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        扎沖十三味丸干預(yù)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷炎性反應(yīng)相關(guān)因素探討*

        2021-04-20 07:38:40張東威劉月英白夢(mèng)蕾孫天洋
        關(guān)鍵詞:味丸主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞

        林 琳,張東威,塔 娜,劉 鑫,劉月英,白夢(mèng)蕾,孫天洋,陶 春

        (1.內(nèi)蒙古民族大學(xué)醫(yī)學(xué)院,內(nèi)蒙古通遼 028000;2.內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院;3.包頭醫(yī)學(xué)院)

        蒙成藥扎沖十三味丸(又名嘎迪-13味丸),由制草烏、訶子、麝香、禹糧土、制珊瑚、制珍珠、木香、石菖蒲、沉香、甘草、丁香、煅磁石、肉豆蔻13味單藥組成,蒙醫(yī)臨床一直用于治療半身不遂,神經(jīng)麻痹,風(fēng)濕,關(guān)節(jié)疼痛等疾病,療效滿意[1],已收錄入《中華人民共和國(guó)藥典》[2]。木香和沉香的主要的化學(xué)成分均有木香內(nèi)酯,木香內(nèi)酯具有極強(qiáng)的抗炎鎮(zhèn)痛效果。丁香在蒙醫(yī)臨床治療心血管疾病中,也被認(rèn)為具有抗炎、抗氧化作用[3]。本實(shí)驗(yàn)制備改良大鼠腹主動(dòng)脈縮窄模型,通過血流動(dòng)力學(xué)改變?cè)斐蓪?shí)驗(yàn)大鼠血管內(nèi)皮損傷,應(yīng)用扎沖十三味丸干預(yù),探討該藥對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷所致炎癥反應(yīng)干預(yù)作用的相關(guān)因素。

        1 材料與方法

        1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選用8周Sprague-Dawley(SD)健康大鼠100只,雄性,體重180~210 g,購(gòu)于長(zhǎng)春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司(SPF級(jí),動(dòng)物編號(hào):SCXK(吉)-2018-0007),于內(nèi)蒙古民族大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室(清潔級(jí))適應(yīng)性飼養(yǎng)一周,標(biāo)準(zhǔn)大鼠飼料飼養(yǎng),自由攝食飲水,溫度23~25 ℃,濕度55 %~70 %。術(shù)前12 h禁食。

        1.2試劑與儀器 扎沖十三味丸由內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院蒙藥制劑室提供(批準(zhǔn)文號(hào):內(nèi)藥制字M14060747),Elisa試劑盒購(gòu)自武漢華聯(lián)科生物技術(shù)有限公司。酶標(biāo)儀為芬蘭Labsystems Multiskan MS公司產(chǎn)品,儀器型號(hào)為352型。透射電子顯微鏡為日本日立綜合跨國(guó)公司(hitachi)生產(chǎn),儀器型號(hào)HT7700。

        1.3方法

        1.3.1分組 首先將100只SD大鼠隨機(jī)選出25只為假手術(shù)組,只暴露腹主動(dòng)脈,不做其他手術(shù);其余75只進(jìn)行改良腹主動(dòng)脈縮窄模型手術(shù);將手術(shù)后的實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為模型組、扎沖十三味丸組、曲美他嗪組,每組25只,自由飲水?dāng)z食。

        1.3.2給藥 藥量參考《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》計(jì)算方法。扎沖十三味丸以蒸餾水配制成2 %濃度,灌胃給藥,每日一次,每次1.2 mL;模型組給予生理鹽水灌胃;假手術(shù)組在同一環(huán)境下飼養(yǎng)不予灌胃。西藥鹽酸曲美他嗪用于心血管疾病的治療,具有改善心肌細(xì)胞缺氧和血管內(nèi)皮細(xì)胞功能作用[4],本實(shí)驗(yàn)作為實(shí)驗(yàn)比對(duì)組。曲美他嗪按成人口服劑量6.3倍,用雙蒸水稀釋后灌胃。

        1.3.3模型建立 建立改良腹主動(dòng)脈縮窄模型。實(shí)驗(yàn)大鼠10 %水合氯醛(0.35 mL/100 mg)腹腔注射麻醉,大鼠右側(cè)臥位固定于操作臺(tái)上,腹左側(cè)肋弓下緣脊柱前備皮,常規(guī)消毒,在肋脊角下縱型切開皮膚1~2 cm,鈍性分離筋膜及肌肉,暴露左腎及其上方的腹主動(dòng)脈,分離出腹主動(dòng)脈,用4號(hào)縫合線從腹主動(dòng)脈下方穿過備用,將磨鈍的0.7 mm注射針頭平行至于腹主動(dòng)脈外側(cè),將針頭與腹主動(dòng)脈一起捆綁后,迅速小心拔出針頭,造成腹主動(dòng)脈部分狹窄,縫合后常規(guī)消毒,大鼠保溫復(fù)蘇至清醒,自由飲食飲水。扎沖十三味丸組在手術(shù)第二天開始給扎沖十三味丸組灌配置好的扎沖十三味丸藥液、模型組灌生理鹽水、曲美他嗪比對(duì)組灌配置好的曲美他嗪藥液。共建模28天。

        1.3.4標(biāo)本的采集與檢測(cè) 于造模28 d腹主動(dòng)脈取血(麻醉同上),剪下帶有結(jié)扎線段的腹主動(dòng)脈2~3cm。將腹主動(dòng)脈做相應(yīng)的染色觀察,方法嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行;采用Western-blot法檢測(cè)血管組織中IL-6、TNF-α蛋白的表達(dá);Elisa法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)大鼠血清中IL-6、TNF-α含量及血漿中血管內(nèi)皮因子NO、ET-1的含量。

        2 結(jié)果

        2.1通過Masson染色法觀察扎沖十三味丸對(duì)大鼠血管組織纖維化程度 Masson染色法觀察血管組織,膠原纖維呈藍(lán)色,肌纖維呈紅色。假手術(shù)組膠原纖維、肌纖維厚薄均勻排列正常;模型組藍(lán)染膠原纖維增多,提示有膠原纖維化;扎沖十三味丸組血管組織藍(lán)染面積與模型組相比減少;曲美他嗪比對(duì)組血管組織藍(lán)染面積與扎沖十三味丸組藍(lán)染面積相似,與模型組相比藍(lán)染面積減少。通過Image J軟件計(jì)算膠原容積分?jǐn)?shù),分析血管組織纖維化程度。假手術(shù)組膠原容積分?jǐn)?shù)為7.318 %;模型組膠原容積分?jǐn)?shù)高于假手術(shù)組;扎沖十三味丸組與曲美他嗪組膠原容積分?jǐn)?shù)差距不大但小于模型組大于假手術(shù)組。

        通過對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠血管壁組織進(jìn)行Masson染色,結(jié)果顯示見模型組較假手術(shù)組實(shí)驗(yàn)大鼠血管壁組織的藍(lán)染膠原纖維增多,膠原容積分?jǐn)?shù)增高,提示有膠原纖維化。

        圖1 大鼠血管組織Masson染色圖

        圖2 各組大鼠Masson染色膠原容積分?jǐn)?shù)

        2.2HE染色觀察扎沖十三味丸對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞炎性損傷的干預(yù) 通過HE染色法,觀察血管組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)情況:假手術(shù)組實(shí)驗(yàn)大鼠的血管內(nèi)皮細(xì)胞的排列和形態(tài)均正常、無炎性細(xì)胞浸潤(rùn);模型組實(shí)驗(yàn)大鼠的血管組織中局部管壁結(jié)構(gòu)不清,可見較多炎性細(xì)胞、多核巨細(xì)胞、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn);扎沖十三味丸組實(shí)驗(yàn)大鼠的血管組織局部管壁可見少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),較模型組炎性細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)量減少;曲美他嗪組實(shí)驗(yàn)大鼠血管組織有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)與扎沖十三味丸組相似,較模型組炎性細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)量減少。

        2.3通過透射電鏡觀察 透射電子顯微鏡下觀察血管超微結(jié)構(gòu)的變化,可見各組血管平滑肌均存在不同程度損傷。假手術(shù)組血管平滑肌細(xì)胞有較輕微的損傷,線粒體數(shù)量較少,輕度腫脹,線粒體嵴模糊,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未見明顯擴(kuò)張;模型組血管平滑肌細(xì)胞損傷較為嚴(yán)重,膜內(nèi)脂滴較多,細(xì)胞器空泡變;扎沖十三味丸組血管平滑肌細(xì)胞損傷較模型組輕,線粒體數(shù)量較少,輕度腫脹;曲美他嗪組平滑肌細(xì)胞損傷較模型組重較扎沖十三味丸組輕,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)可見明顯擴(kuò)張。

        圖3 大鼠血管組織HE染色

        圖4 大鼠透射電鏡圖×60K

        2.4通過 ELISA法觀察扎沖十三味丸對(duì)大鼠血管內(nèi)皮功能的影響 通過 ELISA法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)大鼠血清中IL-6和TNF-α的含量。與假手術(shù)組相比較,模型組中IL-6和TNF-α的含量增加,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);扎沖十三味丸組、曲美他嗪組IL-6和TNF-α的含量增加,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組相比較,扎沖十三味丸組、曲美他嗪組IL-6和TNF-α的含量降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

        通過ELISA法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)大鼠血漿NO和ET-1含量,觀察血管的舒張收縮狀態(tài)。與假手術(shù)組相比,模型組中NO和ET-1的含量均顯著增加(P<0.05);扎沖十三味丸組較模型組NO和ET-1的含量降低,差異顯著(P<0.05);曲美他嗪組較模型組NO和ET-1的含量降低,差異顯著(P<0.05);曲美他嗪組較扎沖十三味丸組差異不明顯(P>0.05)。

        表1 各組大鼠血清IL-6、TNF-α含量比較

        表2 各組大鼠血漿中NO、ET-1含量比較

        2.5計(jì)算各組大鼠血漿中NO/ET-1比值 內(nèi)皮細(xì)胞依賴性血管舒張收縮功能ET-1/NO系統(tǒng),是評(píng)價(jià)內(nèi)皮功能的重要標(biāo)準(zhǔn)。模型組NO和ET-1含量較假手術(shù)組均增高,且NO/ET-1比值(1.025)高于假手術(shù)組(0.628);扎沖十三味丸組NO和ET-1含量均高于假手術(shù)組而低于模型組,NO/ET-1比值(1.001)。扎沖十三味丸可以降低血漿中NO和ET-1含量,對(duì)模型組血管的緊張度無改變影響;曲美他嗪組,NO/ET-1比值下降,為0.704,較模型組小,較假手術(shù)組高,較扎沖十三味丸組小。見表3、圖5。

        表3 各組大鼠血漿中NO/ET-1比值比較

        圖5 各組大鼠血漿中NO/ET-1比值比較

        2.6通過免疫印跡法觀察 通過免疫印跡法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)大鼠血管組織中IL-6和TNF-α蛋白的表達(dá)。大鼠血管組織中IL-6蛋白表達(dá):模型組較假手術(shù)組表達(dá)顯著增加(P<0.05);扎沖十三味丸組、曲美他嗪比對(duì)組較模型組表達(dá)顯著降低(P<0.05)。大鼠血管組織中TNF-α蛋白表達(dá):模型組較假手術(shù)組表達(dá)顯著增加(P<0.05);扎沖十三味丸組、曲美他嗪組較模型組表達(dá)顯著降低(P<0.05)。見圖6、表4。

        圖6 大鼠血管組織中IL-6和TNF-α蛋白的表達(dá)

        表4 大鼠血管組織中IL-6和TNF-α蛋白的表達(dá)

        3 討論

        血管縮窄,血流動(dòng)力學(xué)會(huì)發(fā)生改變,致使血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷引起炎性反應(yīng)的發(fā)生,炎性細(xì)胞因子TNF-α不但促使炎性細(xì)胞聚集和炎癥介質(zhì)的釋放及誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子IL-6的分泌,也可影響內(nèi)皮舒張因子NO的合成和生物利用率,導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂,血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷和血栓的形成等一系列病理生理過程[5]。IL-6由單核細(xì)胞分泌,在炎癥反應(yīng)中,使血管通透性增加及血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷加重并破壞其完整性和使其功能障礙。內(nèi)皮細(xì)胞依賴性血管舒張功能NO/ET-1系統(tǒng)失衡,將引發(fā)血管內(nèi)皮機(jī)能失衡,由此造成諸如血栓、斑塊的產(chǎn)生等[6]。

        本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用改良腹主動(dòng)脈縮窄模型,通過血流動(dòng)力學(xué)改變致實(shí)驗(yàn)大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷,而后給予相應(yīng)的藥物干預(yù)。結(jié)果顯示,扎沖十三味丸干預(yù)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷炎性反應(yīng),使管壁組織中炎性細(xì)胞減少,線粒體腫脹減輕,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張程度減少,此作用與改善血管組織纖維化程度、降低血管組織中IL-6和TNF-α蛋白的表達(dá)、減少血清中炎性細(xì)胞因子IL-6和TNF-α的含量因素相關(guān),且優(yōu)于西藥曲美他嗪,而與內(nèi)皮細(xì)胞依賴性血管舒張功能NO/ET-1系統(tǒng)平衡無關(guān)。西藥曲美他嗪有調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞依賴性血管舒張功能NO/ET-1系統(tǒng)平衡的作用。

        蒙成藥扎沖十三味丸對(duì)心腦血管和神經(jīng)系統(tǒng)疾病都有一定的療效,但其在其他疾病治療中的應(yīng)用仍不明確。扎沖十三味丸具有舒筋活血、鎮(zhèn)靜止痛、擴(kuò)張微血管、抑制血小板凝集、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞等作用,其作用機(jī)制尚有待進(jìn)一步從臨床、病理和分子角度進(jìn)行深入研究,從而不斷拓展其臨床適應(yīng)證,為人類健康服務(wù)。

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