胰蛋白酶消化液(T1300 Solarbio)，放入37℃培養(yǎng)箱(型號：BPN-80CM，上海一恒科學儀器有限公司)消化。(2)消化后，用含血清的完全培養(yǎng)基終止子宮內(nèi)膜細胞消化、吹散后收集子宮內(nèi)膜癌細胞懸液。將子宮內(nèi)膜癌細胞懸液在2 500 rpm離心(常州中捷實驗儀器制造有限公司，型號：TGL-16D)3 min并棄上清液。加1 mL PBS(KGB5001凱基生物)后再2 500 rpm離心3 min后棄去子宮內(nèi)膜癌細胞上清液、每管加PBS 300 μL混勻后再加入5 μL Annexin V-FITC(AP101-100-kit，MULTI SCIENCES聯(lián)科生物)和5 μL PI，輕混勻后，于室溫避光孵育10 min后上機。

2 結(jié)果

2.1子宮內(nèi)膜癌細胞株存活率 在人子宮內(nèi)膜癌細胞株中分別加入0、1、5、10、50、100 μM左炔諾酮，藥物處理后細胞培養(yǎng)如圖1所示。通過CCK-8計算在24 h、48 h細胞存活率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著左炔諾酮劑量增加，子宮內(nèi)膜癌細胞株在24 h、48 h處理后隨處理劑量增加存活率均明顯下降，實驗組與對照組組間比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，特別是100 μM組。見表1。

表1 對照組和不同劑量左炔諾酮實驗組24 h、48 h子宮內(nèi)膜細胞株存活率

2.2子宮內(nèi)膜癌細胞株凋亡率 通過流式細胞法分別計算24 h、48 h后不同劑量左炔諾酮實驗組和對照組的子宮內(nèi)膜癌細胞株凋亡率。流式細胞結(jié)果見圖2。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：隨著左炔諾酮劑量增加，子宮內(nèi)膜癌細胞株在24 h、48 h凋亡率逐漸升高，尤其是100 μM左炔諾酮組，其凋亡率分別為22.11 %、23.40 %，明顯高于其他組；24 h與48 h處理后，各劑量實驗組與對照組組間凋亡率比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2。

圖1 24 h(上)和48 h(下)不同劑量對照組和實驗組的細胞培養(yǎng)圖

表2 對照組和不同劑量左炔諾酮實驗組24 h、48 h時子宮內(nèi)膜細胞株凋亡率

圖2 24 h(上)和48 h(下)不同劑量實驗組的流式細胞結(jié)果圖

3 討論

子宮內(nèi)膜癌是最常見的婦科惡性腫瘤之一。年輕患者子宮內(nèi)膜癌確診時大多數(shù)處于 Ⅰ 期(早期)，具有癌細胞分化程度較高(G1～G2)且極少發(fā)生肌層浸潤的特點[6]。目前，臨床上對于有生育要求的子宮內(nèi)膜癌患者，為保留其生育功能，通常采用單獨應用孕激素或/和聯(lián)合宮腔鏡下局部病灶切除術[7]。孕激素中療效肯定的是LNG—IUS，因該系統(tǒng)每天能夠恒定量的釋放的左炔諾孕酮20 μg。左炔諾酮有拮抗雌激素的作用，利用左炔諾酮拮抗雌激素的作用來逆轉(zhuǎn)子宮內(nèi)膜細胞的增生或逆轉(zhuǎn)子宮內(nèi)膜癌細胞的增殖作用[8]。與所有局部用藥的特點一樣，左炔諾酮局部用藥還可以避免口服引起的全身不良反應，如體重增加、血栓風險、肝功能異常等等[2]。但是Baker和Hubbs[9-10]等研究發(fā)現(xiàn)，與口服孕激素相比，左炔諾孕酮宮內(nèi)緩釋系統(tǒng)在治療子宮內(nèi)膜癌患者中表現(xiàn)出“低效能”，這與該系統(tǒng)釋放的左炔諾孕酮劑量較小有關，因左炔諾酮的劑量較小未能達到最佳抑癌作用。那么究竟多大劑量的左炔若酮能很好地抑制子宮內(nèi)膜癌細胞的增殖？本次實驗在子宮內(nèi)膜癌細胞株中加入不同劑量(0 、1、5、10、50、100 μM)的左炔諾孕酮，分別在24 h、48 h觀察子宮內(nèi)膜癌細胞的存活率、凋亡率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在24 h、48 h時，子宮內(nèi)膜癌細胞株在10、50和100 μM組的存活率逐漸降低、凋亡率逐漸升高，其中在0 μM左炔諾酮組在24 h、48 h細胞存活率均為100.00 %，凋亡率為10.91 %和8.95 %。隨著左炔諾酮劑量的增加，存活率逐漸降低，凋亡率逐漸增加，尤其在100 μM左炔諾酮組細胞存活率在24 h、48 h分別為79.32 %、75.11 %，凋亡率22.11 %、23.40 %,差異有統(tǒng)計學差異。這表明左炔諾孕酮能夠抑制子宮內(nèi)膜癌細胞株的存活，并加速子宮內(nèi)膜癌細胞株的凋亡；當左炔諾孕酮劑量大于10 μM時，隨著劑量的增加，子宮內(nèi)膜癌細胞株的存活率明顯下降，凋亡率明顯升高。雖然對直接添加左炔諾酮至子宮內(nèi)膜癌細胞的研究較少，但已有臨床追蹤研究證明了左炔諾酮劑量對子宮內(nèi)膜癌的治療效果。田燕妮與吳海等[11-12]的研究均發(fā)現(xiàn)LNG-IUS對子宮內(nèi)膜癌治療的有效性。丁雪梅等[13]對不同學者的研究綜述表明孕酮對子宮內(nèi)膜癌的抑制作用呈濃度依賴性。D.Wildemeersch[14]研究發(fā)現(xiàn),Femilis系統(tǒng)在初始一周釋放約3倍于LNG-IUS系統(tǒng)釋放的左炔諾孕酮時，具有較好的治療效果，但還需進一步地探究。

綜上所述，左炔諾孕酮能夠降低子宮內(nèi)膜癌細胞株存活率，加速子宮內(nèi)膜癌細胞株凋亡，其效能與左炔諾孕酮劑量正相關性，為增加LNG—IUS日釋放量用于子宮內(nèi)膜癌患者保留生育功能治療提供了線索及啟示。