黨慧杰，鄭遠(yuǎn)榮，劉振民*

1(上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海，201306)2(乳業(yè)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海乳業(yè)生物工程技術(shù)研究中心， 光明乳業(yè)股份有限公司乳業(yè)研究院，上海，200436)

乳清分離蛋白(whey protein isolate,WPI)是蛋白含量在90%以上的一種乳清蛋白產(chǎn)品。乳清蛋白是干酪生產(chǎn)的副產(chǎn)物乳清中的主要固形物成分，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，被廣泛應(yīng)用到加工食品中。乳清蛋白包含β-乳球蛋白(β-lactoglobulin，β-LG)、α-乳白蛋白(α-lactalbumin，α-LA)、牛血清白蛋白等以及其他活性成分。其中β-LG和α-LA在WPI中含量較高，也是牛乳過(guò)敏的主要過(guò)敏原[1]。已有眾多學(xué)者研究了乳清蛋白改性技術(shù)，來(lái)消減乳清蛋白的致敏性。如熱處理、酶水解、輻照以及超高壓等技術(shù)[2-4]。不同加工技術(shù)對(duì)乳清蛋白結(jié)構(gòu)的影響不同，通過(guò)對(duì)乳清蛋白結(jié)構(gòu)的修飾，進(jìn)而影響其致敏性。其中，乳清蛋白致敏性變化程度取決于加工方法、程度、處理時(shí)間等。

超高壓(ultra-high pressure, UHP)作為近年來(lái)較為新型的食品加工技術(shù)，有著較為廣泛的應(yīng)用前景。高壓過(guò)程可以產(chǎn)生強(qiáng)烈的機(jī)械應(yīng)力以及摩擦熱，產(chǎn)生局部高熱[5]，不僅能夠使微生物有效破壞，還可以導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化[6]，并且在食品工業(yè)中易于擴(kuò)大生產(chǎn)[7]。超高壓處理可以通過(guò)改變分子間或者分子疏水相互作用以及靜電作用而導(dǎo)致蛋白質(zhì)三級(jí)、四級(jí)結(jié)構(gòu)的可逆或者不可逆的改變[8]，從而使其功能特性發(fā)生變化。龐佳坤等[9]利用傅里葉紅外光譜探究高壓對(duì)WPI結(jié)構(gòu)的影響，發(fā)現(xiàn)壓力可以使其二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。但是，也有研究表明超高壓處理后乳清蛋白的三級(jí)和四級(jí)結(jié)構(gòu)改變，而二級(jí)結(jié)構(gòu)并未發(fā)生明顯的改變[10-11]。蛋白質(zhì)的致敏性與其結(jié)構(gòu)息息相關(guān)[1]，超高壓對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)的影響又較為復(fù)雜，與壓力大小、保壓時(shí)間、溫度以及溶液pH等相關(guān)[12]。已有的研究大多聚焦在超高壓對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)以及其他理化性質(zhì)的影響上面，如溶解性、抗氧化活性等[9,13]。但是少有研究具體探究超高壓技術(shù)對(duì)WPI中致敏蛋白的影響方式和程度。對(duì)于超高壓對(duì)WPI致敏性影響的程度，十分有必要了解其在微觀和宏觀層面以及后續(xù)的胃腸道消化時(shí)，如何通過(guò)結(jié)構(gòu)的改變影響致敏性。

因此，本研究的目的是探究超高壓對(duì)于WPI結(jié)構(gòu)以及致敏蛋白含量的影響，降低WPI的致敏性。采用不同的超高壓力處理WPI，通過(guò)圓二色性光譜、內(nèi)源熒光光譜、巰基含量等的測(cè)定來(lái)評(píng)估超高壓對(duì)WPI二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)的影響，并通過(guò)水解度、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis,SDS-page)以及β-LG和α-LA含量的檢測(cè)來(lái)考察超高壓對(duì)WPI中致敏蛋白含量降解的影響，進(jìn)而為超高壓技術(shù)應(yīng)用在低致敏性乳粉生產(chǎn)中提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

乳清分離蛋白(WPI,蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)93.9%)，恒天然商貿(mào)(上海)有限公司；Ellmans′s試劑、tris-gly、乙二胺四乙酸，美國(guó)Sigma公司；β-乳球蛋白以及α-乳白蛋白檢測(cè)試劑盒，上海酶聯(lián)生物技術(shù)有限公司。其余試劑均為分析純。FPG7100 型高壓設(shè)備，德國(guó) IKA 公司；SepectraMax M5酶標(biāo)儀，美國(guó) Molecular Devices 公司；SPECORD-205 紫外分光光度計(jì)，德國(guó)Analytikjena公司；J815圓二色光譜儀，日本JASOC公司；PROTEAN3 電泳儀、Geldoc-XR+凝膠成像儀，美國(guó) Bio-Rad 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 超高壓處理

配制質(zhì)量濃度為10 mg/mL的WPI溶液，取適量溶液分裝于特制包裝袋中進(jìn)行真空包裝，后置于超高壓壓力腔中，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。壓力條件為100、200、400和600 MPa，保壓時(shí)間20 min。以未經(jīng)壓力處理的WPI溶液作為對(duì)照。

1.2.2 圓二色性光譜分析

WPI樣品稀釋至200 μg/mL,加入到石英比色皿(光徑0.1 cm)中，置于圓二色光譜儀上進(jìn)行檢測(cè)。掃描范圍190～250 nm，步長(zhǎng)0.5 nm，掃描速度200 nm/min，并用CD Pro軟件擬合乳清蛋白中二級(jí)結(jié)構(gòu)的組成與含量[14-15]。

1.2.3 總巰基和表面巰基含量的測(cè)定

參考MAFORIMBO等[16]的方法，進(jìn)行測(cè)定。表面巰基含量的測(cè)定：取200 μL的WPI樣品和1 mL的Tris-甘氨酸緩沖液(pH 8.0，含4 mmol/L的EDTA)混合，隨后加入20 μL的Ellman′s試劑(4 mg/mL)，室溫(25±2) ℃避光振蕩30 min后測(cè)定412 nm處的吸光度值，以?xún)H加Ellman′s試劑為空白對(duì)照?？値€基含量的測(cè)定和表面巰基含量的測(cè)定方法一致，所使用的的緩沖溶液為含有4 mmol/L的EDTA、8 mol/L的尿素，pH 8的tris-gly緩沖溶液。

巰基(SH)含量的計(jì)算如公式(1)所示:

(1)

式中：A412，樣品在412 nm處的吸光值；D，樣品的稀釋倍數(shù)；C，WPI的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，mg/mL。

1.2.4 內(nèi)源熒光光譜檢測(cè)

參考GINA等[17]的方法。把樣品稀釋到1 mg/mL，用酶標(biāo)儀進(jìn)行色氨酸內(nèi)源性熒光分析。激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm，掃描300～400 nm的發(fā)射光譜。

1.2.5 超高壓對(duì)WPI降解情況分析

1.2.5.1 水解度的測(cè)定

根據(jù)SPELLMAN等[18]描述的方法，采用鄰苯二甲醛(o-phthalaldehyde,OPA)法測(cè)定樣品的水解度，以L-絲氨酸溶液(0.1 g/L)作為標(biāo)準(zhǔn)品。按照文獻(xiàn)中描述的方法配置OPA溶液，取400 μL待測(cè)樣品加入到盛有3 mL OPA溶液的試管中，振蕩混勻5 s，避光反應(yīng)2 min，以去離子水作為空白對(duì)照。用紫外分光光度計(jì)測(cè)量樣品在340 nm處的吸光值。按照公式(2)計(jì)算水解度：

(2)

式中：ODsa，測(cè)得樣品的吸光度；ODb，測(cè)得空白對(duì)照的吸光度；ODst，測(cè)得標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度；X，樣品重量，g；P，樣品中蛋白質(zhì)的含量；0.1，樣品體積轉(zhuǎn)換成L。

1.2.5.2 SDS-page凝膠電泳

參考CARULLO等[6]的方法，不同壓力條件的WPI樣品(1 mg/mL)分別取樣進(jìn)行SDS-page凝膠電泳。采用5%濃縮膠，15%分離膠，上樣量為8 μL。電泳初始電壓為100 V，待樣品進(jìn)入分離膠時(shí)，調(diào)整電壓至150 V。樣品涌動(dòng)至距凝膠底部0.5 cm時(shí)停止電泳。

1.2.5.3 β-LG以及α-LA含量的測(cè)定

根據(jù)酶聯(lián)免疫吸附法原理[19]測(cè)定樣品中β-LG以及α-LA的含量。將樣品稀釋至1 mg/mL,利用β-LG以及α-LA試劑盒檢測(cè)樣品中2種蛋白的含量。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析

所有的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均由平行測(cè)定3次得到，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。采用Excel 2010以及SPSS Statistics 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，顯著水平設(shè)置為P<0.05，采用Origin Pro 2017對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 UHP對(duì)WPI二級(jí)結(jié)構(gòu)含量的影響

經(jīng)過(guò)圓二色性光譜擬合軟件對(duì)圓二色性光譜圖進(jìn)行分析計(jì)算，得到WPI表面蛋白結(jié)構(gòu)隨不同的超高壓變化的情況，如表1所示。和對(duì)照組(0.1 MPa)相比，100 MPa組的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化不明顯。可能是產(chǎn)生了結(jié)構(gòu)的回復(fù)，有研究顯示，在一定的壓力保壓一段時(shí)間后，在很短的時(shí)間內(nèi)，會(huì)回復(fù)到之前的狀態(tài)[20]。但到了200 MPa及以上，隨著壓力的增加，二級(jí)結(jié)構(gòu)含量的變化在P<0.05的水平下，較為顯著。具體表現(xiàn)為α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角的顯著減少以及β-折疊和無(wú)規(guī)則卷曲的顯著增加，主要的原因可能是超高壓使維持蛋白質(zhì)α-螺旋結(jié)構(gòu)的氫鍵以及靜電作用減弱，導(dǎo)致部分α-螺旋結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化為β-折疊結(jié)構(gòu)，以及轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)的部分解體，蛋白結(jié)構(gòu)變得松散，結(jié)果和MUNIZAGA等[21]和LI等[22]的結(jié)論一致，超高壓處理可以改變WPI的 α-螺旋、β-折疊和無(wú)規(guī)則卷曲的含量，改變蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)。

圖1 不同UHP處理的WPI圓二色性光譜圖Fig.1 The circular dichroism spectrum of WPI in different UHP treatments

表1 不同UHP處理的WPI二級(jí)結(jié)構(gòu)含量Table 1 Secondary structure contents of WPI in different UHP treatments

2.2 UHP對(duì)WPI巰基含量的影響

巰基是蛋白質(zhì)中重要的功能基團(tuán)之一，具有較高的生物活性，可與二硫鍵在巰基/二硫鍵氧化還原酶的催化下相互轉(zhuǎn)化，對(duì)蛋白質(zhì)三維構(gòu)象的穩(wěn)定性起著重要的作用。游離巰基含量的變化可以在一定程度上反映蛋白質(zhì)在外界作用下發(fā)生的去折疊或變性的情況[23-24]。而且，相關(guān)的研究顯示，蛋白質(zhì)的致敏能力與其結(jié)構(gòu)相關(guān)[1,25]。不同的UHP水平對(duì)WPI的表面巰基和總巰基的含量影響如圖2所示。與未經(jīng)過(guò)壓力處理的樣品相比，100 MPa就能使WPI的巰基含量顯著增加(P<0.05)，這是由于超高壓可以使蛋白質(zhì)的三維構(gòu)象發(fā)生變化，使折疊的巰基暴露或破壞部分二硫鍵轉(zhuǎn)化為游離巰基。隨著壓力的逐漸增加，巰基含量也呈增加的趨勢(shì)，這和前人的研究一致[26]，從圖2也可以看出，超高壓對(duì)于表面巰基比總巰基的影響更大。400 MPa處理組，總巰基含量提高了25.92%，表面巰基提高了104.82%。而600 MPa組和400 MPa組對(duì)比不顯著，巰基含量的增量出現(xiàn)了減小的趨勢(shì)，可能的原因是在過(guò)高的壓力下,WPI可能發(fā)生了不可逆的變性，BELLOQUE等[27]的研究也表明了同樣的結(jié)果。

圖2 不同UHP處理的WPI總巰基和表面巰基含量Fig.2 Total and surface sulfhydryl contents of different UHP treatments on WPI

2.3 UHP對(duì)WPI內(nèi)源性熒光光譜的影響

蛋白質(zhì)分子中的色氨酸、酪氨酸以及苯丙氨酸能夠發(fā)射熒光，因此這3種氨基酸可以作為內(nèi)源性熒光探針來(lái)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的變化情況[28-29]。從圖3 可以看出，超高壓處理導(dǎo)致WPI熒光強(qiáng)度以及最大吸收波長(zhǎng)位置的變化。對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的最大熒光波長(zhǎng)出現(xiàn)在331 nm附近。100、200以及400 MPa處理組熒光強(qiáng)度較對(duì)照組弱，隨著壓力的增大，熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)。600 MPa使得WPI的熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，這說(shuō)明較高的壓力使得WPI內(nèi)部的疏水基團(tuán)暴露，造成色氨酸殘基在WPI溶液中的暴露量發(fā)生改變。所有的實(shí)驗(yàn)組均發(fā)生了較為明顯的紅移，這反映了WPI結(jié)構(gòu)中氨基酸側(cè)鏈的變化。YIN等[30]的研究也顯示超高壓處理增加色氨酸殘基在溶劑中的暴露，進(jìn)而增加紅蕓豆分離蛋白的熒光強(qiáng)度。

圖3 不同UHP處理的WPI內(nèi)源熒光光譜Fig.3 Endogenous fluorescence spectra of WPI in different UHP treatments

2.4 UHP對(duì)WPI降解的影響

2.4.1 UHP對(duì)WPI水解度的影響

水解度可以作為評(píng)估蛋白質(zhì)分子質(zhì)量降解的一個(gè)指標(biāo)，蛋白分子質(zhì)量降解得越多，水解度越高[31]。故可以用水解度來(lái)評(píng)估WPI中致敏蛋白降解的程度。從表2可以看出，不同的壓力水平對(duì)WPI水解度的影響不顯著(P<0.05)。這表明超高壓對(duì)致敏蛋白的含量降解影響較小。這與CARULLO等[6]的結(jié)論一致，他的研究說(shuō)明，超高壓處理對(duì)蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)影響較小。CHEN等[4]的研究也顯示了同樣的結(jié)果。

表2 不同UHP處理水平WPI的水解度Table 2 Enzymatic hydrolysis of WPI in different UHP treatments

2.4.2 UHP對(duì)WPI電泳特性的影響

經(jīng)過(guò)不同的UHP處理的WPI電泳圖譜如圖4所示，所有樣品分子質(zhì)量大都分布在14.4和18.4 kDa處，這是由于WPI的主要成分β-LG(約占WPI的50%)的分子質(zhì)量為18.3 kDa，α-La(約占WPI的25%)的分子質(zhì)量為14.2 kDa。此外還可見(jiàn)含量較少的牛血清白蛋白分布在66.2 kDa附近。從電泳圖中可以看出,處理組和對(duì)照組的條帶并無(wú)明顯差異，600 MPa以?xún)?nèi)的超高壓水平對(duì)WPI的分子質(zhì)量的影響較小，未引起WPI的降解。

2.4.3 WPI中β-LG以及α-LA含量降解情況

β-LG和α-LA約占乳清蛋白的75%，是牛乳中主要的致敏成分，特別是β-LG，研究顯示大約有80%的牛乳過(guò)敏和β-LG相關(guān)[32]。故而利用ELISA原理，來(lái)具體檢測(cè)WPI中2種標(biāo)志性過(guò)敏蛋白β-LG以及α-LA的含量，其含量如表3所示。不同的超高壓水平對(duì)β-LG影響不同，400 MPa處理的時(shí)候還呈現(xiàn)了顯著增加。其原因可能是β-LG的結(jié)構(gòu)較為緊密，呈現(xiàn)球狀的結(jié)構(gòu)，400 MPa的壓力可以使WPI結(jié)構(gòu)打開(kāi)，藏在結(jié)構(gòu)內(nèi)部的β-LG蛋白出現(xiàn)了一定程度的暴露，故而呈現(xiàn)增加的現(xiàn)象。壓力對(duì)α-LA含量的影響更大。其含量隨著壓力的增大呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，這可能原因是α-LA在WPI中大多分布在外部，超高壓能夠顯著破壞α-LA中的二硫鍵等非共價(jià)鍵，從而造成α-LA含量的減少。

M-蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1-WPI；2-100 MPa，20 min；3-200 MPa，20 min；4-400 MPa，20 min；2-600 MPa，20 min圖4 不同UHP處理的WPI的SDS-page電泳圖譜Fig.4 SDS-page electrophoresis of different UHP treatments on WPI

表3 不同UHP處理水平WPI的β-LG和α-LA含量Table 3 Content of β-LG and α-LA in WPI under different UHP treatments

3 結(jié)論與討論

通過(guò)不同的超高壓力處理WPI，考察超高壓對(duì)WPI的結(jié)構(gòu)和標(biāo)志性致敏蛋白含量的影響。相比于對(duì)照組，100 MPa及以上的壓力可以使WPI的表面巰基和總巰基含量顯著上升(P<0.05)，而到400 MPa后和更高的壓力相比差異不顯著(P>0.05)，這表明，一定的壓力可以使WPI的三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而增加了巰基的暴露量。內(nèi)源性熒光檢測(cè)的結(jié)果也表示了同樣的結(jié)論，超高壓處理組的熒光強(qiáng)度發(fā)生顯著變化，這表明，超高壓處理造成了WPI中色氨酸殘基的變化。而對(duì)于WPI的二級(jí)結(jié)構(gòu)，本研究發(fā)現(xiàn)，超高壓處理對(duì)WPI的二級(jí)結(jié)構(gòu)影響較為顯著，α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角轉(zhuǎn)化為β-折疊和無(wú)規(guī)則卷曲，蛋白的結(jié)構(gòu)變松散。超高壓處理對(duì)WPI的水解度以及電泳圖譜的影響較小，說(shuō)明超高壓并不能顯著改變WPI的一級(jí)結(jié)構(gòu)及含量。但是對(duì)于β-LG以及α-LA的含量進(jìn)行分析卻發(fā)現(xiàn)，超高壓可以顯著影響到這2種致敏蛋白的含量，具體來(lái)說(shuō)是在400 MPa時(shí)，β-LG出現(xiàn)最大程度的暴露，而α-LA的含量卻是隨著壓力的增大呈現(xiàn)顯著減少的趨勢(shì)，其原因可能是超高壓對(duì)于WPI結(jié)構(gòu)一定程度的破壞造成的。故由上述可得出的結(jié)論為，超高壓對(duì)WPI的一級(jí)結(jié)構(gòu)影響較為輕微，但可以顯著改變二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，進(jìn)而對(duì)β-LG和α-LA的致敏性造成影響。但是，對(duì)其中致敏蛋白的總量影響較小，而且在致敏蛋白的致敏性影響方面，還造成了β-LG含量增大的現(xiàn)象。因此若想通過(guò)單純的超高壓技術(shù)處理WPI不能降低WPI的致敏性。但通過(guò)此技術(shù)作為前處理，使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)打開(kāi)，繼而采用酶解技術(shù)處理WPI，則能提高酶解的作用效果，從而有利于生產(chǎn)低致敏性的乳制品。