彭燕鴻，蘇愛秋，黃偉文，藍素桂，楊天云，譚強*

1(廣西中醫(yī)藥大學 藥學院，廣西 南寧, 530000)2(廣西和桂集團有限公司，廣西 南寧, 530001)

脂肪酶(triacylglycerol acylhydrolases,EC3.1.1.3)是一類可高效催化三酰甘油酯水解的酶，可催化油脂水解生成脂肪酸、甘油和甘油單酯或二酯，可進行催化酯化、酯交換反應、醇解反應和酸解等反應。脂肪酶廣泛存在于動物、植物和微生物體內。微生物脂肪酶早在20世紀初已被發(fā)現(xiàn)，迄今已發(fā)現(xiàn)超過100種產生脂肪酶的微生物。通過微生物發(fā)酵法來制備脂肪酶，因受環(huán)境影響小、生產周期短、效率高、成本低等優(yōu)勢，已成為工業(yè)化生產脂肪酶的主要途徑[1]。

脂肪酶用途廣泛。在食品工業(yè)中，可以改善食品的風味，也可以合成高附加值的脂類產品。在造紙工業(yè)中，可以用于廢紙脫墨。在洗滌劑工業(yè)中，可以提高去垢力，改善洗滌效果。在燃料工業(yè)中，可以將動植物油轉化成可再生性柴油燃料。在生物催化劑中，用于制備穩(wěn)定、可回收的納米催化劑和磁性生物催化劑以及辛酸辛酯的合成。另外在生物醫(yī)學科學以及日常清潔用品方面都有巨大的商業(yè)價值[2-3]。

工業(yè)生產對脂肪酶的熱穩(wěn)定性要求高，而天然脂肪酶的熱穩(wěn)定性難以滿足生產要求。嗜熱脂肪酶是一類在高溫下仍具有催化活性的脂肪酶(一般最適作用溫度大于40 ℃)，可滿足工業(yè)化運用要求。嗜熱脂肪酶主要來源于極端條件下的嗜熱微生物。而通過對嗜熱脂肪酶進行分子結構改造，利用定向突變技術引入二硫鍵等方法可進一步提高酶的熱穩(wěn)定性。

1 酶產生菌及表征的研究進展

酶表達水平是衡量酶產生菌的酶生產能力指標。酶的最適pH值和最適溫度是指在一定條件下，酶呈現(xiàn)最大活力時的pH值和溫度。熱穩(wěn)定性一般以酶在特定溫度條件下，維持一定時間后的剩余酶活力來表示。至今報道的嗜熱脂肪酶產生菌及其表達水平、最適pH值和溫度以及熱穩(wěn)定性見表1。

表1 耐酸/耐堿嗜熱脂肪酶Table 1 Acid / alkali resistant thermophilic lipase

耐酸嗜熱脂肪酶主要來源于細菌(克雷伯氏菌、伯克氏菌、不動桿菌等)，酶表達水平為9.2～106.5 U/mL，最適pH值和溫度分別為pH 4.0～7.0和45～80 ℃。這些產生菌中，不動桿菌Lip-43具有最高表達水平的酶表達量(106.5 U/mL)[7]。來源于伯克氏NJY-1-3和克雷伯氏菌B-36脂肪酶有最低的最適pH值為4.0，而來源于伯克氏菌NJY-1-3脂肪酶有最高的最適溫度65 ℃[4-5,10]。另外，來源于不動桿菌Lip-43脂肪酶具有最高的熱穩(wěn)定性(75 ℃條件下維持120 min，仍保持55%的剩余酶活力)，適合于高溫環(huán)境下的生產[7]。

耐堿嗜熱脂肪酶也主要來源于細菌，包括假單胞菌、液化沙雷氏菌和芽孢桿菌等，酶表達水平為3.8～120 U/mL，最適pH和溫度分別為8.0～9.0和40～55 ℃。這些產生菌中，熒光假單胞菌NS2 W具有最高的酶表達量(69.7 U/mL)[11]。類產堿假單胞菌F331脂肪酶有最高的最適pH值為10[13]，而來源于嗜麥芽窄食單胞菌N24、熒光假單胞菌NS2 W和芽孢桿菌FS1403脂肪酶的最適溫度高達55 ℃[9,11-12]。來源于假單胞菌Lz1脂肪酶具有最好的熱穩(wěn)定性(50 ℃條件下維持24 h，仍保持100%的剩余酶活力)[10]，適合要求溫度較高的生產條件。

野生菌來源脂肪酶的酶表達水平普遍不高，表達量最高的不動桿菌Lip-43也遠遠達不到工業(yè)化生產的要求，其熱穩(wěn)定性也較低。由此可見，野生菌來源的脂肪酶須通過進一步的改造才能滿足工業(yè)化生產。

2 酶異源表達的研究進展

通過構建重組工程菌異源高效表達嗜熱脂肪酶，已經成為酶工業(yè)化生產的主要方法。基因重組菌的構建，所涉及酶基因來源和表達系統(tǒng)(包括宿主、質粒和啟動子等)、表達水平以及酶表征等最近研究進展見表2。

表2 嗜熱脂肪酶異源表達Table 2 Heterologous expression of thermophilic lipase

嗜熱脂肪酶異源表達所涉及的基因來源于細菌(包括芽孢桿菌、假單胞菌和酵母菌等)和真菌(嗜熱新薩托菌、疏棉狀嗜熱絲胞菌和嗜熱踝節(jié)菌等)。表達系統(tǒng)中常用宿主有BL21和GS115等，常用質粒有pET類和pPIC9K等，常用啟動子有T7和AOX1等。在這些構建的工程菌中，基因來源于疏棉狀絲胞菌、以GS115-pPIC9K-AOX1為表達系統(tǒng)構建工程菌GS115/pTL1，可獲得最高酶表達量24 522.6 U/mL[14]。關于耐酸嗜熱脂肪酶的異源表達，以來源于嗜熱新薩托菌P1(基因編號KF640700.1)酶基因、GS115-pPIC9K為表達系統(tǒng)構建重組畢赤酵母工程菌GS115/pET22B(+)-Lip09，經過高密度發(fā)酵可獲得1 900 U/mL的酶表達量[21]。另外，將來源于高溫烷烴地芽孢桿菌YN的耐堿嗜熱脂肪酶基因(基因編號83939851)，以DH5α-pCYTEXP1-λ為表達系統(tǒng)，構建重組菌pCYTEX-LipA-6xhis，可獲得5 837.5 U/mL的酶表達量[17]。

基因來源以及宿主、質粒與啟動子等因素的選擇對嗜熱脂肪酶表達量有很大影響，可以通過對上述因素的進一步篩選(例如增加產量的強啟動子)提高異源重組工程菌的酶表達量。

3 酶分子結構改造的研究進展

通過對酶分子的結構改造，可以顯著提高酶的穩(wěn)定性(即提高酶活力半衰期t1/2和酶分子熔解溫度Tm)，或降低酶分子的底物特異性Km，提高酶的催化效率。提高嗜熱脂肪酶的熱穩(wěn)定性方式有很多，包括定向進化，定點突變等。AKBULUT等[26]通過定向進化使短小芽孢桿菌脂肪酶基因在50 ℃的t1/2提高了9倍，PENG[27]通過多點飽和突變的南極假絲酵母脂肪酶得到了更好的嗜熱性，在60 ℃的t1/2提高了14倍。而利用定點突變技術在酶分子結構上引入二硫鍵，提高酶分子的熱穩(wěn)定性，是目前最主要的研究方向。二硫鍵可穩(wěn)定蛋白質肽鏈空間結構，往往使蛋白質具有較好的熱穩(wěn)定性。研究表明二硫鍵不僅會使脂肪酶的結構更穩(wěn)定，嗜熱脂肪酶分子中的二硫鍵數目往往要多于不嗜熱的脂肪酶[28]。另外，通過定點突變等技術改造酶分子與底物的結合部位，提高酶蛋白質與底物結合的穩(wěn)定性，可以顯著地提高酶分子對底物的親和力，降低Km，提高催化效率。

嗜熱脂肪酶催化活性中心是在蛋白質分子結構中由絲氨酸殘基、組氨酸殘基和天冬氨酸殘基組成的“催化三聯(lián)體”[34]。突變位點的選擇可利用Disulfide by design軟件進行預測和篩選擬二硫鍵。由表3可知，環(huán)孢青霉37通過定點突變獲得單突變子T251C，t1/2有著12.8倍升高[29]。南極假絲酵母通過突變后獲得雙突變子A162C/K308C，Tm提高了8.5 ℃[33]。華根霉基因突變后的三突變子K64 N/K68T/T201C，其Km大幅下降了71%，顯著地提高酶分子對底物的親和性[32]?？傊?，通過定點突變技術，對酶分子關鍵位點進行突變改造，可以顯著的提高嗜熱脂肪酶分子的穩(wěn)定性或改善酶分子與底物的親和力，提高催化效率。因此，通過定向突變技術，結合其他分子改造技術，將是未來提高嗜熱脂肪酶熱穩(wěn)定性的方法與手段。

表3 脂肪酶結構定點突變改造Table 3 Site directed mutagenesis of lipase

4 分離純化與固定化研究的研究進展

經分離純化后可獲得高純度的脂肪酶，為進一步研究酶分子結構提供前提基礎。酶分子的分離純化就是將酶分子溶解在溶劑中并把雜質去除的過程。由于游離態(tài)酶分子相對不穩(wěn)定，容易受到環(huán)境pH、溫度、金屬離子、抑制劑、接觸介質性質等因素影響而失活，因此純化方法對酶活影響十分顯著。酶分離純化的目的就是為獲得高比活力和酶活力回收率。分離純化步驟多可除去更多雜質，獲得高比活力，但是由于步驟繁瑣、時間長等原因可導致酶活力損失大，造成酶活力回收率低。對嗜熱脂肪酶的純化總結如表4所示。

表4 嗜熱脂肪酶的純化Table 4 Purification of thermophilic lipase

由表4可知，當前嗜熱脂肪酶主要通過硫酸銨沉淀并結合層析柱等手段進行分離純化。由于嗜熱脂肪酶的分子質量為25～60 kDa，這限定了分離載體的孔徑大小。對嗜熱脂肪酶進行分離純化后，酶比活力為31.0～3 586.0 U/mg，酶活力回收率2.1%～64.1%。高溫烷烴地芽孢桿菌 YN經固定金屬離子親和層析和凝膠過濾后，可獲得最高的酶比活力(3 586.0 U/mg)，但其酶活力損失較大，酶活力回收率只有2.1%[35]。嗜熱細菌X514通過Ni離子親和層析純化后，可得到最高的酶活力回收率(64.1%)[37]，酶比活力(2 069.2 U/mg)也較高。黑曲霉NCIM 1207通過Sephacryl-100層析法純化后，可得到著較高的酶比活力(1 373.0 U/mg)和較高的酶活力回收率(54%)[40]。

固定化酶技術是用物理或化學手段將游離的酶在一定范圍內限制起來，酶分子易分離且可回收使用的一種技術。酶作為生物催化劑具有價格昂貴、壽命有限，而酶固定化技術可以使酶重復使用，增加酶的操作穩(wěn)定性。固定化載體一般分為無機載體材料、高分子載體材料和復合載體材料。酶分子與載體的固定化過程可造成酶活力損失的原因有多種，包括載體與酶分子活力中心關鍵氨基酸的共價結合與空間位阻等因素，導致獲得較低的酶活力回收率。而造成固定化酶使用過程中酶活力損失的原因有很多，例如酶本身失活、酶從載體上脫落、固定化載體破碎或溶解等都可能會造成酶活力損失。對嗜熱脂肪酶的固定化總結見表5。

表5 嗜熱脂肪酶的固定化Table 5 Immobilization of thermophilic lipase

由表5可知，嗜熱脂肪酶固定化一般采用物理吸附方法，通過載體陰陽離子交換和吸附作用進行固定化。固定化載體主要包括硅膠、功能化納米孔活性炭、疏水樹脂、聚乙烯醇/硼酸/淀粉/碳酸鈣、高嶺土/海藻酸鈉和硅藻土等。紅色沙雷氏菌來源的嗜熱脂肪酶通過與聚乙烯醇/硼酸/淀粉/碳酸鈣固定化后固定化酶最佳溫度從40 ℃上升到65 ℃，并經過10次催化反應重復后，酶活力依然保持80%，固定化技術顯著提高了酶的嗜熱性和穩(wěn)定性[48]。土桿菌來源的酶用物理吸附的方式固定在硅膠上，獲得最高的活力回收率(74.7%)，但經催化反應4次重復后，酶活力僅剩余40.8%[47]。這是由于酶分子與載體的結合不夠緊密，反應過程中酶分子容易從載體脫落而損失，造成操作穩(wěn)定性低。藍銅綠假單胞菌來源的酶與戊二醛交聯(lián)固定化后，固定化酶呈現(xiàn)較好的酶活力回收率(68.7%)和操作穩(wěn)定性，經過10個循環(huán)的催化反應后，酶活仍剩余90%[49]。嗜熱芽孢桿菌BTL2通過疏水性樹脂固定化并經過10次重復催化后，酶活力仍然保持100%[46]。因此，通過選擇合適的固定化載體，運用合適的固定化技術，可以獲得操作穩(wěn)定性高以及比活力高的固定化酶。固定化嗜熱脂肪酶提高了酶的操作穩(wěn)定性，可在催化反應中重復使用性，這是實現(xiàn)酶工業(yè)化應用的主要途徑。

5 展望

近年來嗜熱脂肪酶在工業(yè)中的應用越來越廣泛，野生菌來源的嗜熱脂肪酶在表達量、熱穩(wěn)定性與催化效率等方面難于滿足工業(yè)化需求。通過構建基因工程菌異源表達和酶分子結構改造等分子生物技術進行改良，可以提高酶表達水平和熱穩(wěn)定性。酶的改造技術已成為生物工程研究的熱點，然而使用單一方法改造后往往達不到理想的效果。國內外越來越多的研究表明，異源表達系統(tǒng)、定點突變位點、純化與固定化方式等方法對脂肪酶活力和熱穩(wěn)定性等都有影響。因此，謹慎地選擇最優(yōu)的組合方案尤為重要。為獲得理想高產的嗜熱脂肪酶，未來的方向應進行多方面綜合考慮并結合多種方法進行研究，使嗜熱脂肪酶在工業(yè)化應用中具有更好的發(fā)展前景。