牛沁雅，孟令緣，張艷，李珊珊，施春雷，史賢明，楊保偉

(1.西北農(nóng)林科技大學食品科學與工程學院，陜西楊凌712100；2.富平縣檢驗檢測中心（陜西省羊乳產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心），陜西富平711700；3.上海交通大學農(nóng)業(yè)與生物學院，上海200240)

0 引 言

阪崎克羅諾桿菌（C ronobacter sakazakii,C.Sakazakii），是一種無芽孢的革蘭氏陰性桿菌，可引起新生兒腦膜炎、敗血癥和腸炎。據(jù)報道，阪崎克羅諾桿菌感染早產(chǎn)嬰兒造成的死亡率可達到40%～80%[1-9]。雖然前期研究已在嬰幼兒配方乳粉、飲料、奶酪、雞蛋、魚、禽肉、蝦、米飯、餃子、嬰幼兒食品輔料和一些零售食品等中間檢出阪崎克羅諾桿菌，但嬰幼兒配方乳粉（Pow dered In fant Form u la,PIF）被認為是該菌最主要、最常見的傳播源及載體[10-17]。

生產(chǎn)過程中PIF可能會被阪崎克羅諾桿菌污染，但細胞數(shù)一般較少。同時由于PIF中水分活度很低，阪崎克羅諾桿菌即使存在也無法生長繁殖。然而，沖調(diào)的復溶配方乳粉（R econstituted Pow dered In fant Form ula,RPIF）卻是該菌生長繁殖的良好營養(yǎng)基質(zhì)。日常生活中，很多情況下嬰幼兒不能一次性進食完沖調(diào)的RPIF，在一些嬰幼兒護理中心、醫(yī)院甚至家庭中，醫(yī)護人員無法做到及時清洗奶瓶，若奶瓶貯藏溫度不適，原本存在于PIF中的少量阪崎克羅諾桿菌則可能在RPIF中快速生長繁殖，從而交叉污染或直接污染再次沖調(diào)的RPIF，導致食源性疾病爆發(fā)[18-21]。

阪崎克羅諾桿菌在RPIF中的遲滯期、剩余RPIF或奶瓶的儲藏溫度、污染菌的細胞數(shù)量是影響其在RPIF中生長繁殖的決定性因素[22]。為防止食用受到阪崎克羅諾桿菌污染的RPIF，本研究探討了幾個關鍵的培養(yǎng)參數(shù)對4、15、25、37℃（分別代表剩余RPIF和奶瓶在冰箱及不同季節(jié)室溫儲存的溫度）下RPIF中阪崎克羅諾桿菌生長的影響，預測阪崎克羅諾桿菌在RPIF中的生長規(guī)律，以便為有效減少醫(yī)院及家庭環(huán)境中相關病原菌的污染風險提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

菌株C ronobacter sakazakii ATCC BAA 894，由中國食品藥品檢定研究院提供，用于生長曲線測定以及初級、二級模型建立。

1.1.2 試劑

Luria-Bertani Agar（LB）和 Brian Heart In fusion（BH I）培養(yǎng)基購自北京陸橋技術有限責任公司；嬰幼兒配方乳粉由市場購買生產(chǎn)日期為同批次的某品牌金裝幼兒配方粉。

1.1.3 儀器與設備

LAC-5080S高壓滅菌鍋，上海博訊；SW-CJ-1CU超凈工作臺，蘇州泰安；NU-425-400E生物安全柜，美國；微量移液槍，德國Effendorf；MIR-253-20℃超低溫冰箱，日本三洋；MDF-3286S-80℃超低溫冰箱，日本三洋；Q L-86旋渦振蕩器，其林貝爾；GNP-9080隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海精宏；XS204百分之一天平，梅特勒；78-1磁力攪拌器，常州國華；DK-98-Ⅱ電熱恒溫水浴箱，天津泰斯特；BCD-205TA 4℃冰箱，青島海爾；ZHWY-211B搖恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海智誠；DHG-9123A電熱恒溫鼓風干燥箱，上海精宏。

1.2 方法

1.2.1 菌株培養(yǎng)與菌落計數(shù)

將-80℃保存的菌液劃線于LB平板，37℃培養(yǎng)18～24 h，挑取一單菌落接種于200 m L BH I肉湯培養(yǎng)基，37℃、100 r/min搖床培養(yǎng)18～24 h。

通過菌落計數(shù)法確定BH I培養(yǎng)基中阪崎克羅諾桿菌的初始濃度[23]。吸取1 m L的BH I培養(yǎng)物加入9 m L的生理鹽水中進行10倍梯度稀釋，選擇2～3個適宜的稀釋度，取1 m L稀釋液涂布于LB平板，每個稀釋度設3個平行，37℃培養(yǎng)24 h，選取菌落數(shù)在30～300之間、無蔓延菌落生長的平板計數(shù)，最終濃度以每毫升菌液的菌落形成單位（Co lony Forming Unit,CFU）平均值表示。

1.2.2 RPIF制備

根據(jù)奶粉外包裝袋上的使用說明沖調(diào)乳粉溶液。稱取30 g乳粉于120 m L滅菌水中，攪拌直至完全溶解。復溶乳粉分裝至50 m L離心管中，每管10m L，121℃滅菌20 min，冷卻備用。

1.2.3 阪崎克羅諾桿菌生長曲線測定

將0.1 m L菌液接入分裝好的無菌RPIF中，接種菌液的終濃度控制在103～104CFU/m L。RPIF分別置于4、15、25、37℃條件下培養(yǎng)，測定不同培養(yǎng)時間下阪崎克羅諾桿菌的活菌數(shù)。以培養(yǎng)時間為橫坐標，活細胞數(shù)為縱坐標，繪制生長曲線。

1.2.4 初級模型建立

選取Gom pertz方程和Logistic方程2種初級模型預測菌株生長規(guī)律。

Gom pertz方程為公式（1）

該方程用于計算阪崎克羅諾桿菌在測試溫度下的遲滯時間λ（h），最大生長速率μm（h-1），培養(yǎng)時間無限增加時細菌數(shù)量的增量（A）[24-25]。

Logistic方程為公式（2）：

式中，C為活菌總數(shù)（CFU/m L），Cmax為最大活菌總數(shù)。

1.2.5 二級模型建立

根據(jù)細胞活菌數(shù)量化溫度對生長速率及遲滯時間的影響，模擬構建生長模型。以修正的Gom pertz方程作為主要生長模型，得出與生長相關關鍵參數(shù)[24]。二次模型構建時，用R atkow sky平方根模型[26]和二次R osso模型[27]評估不同溫度下阪崎克羅諾桿菌的最大生長速率。使用R atkow sky模型和雙曲線方程反算結果的對數(shù)與遲滯期的數(shù)據(jù)進行擬合[28]。

為了評估貯藏溫度對RPIF中阪崎克羅諾桿菌生長的影響，研究采用平方根模型擬合溫度與最大生長速率μmax，使用預測值和試驗值之間的殘差以及比較用的溫度預測模型進行驗證。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

采用Curve Expert1.4軟件對生長曲線進行分析，利用Microsoft excel 2010建立二級預測模型，采用平方根模型擬合菌株最大生長速率μmax，評價貯藏溫度對RPIF中阪崎克羅諾桿菌生長的影響。

2 結 果

2.1 RPIF中阪崎克羅諾桿菌生長曲線

阪崎克羅諾桿菌ATCC BAA894在RPIF中4℃培養(yǎng)72 h后的生長曲線不符合S型，見圖1a，表1。在15、25、37℃下培養(yǎng)后，采用Gom pertz、Logistic模型進行擬合，見表1，表2。各擬合方程的標準差和相關系數(shù)表明，與Logistic模型相比，Gom pertz方程擬合的一級生長模型較好。

圖1 不同溫度下阪崎克羅諾桿菌的生長曲線

表1 RPIF中阪崎克羅諾桿菌在4、15、25、37℃下的生長 log(CFU·m L-1)

表2 RPIF中阪崎克羅諾桿菌在15、25、37℃下的參數(shù)及Gompertz模型

Gom pertz模型顯示，在15、25、37℃培養(yǎng)時，RPIF中阪崎克羅諾桿菌的生長規(guī)律遵循單細胞微生物典型的S型生長曲線，見圖1b、c、d。在一定培養(yǎng)溫度范圍內(nèi)，溫度越高，阪崎克羅諾桿菌生長繁殖越快，到達最大生長速率所需時間t1、到達穩(wěn)定期所需時間t2及遲滯時間λ越短，最大生長速率μm越高，見表3。

2.2 溫度對RPIF中阪崎克羅諾桿菌生長的影響

繪制R atkow sky平方根模型可反應最大生長速率的平方根與溫度間的關系。其形式為：b(T-Tmin)，b為系數(shù)，Tmin為理論最低生長溫度，即回歸線延長線與溫度軸相交所得的溫度。結果表明，溫度升高，最大生長速率的平方根同步增加，見圖2。最優(yōu)擬合的二級模型中的參數(shù)見表4，具體方程如下：

對阪崎克羅諾桿菌生長速率模型的準確性驗證后，殘差檢驗結果表明RPIF中阪崎克羅諾桿菌生長速率殘差均在±0.05之間，即預測模型在α=0.05水平可信，見圖3。實測值與預測值對比檢驗結果表明，阪崎克羅諾桿菌生長速率實測值與預測值較為接近，預測結果可靠，見圖4。使用準確性因子與偏差性因子對預測值和實測值分析后，所得偏差性因子的值為1.0096，準確性因子的值為0.9905，均符合模型可接受條件的要求，即該模型可較好反映沖調(diào)奶粉中阪崎腸桿菌在不同溫度下生長速率的高低，見表5。研究獲得的方程式可以用來預測RPIF中阪崎克羅諾桿菌的生長，以避免食用PIF的感染風險。

表3 RPIF中阪崎克羅諾桿菌在15、25、37℃下Gompertz模型參數(shù)

圖2 溫度對RPIF中阪崎克羅諾桿菌生長影響的平方根模型

表4 RPIF中阪崎克羅諾桿菌的平方根模型參數(shù)

圖3 RPIF中阪崎克羅諾桿菌生長速率殘差

圖4 RPIF中阪崎克羅諾桿菌在15、25、37℃下生長速率的實際值與預測值比較

表5 阪崎克羅諾桿菌生長速率實測值與預測值分析

3 討 論

RPIF是阪崎克羅諾桿菌生長的良好物質(zhì)，因此應在PIF加工和食用過程中嚴格控制和預防該致病菌[2,29]。日常生活中，有些嬰幼兒在飲用RPIF時并不能一次性飲用完，家長可能會將其放置于4℃冰箱或室溫保存，以供嬰幼兒再次飲用。還有些情況下，嬰幼兒飲用完畢的奶瓶并沒有及時清洗，而是放置于室溫，這剛好是PIF中可能存在的少量阪崎克羅諾桿菌大量生長繁殖的良好條件，結果導致嚴重的食品安全問題。本研究探討了RPIF中阪崎克羅諾桿菌在4、15、25、37℃下的生長情況，以此模擬RPIF或奶瓶貯存于冰箱及室溫的環(huán)境溫度，預測、評估未飲用完的RPIF和未立即清洗的空奶瓶的安全性。

阪崎克羅諾桿菌在RPIF中生長一級模型的建立一定程度反映了該菌的生長規(guī)律。Fakruddin等[30]采用Gom pertz模型對10.0～40.0℃下RPIF中阪崎克羅諾桿菌的生長進行擬合，經(jīng)評價后發(fā)現(xiàn)Gom pertz模型擬合效果好，適合描述不同溫度下阪崎克羅諾桿菌的生長。邱紅玲[31]等研究者也指出修正的Gom pertz能較好地擬合復原乳中3種致病菌在4～42℃或者25～42℃條件下的生長動力學參數(shù)。與以上研究結果相似，本研究顯示采用Gom pertz、Logistic模型進行擬合，各擬合方程的標準差和相關系數(shù)表明Gom pertz方程擬合的一級生長模型更好。

RPIF中的阪崎克羅諾桿菌開始生長的遲滯期長短不僅取決于環(huán)境，還取決于其處于何種生長階段[32]。根據(jù)對生長數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學分析，我們發(fā)現(xiàn)，雖然在RPIF中接種穩(wěn)定期的阪崎克羅諾桿菌，但15、25、37℃下其生長曲線均呈現(xiàn)S型且遲滯期較短。Kandhai等研究者對RPIF中不同生長階段的阪崎克羅諾桿菌的生長曲線進行Gom pertz模型擬合，研究表明預培養(yǎng)條件不會影響RPIF中阪崎克羅諾桿菌的生長速率或遲滯期，并且遲滯期通常很短[33]。另一研究顯示，盡管在10℃儲藏RPIF可以觀察到明顯的遲滯期，但升高溫度至25、37、45℃并不能觀察到明顯的遲滯期[34]。與預培養(yǎng)時間和溫度對生長速率和遲滯期的影響相似，其他結果表明，接種量（即高或低接種量）和RPIF組成對阪崎克羅諾桿菌的生長也沒有影響[2]，這可能由于RPIF營養(yǎng)豐富，阪崎克羅諾桿菌較短時間可內(nèi)適應生長環(huán)境。以上結果表明，如果未正確保存剩余的RPIF或未及時清洗奶瓶，將有可能感染阪崎克羅諾桿菌，并對嬰幼兒構成巨大的潛在危害。

溫度是影響RPIF中阪崎克羅諾桿菌的生長的因素之一。本研究通過建立二級模型并對阪崎克羅諾桿菌的生長速率和相關參數(shù)進行了殘差檢驗、實測值與預測值對比檢驗以及準確性因子與偏差性因子檢驗，其中準確性因子可用于衡量預測值和實測值之間的接近程度，越接近1表示模型準確性越高，Braun等[35]認為準確性因子值在1.1～1.9之間，模型均可接受。G iffel等[36]認為偏差性因子值在0.75～1.25之間，模型可被接受，R oss等[37]認為偏差性因子值在0.9～1.05之間，模型可靠性較高。研究結果表明二級模型預測結果可靠，隨著溫度升高，RPIF中的阪崎克羅諾桿菌最大生長速率也會增加。Fang等通過生長動力學模型的建立及比較發(fā)現(xiàn)，在RPIF中，未經(jīng)熱處理的菌株生長溫度范圍為6.5～51.4℃，熱處理菌株的生長溫度范圍為6.9～50.1℃，未經(jīng)熱處理和熱損傷的菌株的生長速率無顯著差異[38]。Kandhai等研究發(fā)現(xiàn)57株阪崎克羅諾桿菌中有50株在47℃下可以生長，但在4℃下均無生長，腦心浸肉湯（BH I）中阪崎克羅諾桿菌的最低生長溫度為5.5～8℃[33,39]。與早期研究結果相似，本研究發(fā)現(xiàn)RPIF中阪崎克羅諾桿菌在4℃下可存活72 h且菌量穩(wěn)定，這一溫度相當于部分地區(qū)冬季的室外溫度，也相當于冰箱儲存溫度。結果顯示，如果剩余RPIF儲存在冰箱或更低溫度下，不會被阪崎克羅諾桿菌或低濃度阪崎克羅諾桿菌污染，無法造成感染，則剩余的RPIF仍可以飲用。

阪崎腸桿菌是一種條件性致病菌，對特殊人群的致死率甚至高達40%～80%。2003年Pagotto等首次研究指出，腹腔注射阪崎克羅諾桿菌劑量為×108CFU/m L的RPIF時，對乳鼠具有致死作用[40]。2012年徐桂香等研究表明，將×108CFU/m L的野生阪崎克羅諾桿菌腹腔注射出生三日的SD乳鼠，平均致死時間為6.5 h，且記錄了不同注射劑量實驗動物組死亡情況，結果顯示野生阪崎克羅諾桿菌的半致死劑量為3.162×106CFU[41]。由于關于阪崎克羅諾桿菌對人致病的安全限量和相關毒力因子的信息有限，因此，所有的阪崎克羅諾桿菌都被視為潛在的病原體。本研究的結果可以預測4個季節(jié)不同溫度下，阪崎克羅諾桿菌RPIF中的生長情況，有助于建立有效的食品安全控制措施。