林琳

（江蘇康正生物科技有限公司，江蘇高郵225600）

0 引 言

喹乙醇(O laquindox)又稱喹酰胺醇，屬喹噁啉類化合物，對人體有致突變和致癌的作用[1-3]。中國自2019年5月1日起停止使用喹乙醇獸藥的原料藥及各種制劑[4-5]。而3-甲基-喹喔啉-2-羧酸（3-m ethyl-quinoxaline-2-carboxy,MQCA）作為喹乙醇的主要代謝產(chǎn)物之一[6]，在體內(nèi)殘留量相對穩(wěn)定。

目前對喹乙醇及其代謝物常用的檢測方法有高效液相色譜法和高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[7-12]。高效液相色譜法前處理復(fù)雜，容易產(chǎn)生假陽性；而高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法可以在降低檢出限的同時(shí)避免假陽性的產(chǎn)生。喹乙醇及代謝物的前處理一般有酶解法和酸解法[13-17]，但是兩者的效果都不太理想。本試驗(yàn)擬建立堿水解提取，固相萃取法凈化和液相串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用的檢測方法，為快速檢測和監(jiān)管乳制品中喹乙醇及其代謝物殘留提供技術(shù)保障和參考。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 儀器與試劑

Agilent1120型高效液相色譜儀，美國Agilent公司；API 3500 Q T rap超高壓液相色譜-三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，美國AB公司。

喹乙醇和MQCA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)購于中國計(jì)量科學(xué)研究院。

1.2 樣品來源

樣品均為隨機(jī)的市售乳制品。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱型號：Waters ACQU ITY UPLC BEH C18柱色譜柱(2.1 mm×50 mm，1.7μm)；色譜柱溫度為35℃；進(jìn)樣量為5μL；流速為0.30 m L/min;流動相A為0.1%氨水溶液，B為乙腈；洗脫條件如表1所示。

表1 HPLC-MS/MS梯度洗脫條件

1.3.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源為正離子電離(ESI+)；監(jiān)測模式為多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)；離子源溫度為105℃；毛細(xì)管電壓為3.0 kV；脫溶劑氣流量為10 L/min；錐孔流量為0.5 L/min；去溶劑溫度為400℃。

1.3.3 樣品的提取與凈化

稱取5 g(精確至0.01 g)乳制品樣品至50 m L離心管中，加入25 m L濃度為2 m oL/L的N aOH溶液，混合均勻，50℃水浴條件下水解60min。然后再加入HC l溶液將水解液調(diào)至pH值7.0后,轉(zhuǎn)速為5 000 r/min離心5 min。取上清液加入固相萃取柱，分別用6 m L甲醇和水依次活化后上樣，首先棄去流出液，然后用6 m L水洗滌，棄去流出液，用3 m L質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的氨水甲醇溶液洗脫，收集洗脫液并于40℃氮?dú)獯蹈?。殘余樣品?.0 m L流動相溶解混勻，用0.22μm有機(jī)濾膜過濾，供液相串聯(lián)質(zhì)譜檢測。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

分別稱量10 m g喹乙醇和MQCA標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇配制成1 m g/m L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，再稀釋成質(zhì)量濃度均為1μg/m L中間標(biāo)準(zhǔn)溶液。臨用前，將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%甲酸水溶液配制成質(zhì)量濃度為0.1～50 ng/m L的系列標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.5 方法的精密度、重復(fù)性與回收率

以未檢出喹乙醇和MQCA的乳制品為空白基質(zhì)，加入3個(gè)梯度的混合標(biāo)液，堿水解提取后使用固相萃取柱凈化和富集后，上機(jī)檢測計(jì)算回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜柱的選擇

由于喹乙醇和MQCA為極性一般的弱酸性化合物[18]，實(shí)驗(yàn)考察了Waters ACQU ITY UPLC BEH C18柱色譜柱(2.1 mm×50 mm，1.7μm)和Waters A talantis T3（2.1×50 mm，3μm）這2款不同的色譜柱對其分離效果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩種目標(biāo)物在C18柱上有好的保留效果好，喹乙醇和MQCA的峰形得到改善，與基質(zhì)中的雜質(zhì)也有較好的分離度，峰型尖銳，整個(gè)分離過程可以在5 min內(nèi)完成。

2.2 流動相體系的選擇

流動相的組成會影響目標(biāo)化合物的分離和離子化效率，從而影響到目標(biāo)化合物的靈敏度。在流動相選擇中，比較了純甲醇、純乙腈、甲醇-0.1%甲酸、乙腈-0.10%甲酸、甲醇-0.1%氨水、乙腈-0.1%氨水作為流動相條件下喹乙醇和MQCA檢測靈敏度及出峰情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，流動相體系中含有乙腈會改善起到目標(biāo)物峰形的作用，乙腈-0.10%甲酸及乙腈-0.1%氨水均能分離測定喹乙醇和MQCA。但乙腈-0.10%甲酸流動相體系下，喹乙醇響應(yīng)低且MQCA峰形拖尾展寬嚴(yán)重；乙腈-0.1%氨水體系下，兩個(gè)目標(biāo)物均有較高響應(yīng)，峰形窄，且分離時(shí)間縮短，在3 min內(nèi)就能完成分離，如圖1所示，所以本試驗(yàn)選擇流動相體系為乙腈-0.1%氨水（梯度洗脫）。

圖1 兩種流動相下的TIC圖

2.3 質(zhì)譜條件的選擇

用質(zhì)量濃度為50 ng/m L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，對目標(biāo)物進(jìn)行一級和二級質(zhì)譜掃描，并優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)。兩種目標(biāo)物的質(zhì)譜分析參數(shù)如表2所示，包括目標(biāo)物的母離子精確質(zhì)量數(shù)，碎片離子的精確質(zhì)量數(shù)以及去簇電壓和碰撞電壓參數(shù)。

表2 各化合物質(zhì)譜參數(shù)

2.4 方法的線性范圍與靈敏度

在乙腈-0.20%甲酸流動相體系中，以表1梯度洗脫的步驟，按1.3.4實(shí)驗(yàn)步驟配制MQCA的標(biāo)準(zhǔn)溶液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明：喹乙醇和MQCA在質(zhì)量濃度為0.1～50.0 ng/m L內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系，結(jié)果如表3所示。

表3 2種目標(biāo)物的出峰時(shí)間、標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)、檢出限與定量限

2.5 前處理方式的優(yōu)

2.5.1 樣品水解方式的選擇

水解方式一般為酶水解、酸水解、堿水解3種[19-20]，酶水解過程十分溫和，需在50℃振蕩水浴中反應(yīng)24 h，酶解過程耗時(shí)長且步驟繁瑣；酸水解反應(yīng)相對較溫和，所以對于乳制品等樣品，其水解效率不高。因?yàn)猷掖己蚆QCA與樣品基質(zhì)主要是共價(jià)結(jié)合，采用酶解和酸解的方式并不能完全將喹乙醇和MQCA從樣品基質(zhì)中解離出來。強(qiáng)堿水解相對于酶解和酸解效果更好，反應(yīng)通常較為劇烈，能在短時(shí)間內(nèi)有效水解樣品中的蛋白質(zhì)并將喹乙醇和MQCA從基質(zhì)中解離出來。試驗(yàn)通過改變堿水解時(shí)間以及N aOH堿溶液的濃度，通過水解液狀況評價(jià)水解效果。選擇水解時(shí)間分別為20，40，60，80，100，120min，N aOH溶液濃度分別采用 0.2，0.5，1.0，2.0，5.0，10.0 m oL/L，在60℃條件下對樣品進(jìn)行水解。通過對比發(fā)現(xiàn)，N aOH濃度太低，水解過程耗時(shí)長；N aOH濃度越高水解液相反會變得濃稠，不適合后續(xù)的提取凈化過程。選用2.0 m oL/L N aOH溶液水解60 min時(shí)，基質(zhì)樣品被完全水解，MQCA從樣品中被完全釋放出來，沒有殘?jiān)Ｓ?。因此，選擇該條件進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.5.2 SPE柱的選擇

由于喹乙醇及MQCA的化學(xué)結(jié)構(gòu)中具有喹喔啉-1,4-二氮氧結(jié)構(gòu)，其在弱堿或者酸性條件下能離子化成為分子，實(shí)驗(yàn)對比了已經(jīng)商品化了的H LB、PAX以及MAX 3款固相萃取小柱的做凈化效果對比，記錄下目標(biāo)物峰面積，分析不同類型的SPE柱對喹乙醇及MQCA提取的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 喹乙醇及MQCA經(jīng)不同SPE柱處理后的回收率

由圖2可知，MAX小柱回收率最好，兩個(gè)目標(biāo)組分的回收率最高，且不同類型SPE柱間目標(biāo)組分的回收率差異顯著(P＜0.05），因此選擇MAX小柱進(jìn)行固相萃取凈化。且對60 m g/3 m L和150 m g/6 m L兩種規(guī)格的MAX小柱進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)對喹乙醇及MQCA都有非常好的保留，回收率沒有明顯差異，從節(jié)省成本的角度考慮，60m g/3 m L小柱更為合適。

2.6 方法的精密度、重復(fù)性與回收率

在加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)中，分別選用滅菌乳和乳粉基質(zhì)2種動物源性基質(zhì)的樣品，分別添加2倍限量、5倍限量和10倍限量低、中、高的3個(gè)水平混合標(biāo)準(zhǔn)品，每個(gè)結(jié)果測定5次，進(jìn)行加標(biāo)回收的試驗(yàn)。

表4 方法的回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=5)

由表4可見，在兩種不同的種類基質(zhì)樣品中，喹乙醇及MQCA的回收率為81.6%～97.1%，精密度為2.15%～5.67%，說明本實(shí)驗(yàn)的檢測數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確度和精密度可行。

3 結(jié) 論

本文通過在堿性環(huán)境下水解提取樣品中的喹乙醇及MQCA，經(jīng)60 m g/3 m L的MAX固相萃取小柱凈化處理后，建立了一種快速、準(zhǔn)確檢測喹乙醇及其代謝物MQCA在乳制品中殘留量的SPE-HPLC-MS/MS方法。在滅菌乳基質(zhì)和乳粉基質(zhì)樣品基質(zhì)中的加標(biāo)回收率為81.6%～97.1%，對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.15%～5.67%(n=5)。該方法具有可靠的準(zhǔn)確度和精密度，能準(zhǔn)確快速有效地檢測乳制品中的喹乙醇及MQCA的殘留量，可為該方面的分析和監(jiān)控提供技術(shù)支持。