彭燕鴻，蘇愛秋，黃偉文，藍(lán)素桂，楊天云，譚強(qiáng)*

1(廣西中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，廣西 南寧, 530000)2(廣西和桂集團(tuán)有限公司，廣西 南寧, 530001)

脂肪酶(triacylglycerol acylhydrolases,EC3.1.1.3)是一類可高效催化三酰甘油酯水解的酶，可催化油脂水解生成脂肪酸、甘油和甘油單酯或二酯，可進(jìn)行催化酯化、酯交換反應(yīng)、醇解反應(yīng)和酸解等反應(yīng)。脂肪酶廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物體內(nèi)。微生物脂肪酶早在20世紀(jì)初已被發(fā)現(xiàn)，迄今已發(fā)現(xiàn)超過100種產(chǎn)生脂肪酶的微生物。通過微生物發(fā)酵法來制備脂肪酶，因受環(huán)境影響小、生產(chǎn)周期短、效率高、成本低等優(yōu)勢(shì)，已成為工業(yè)化生產(chǎn)脂肪酶的主要途徑[1]。

脂肪酶用途廣泛。在食品工業(yè)中，可以改善食品的風(fēng)味，也可以合成高附加值的脂類產(chǎn)品。在造紙工業(yè)中，可以用于廢紙脫墨。在洗滌劑工業(yè)中，可以提高去垢力，改善洗滌效果。在燃料工業(yè)中，可以將動(dòng)植物油轉(zhuǎn)化成可再生性柴油燃料。在生物催化劑中，用于制備穩(wěn)定、可回收的納米催化劑和磁性生物催化劑以及辛酸辛酯的合成。另外在生物醫(yī)學(xué)科學(xué)以及日常清潔用品方面都有巨大的商業(yè)價(jià)值[2-3]。

工業(yè)生產(chǎn)對(duì)脂肪酶的熱穩(wěn)定性要求高，而天然脂肪酶的熱穩(wěn)定性難以滿足生產(chǎn)要求。嗜熱脂肪酶是一類在高溫下仍具有催化活性的脂肪酶(一般最適作用溫度大于40 ℃)，可滿足工業(yè)化運(yùn)用要求。嗜熱脂肪酶主要來源于極端條件下的嗜熱微生物。而通過對(duì)嗜熱脂肪酶進(jìn)行分子結(jié)構(gòu)改造，利用定向突變技術(shù)引入二硫鍵等方法可進(jìn)一步提高酶的熱穩(wěn)定性。

1 酶產(chǎn)生菌及表征的研究進(jìn)展

酶表達(dá)水平是衡量酶產(chǎn)生菌的酶生產(chǎn)能力指標(biāo)。酶的最適pH值和最適溫度是指在一定條件下，酶呈現(xiàn)最大活力時(shí)的pH值和溫度。熱穩(wěn)定性一般以酶在特定溫度條件下，維持一定時(shí)間后的剩余酶活力來表示。至今報(bào)道的嗜熱脂肪酶產(chǎn)生菌及其表達(dá)水平、最適pH值和溫度以及熱穩(wěn)定性見表1。

表1 耐酸/耐堿嗜熱脂肪酶Table 1 Acid / alkali resistant thermophilic lipase

耐酸嗜熱脂肪酶主要來源于細(xì)菌(克雷伯氏菌、伯克氏菌、不動(dòng)桿菌等)，酶表達(dá)水平為9.2～106.5 U/mL，最適pH值和溫度分別為pH 4.0～7.0和45～80 ℃。這些產(chǎn)生菌中，不動(dòng)桿菌Lip-43具有最高表達(dá)水平的酶表達(dá)量(106.5 U/mL)[7]。來源于伯克氏NJY-1-3和克雷伯氏菌B-36脂肪酶有最低的最適pH值為4.0，而來源于伯克氏菌NJY-1-3脂肪酶有最高的最適溫度65 ℃[4-5,10]。另外，來源于不動(dòng)桿菌Lip-43脂肪酶具有最高的熱穩(wěn)定性(75 ℃條件下維持120 min，仍保持55%的剩余酶活力)，適合于高溫環(huán)境下的生產(chǎn)[7]。

耐堿嗜熱脂肪酶也主要來源于細(xì)菌，包括假單胞菌、液化沙雷氏菌和芽孢桿菌等，酶表達(dá)水平為3.8～120 U/mL，最適pH和溫度分別為8.0～9.0和40～55 ℃。這些產(chǎn)生菌中，熒光假單胞菌NS2 W具有最高的酶表達(dá)量(69.7 U/mL)[11]。類產(chǎn)堿假單胞菌F331脂肪酶有最高的最適pH值為10[13]，而來源于嗜麥芽窄食單胞菌N24、熒光假單胞菌NS2 W和芽孢桿菌FS1403脂肪酶的最適溫度高達(dá)55 ℃[9,11-12]。來源于假單胞菌Lz1脂肪酶具有最好的熱穩(wěn)定性(50 ℃條件下維持24 h，仍保持100%的剩余酶活力)[10]，適合要求溫度較高的生產(chǎn)條件。

野生菌來源脂肪酶的酶表達(dá)水平普遍不高，表達(dá)量最高的不動(dòng)桿菌Lip-43也遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到工業(yè)化生產(chǎn)的要求，其熱穩(wěn)定性也較低。由此可見，野生菌來源的脂肪酶須通過進(jìn)一步的改造才能滿足工業(yè)化生產(chǎn)。

2 酶異源表達(dá)的研究進(jìn)展

通過構(gòu)建重組工程菌異源高效表達(dá)嗜熱脂肪酶，已經(jīng)成為酶工業(yè)化生產(chǎn)的主要方法?；蛑亟M菌的構(gòu)建，所涉及酶基因來源和表達(dá)系統(tǒng)(包括宿主、質(zhì)粒和啟動(dòng)子等)、表達(dá)水平以及酶表征等最近研究進(jìn)展見表2。

表2 嗜熱脂肪酶異源表達(dá)Table 2 Heterologous expression of thermophilic lipase

嗜熱脂肪酶異源表達(dá)所涉及的基因來源于細(xì)菌(包括芽孢桿菌、假單胞菌和酵母菌等)和真菌(嗜熱新薩托菌、疏棉狀嗜熱絲胞菌和嗜熱踝節(jié)菌等)。表達(dá)系統(tǒng)中常用宿主有BL21和GS115等，常用質(zhì)粒有pET類和pPIC9K等，常用啟動(dòng)子有T7和AOX1等。在這些構(gòu)建的工程菌中，基因來源于疏棉狀絲胞菌、以GS115-pPIC9K-AOX1為表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建工程菌GS115/pTL1，可獲得最高酶表達(dá)量24 522.6 U/mL[14]。關(guān)于耐酸嗜熱脂肪酶的異源表達(dá)，以來源于嗜熱新薩托菌P1(基因編號(hào)KF640700.1)酶基因、GS115-pPIC9K為表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建重組畢赤酵母工程菌GS115/pET22B(+)-Lip09，經(jīng)過高密度發(fā)酵可獲得1 900 U/mL的酶表達(dá)量[21]。另外，將來源于高溫烷烴地芽孢桿菌YN的耐堿嗜熱脂肪酶基因(基因編號(hào)83939851)，以DH5α-pCYTEXP1-λ為表達(dá)系統(tǒng)，構(gòu)建重組菌pCYTEX-LipA-6xhis，可獲得5 837.5 U/mL的酶表達(dá)量[17]。

基因來源以及宿主、質(zhì)粒與啟動(dòng)子等因素的選擇對(duì)嗜熱脂肪酶表達(dá)量有很大影響，可以通過對(duì)上述因素的進(jìn)一步篩選(例如增加產(chǎn)量的強(qiáng)啟動(dòng)子)提高異源重組工程菌的酶表達(dá)量。

3 酶分子結(jié)構(gòu)改造的研究進(jìn)展

通過對(duì)酶分子的結(jié)構(gòu)改造，可以顯著提高酶的穩(wěn)定性(即提高酶活力半衰期t1/2和酶分子熔解溫度Tm)，或降低酶分子的底物特異性Km，提高酶的催化效率。提高嗜熱脂肪酶的熱穩(wěn)定性方式有很多，包括定向進(jìn)化，定點(diǎn)突變等。AKBULUT等[26]通過定向進(jìn)化使短小芽孢桿菌脂肪酶基因在50 ℃的t1/2提高了9倍，PENG[27]通過多點(diǎn)飽和突變的南極假絲酵母脂肪酶得到了更好的嗜熱性，在60 ℃的t1/2提高了14倍。而利用定點(diǎn)突變技術(shù)在酶分子結(jié)構(gòu)上引入二硫鍵，提高酶分子的熱穩(wěn)定性，是目前最主要的研究方向。二硫鍵可穩(wěn)定蛋白質(zhì)肽鏈空間結(jié)構(gòu)，往往使蛋白質(zhì)具有較好的熱穩(wěn)定性。研究表明二硫鍵不僅會(huì)使脂肪酶的結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定，嗜熱脂肪酶分子中的二硫鍵數(shù)目往往要多于不嗜熱的脂肪酶[28]。另外，通過定點(diǎn)突變等技術(shù)改造酶分子與底物的結(jié)合部位，提高酶蛋白質(zhì)與底物結(jié)合的穩(wěn)定性，可以顯著地提高酶分子對(duì)底物的親和力，降低Km，提高催化效率。

嗜熱脂肪酶催化活性中心是在蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)中由絲氨酸殘基、組氨酸殘基和天冬氨酸殘基組成的“催化三聯(lián)體”[34]。突變位點(diǎn)的選擇可利用Disulfide by design軟件進(jìn)行預(yù)測(cè)和篩選擬二硫鍵。由表3可知，環(huán)孢青霉37通過定點(diǎn)突變獲得單突變子T251C，t1/2有著12.8倍升高[29]。南極假絲酵母通過突變后獲得雙突變子A162C/K308C，Tm提高了8.5 ℃[33]。華根霉基因突變后的三突變子K64 N/K68T/T201C，其Km大幅下降了71%，顯著地提高酶分子對(duì)底物的親和性[32]?？傊?，通過定點(diǎn)突變技術(shù)，對(duì)酶分子關(guān)鍵位點(diǎn)進(jìn)行突變改造，可以顯著的提高嗜熱脂肪酶分子的穩(wěn)定性或改善酶分子與底物的親和力，提高催化效率。因此，通過定向突變技術(shù)，結(jié)合其他分子改造技術(shù)，將是未來提高嗜熱脂肪酶熱穩(wěn)定性的方法與手段。

表3 脂肪酶結(jié)構(gòu)定點(diǎn)突變改造Table 3 Site directed mutagenesis of lipase

4 分離純化與固定化研究的研究進(jìn)展

經(jīng)分離純化后可獲得高純度的脂肪酶，為進(jìn)一步研究酶分子結(jié)構(gòu)提供前提基礎(chǔ)。酶分子的分離純化就是將酶分子溶解在溶劑中并把雜質(zhì)去除的過程。由于游離態(tài)酶分子相對(duì)不穩(wěn)定，容易受到環(huán)境pH、溫度、金屬離子、抑制劑、接觸介質(zhì)性質(zhì)等因素影響而失活，因此純化方法對(duì)酶活影響十分顯著。酶分離純化的目的就是為獲得高比活力和酶活力回收率。分離純化步驟多可除去更多雜質(zhì)，獲得高比活力，但是由于步驟繁瑣、時(shí)間長(zhǎng)等原因可導(dǎo)致酶活力損失大，造成酶活力回收率低。對(duì)嗜熱脂肪酶的純化總結(jié)如表4所示。

表4 嗜熱脂肪酶的純化Table 4 Purification of thermophilic lipase

由表4可知，當(dāng)前嗜熱脂肪酶主要通過硫酸銨沉淀并結(jié)合層析柱等手段進(jìn)行分離純化。由于嗜熱脂肪酶的分子質(zhì)量為25～60 kDa，這限定了分離載體的孔徑大小。對(duì)嗜熱脂肪酶進(jìn)行分離純化后，酶比活力為31.0～3 586.0 U/mg，酶活力回收率2.1%～64.1%。高溫烷烴地芽孢桿菌 YN經(jīng)固定金屬離子親和層析和凝膠過濾后，可獲得最高的酶比活力(3 586.0 U/mg)，但其酶活力損失較大，酶活力回收率只有2.1%[35]。嗜熱細(xì)菌X514通過Ni離子親和層析純化后，可得到最高的酶活力回收率(64.1%)[37]，酶比活力(2 069.2 U/mg)也較高。黑曲霉NCIM 1207通過Sephacryl-100層析法純化后，可得到著較高的酶比活力(1 373.0 U/mg)和較高的酶活力回收率(54%)[40]。

固定化酶技術(shù)是用物理或化學(xué)手段將游離的酶在一定范圍內(nèi)限制起來，酶分子易分離且可回收使用的一種技術(shù)。酶作為生物催化劑具有價(jià)格昂貴、壽命有限，而酶固定化技術(shù)可以使酶重復(fù)使用，增加酶的操作穩(wěn)定性。固定化載體一般分為無機(jī)載體材料、高分子載體材料和復(fù)合載體材料。酶分子與載體的固定化過程可造成酶活力損失的原因有多種，包括載體與酶分子活力中心關(guān)鍵氨基酸的共價(jià)結(jié)合與空間位阻等因素，導(dǎo)致獲得較低的酶活力回收率。而造成固定化酶使用過程中酶活力損失的原因有很多，例如酶本身失活、酶從載體上脫落、固定化載體破碎或溶解等都可能會(huì)造成酶活力損失。對(duì)嗜熱脂肪酶的固定化總結(jié)見表5。

表5 嗜熱脂肪酶的固定化Table 5 Immobilization of thermophilic lipase

由表5可知，嗜熱脂肪酶固定化一般采用物理吸附方法，通過載體陰陽(yáng)離子交換和吸附作用進(jìn)行固定化。固定化載體主要包括硅膠、功能化納米孔活性炭、疏水樹脂、聚乙烯醇/硼酸/淀粉/碳酸鈣、高嶺土/海藻酸鈉和硅藻土等。紅色沙雷氏菌來源的嗜熱脂肪酶通過與聚乙烯醇/硼酸/淀粉/碳酸鈣固定化后固定化酶最佳溫度從40 ℃上升到65 ℃，并經(jīng)過10次催化反應(yīng)重復(fù)后，酶活力依然保持80%，固定化技術(shù)顯著提高了酶的嗜熱性和穩(wěn)定性[48]。土桿菌來源的酶用物理吸附的方式固定在硅膠上，獲得最高的活力回收率(74.7%)，但經(jīng)催化反應(yīng)4次重復(fù)后，酶活力僅剩余40.8%[47]。這是由于酶分子與載體的結(jié)合不夠緊密，反應(yīng)過程中酶分子容易從載體脫落而損失，造成操作穩(wěn)定性低。藍(lán)銅綠假單胞菌來源的酶與戊二醛交聯(lián)固定化后，固定化酶呈現(xiàn)較好的酶活力回收率(68.7%)和操作穩(wěn)定性，經(jīng)過10個(gè)循環(huán)的催化反應(yīng)后，酶活仍剩余90%[49]。嗜熱芽孢桿菌BTL2通過疏水性樹脂固定化并經(jīng)過10次重復(fù)催化后，酶活力仍然保持100%[46]。因此，通過選擇合適的固定化載體，運(yùn)用合適的固定化技術(shù)，可以獲得操作穩(wěn)定性高以及比活力高的固定化酶。固定化嗜熱脂肪酶提高了酶的操作穩(wěn)定性，可在催化反應(yīng)中重復(fù)使用性，這是實(shí)現(xiàn)酶工業(yè)化應(yīng)用的主要途徑。

5 展望

近年來嗜熱脂肪酶在工業(yè)中的應(yīng)用越來越廣泛，野生菌來源的嗜熱脂肪酶在表達(dá)量、熱穩(wěn)定性與催化效率等方面難于滿足工業(yè)化需求。通過構(gòu)建基因工程菌異源表達(dá)和酶分子結(jié)構(gòu)改造等分子生物技術(shù)進(jìn)行改良，可以提高酶表達(dá)水平和熱穩(wěn)定性。酶的改造技術(shù)已成為生物工程研究的熱點(diǎn)，然而使用單一方法改造后往往達(dá)不到理想的效果。國(guó)內(nèi)外越來越多的研究表明，異源表達(dá)系統(tǒng)、定點(diǎn)突變位點(diǎn)、純化與固定化方式等方法對(duì)脂肪酶活力和熱穩(wěn)定性等都有影響。因此，謹(jǐn)慎地選擇最優(yōu)的組合方案尤為重要。為獲得理想高產(chǎn)的嗜熱脂肪酶，未來的方向應(yīng)進(jìn)行多方面綜合考慮并結(jié)合多種方法進(jìn)行研究，使嗜熱脂肪酶在工業(yè)化應(yīng)用中具有更好的發(fā)展前景。