沈春華 廈門古龍食品有限公司技術(shù)中心實(shí)驗(yàn)室 福建廈門 361000

肉類作為食品加工行業(yè)的一大類原料，隨著食品安全問(wèn)題備受社會(huì)日益關(guān)注的同時(shí)，肉類原料是否安全可靠，已引起了國(guó)內(nèi)食品安全監(jiān)管機(jī)構(gòu)甚至國(guó)際食品法典委員會(huì)(CAC)的高度重視[1]。在畜禽養(yǎng)殖環(huán)節(jié)，為了預(yù)防和治療畜禽的感染性疾病，給畜禽注射藥物甚至添加到喂養(yǎng)的飼料中已成為了一個(gè)普遍的現(xiàn)象。而磺胺類(sulfonamides)和喹諾酮類(quinolones)作為廣譜抗菌藥由于具有高效、穩(wěn)定、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)常常被大量運(yùn)用。這就造成了畜禽肉類原料存在著獸藥殘留超標(biāo)的風(fēng)險(xiǎn)。于是動(dòng)物源性食品中的獸藥殘留引起了國(guó)內(nèi)外的關(guān)注，控制獸藥殘留最主要的措施是加強(qiáng)監(jiān)控和檢測(cè)。我國(guó)對(duì)動(dòng)物源性食品中，單個(gè)磺胺類藥物或磺胺類藥物總量的最大殘留限量(MRL)為100 μg/kg[1],喹諾酮類的最高殘留限量為10～400μg/kg[2]。

因此從源頭上管控獸藥殘留是保證食品安全的一大措施。于是尋找高效、準(zhǔn)確、快速地檢測(cè)肉類原料中獸藥殘留的方法，成為了檢測(cè)工作者不斷努力的目標(biāo)。目前，檢測(cè)動(dòng)物源性食品中喹諾酮類和磺胺類的方法主要有毛細(xì)管電泳法[3]、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法[4]、高效液相色譜法[5]以及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[6]等。相比其它方法，高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法靈敏度高，準(zhǔn)確性好，并且能突破現(xiàn)行有效檢測(cè)方法分類檢測(cè)的局限，實(shí)現(xiàn)多種類獸藥殘留的高通量檢測(cè)。

本研究運(yùn)用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)建立了一個(gè)快速、簡(jiǎn)便的方法，這個(gè)方法能同時(shí)檢測(cè)肉類原料中磺胺類(磺胺間二甲氧嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲氧噠嗪、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺二甲異噁唑、磺胺甲基異噁唑、磺胺嘧啶)和喹諾酮類(恩諾沙星)8種藥物的殘留量。此方法的靈敏度和精密度等參數(shù)，均能滿足實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范中檢測(cè)方法確認(rèn)的技術(shù)要求。

1 材料與方法

1.1 樣品和試劑

實(shí)驗(yàn)用樣品采用的是凍豬肉原料，由廈門古龍食品有限公司提供。

7種磺胺類標(biāo)準(zhǔn)品(磺胺二甲嘧啶sulfamethazine、磺胺間二甲氧嘧啶sulfadimethoxine、磺胺間甲氧嘧啶sulfamonomethoxine、磺胺甲基異噁唑sulfamethoxazole、磺胺嘧啶sulfadiazine、磺胺二甲異噁唑sulfisoxazole、磺胺甲氧噠嗪sulfamethoxypyridazine)和1種喹諾酮類標(biāo)準(zhǔn)品(恩諾沙星enrofloxacin)，純度均大于99%，德國(guó)Dr Ehrenstorfer GmbH公司。

主要試劑：乙腈、甲酸、正己烷均為色譜純，購(gòu)置于上海安譜實(shí)驗(yàn)科技有限公司；無(wú)水硫酸鈉為分析純，購(gòu)置于西隴化工股份有限公司；實(shí)驗(yàn)用水為一級(jí)水。

1.2 儀器設(shè)備

1.2.1 LC-MS/MS聯(lián)用設(shè)備

高效液相色譜儀Agilent1200，美國(guó)安捷倫公司；

串聯(lián)質(zhì)譜儀API4000，配有電噴霧離子源，美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司。

1.2.2 其它儀器設(shè)備

其它儀器設(shè)備詳見表1。

表1 其他儀器設(shè)備一覽表

1.3 分析方法步驟

1.3.1 樣品的預(yù)處理

將肉類樣品用攪拌機(jī)攪拌均勻，用樣品袋裝好，貼上標(biāo)簽，置于冰箱待測(cè)。

1.3.2 樣品處理

準(zhǔn)確稱取1g肉類樣品于50mL具塞離心管中，加入10mL 1%甲酸-乙腈，3g無(wú)水硫酸鈉，均質(zhì)30s，旋渦振蕩后8 000r/min離心5min,將上清液轉(zhuǎn)移至20mL試管中，離心管再加入5mL 1%甲酸-乙腈，重復(fù)提取一次，合并提取液，在45℃下用氮?dú)獯蹈桑尤?mL(乙腈∶0.1%甲酸水=2∶8)旋渦振蕩溶解殘?jiān)?，?mL正己烷脫脂2次，以15 000r/min離心3min，吸取下層清液經(jīng)0.2μm有機(jī)濾膜過(guò)濾，轉(zhuǎn)移至樣品瓶中，待HPLC-MS/MS測(cè)定。

1.3.3 基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作液配制

稱取適量陰性樣品若干份，置于50mL具塞離心管中，按上述1.3.2方法的步驟操作，制成基質(zhì)溶液。

精確稱取適量各個(gè)藥物標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解，配成濃度均為100μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，-18℃冰箱避光保存。分別準(zhǔn)確吸取適量上述儲(chǔ)備液，置于同一容量瓶中，用甲醇逐級(jí)稀釋成濃度均為0.1μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，4℃下避光保存。再準(zhǔn)確吸取10、50、100、250、500、1 000μL混合標(biāo)準(zhǔn)液分別置于10mL的試管中，在45℃下用氮?dú)獯蹈桑蹈珊笤贉?zhǔn)確加入1mL上述制備的基質(zhì)溶液，配制成1、5、10、25、50、100μg/L基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3.4 回收率和精密度實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取若干份空白陰性肉類樣品于50mL具塞離心管中，分別添加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液旋渦混合，放置過(guò)夜，使標(biāo)準(zhǔn)品在肉類樣品中實(shí)現(xiàn)充分的混合從而達(dá)到交換平衡，然后按上述1.3.2方法的步驟提取、凈化與測(cè)定。設(shè)置5、10、50μg/kg 3個(gè)濃度添加水平計(jì)算回收率，每個(gè)添加水平進(jìn)行6次平行實(shí)驗(yàn)，計(jì)算出相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。

1.3.5 液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜條件

液相色譜條件：色譜柱Agilent ZORBAX SB-C18(5μm 4.6×150mm)；流速0.8mL/min；柱溫35℃;進(jìn)樣量5μL。梯度洗脫程序詳見表2。

表2 液相色譜梯度洗脫條件

串聯(lián)質(zhì)譜條件：電噴霧離子源；正離子掃描；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)；電噴霧電壓IS5000V；離子源溫度TEM450℃；碰撞氣CAD(N2)，6；氣簾氣CUR(N2)，30；GS1，55；GS2，55；駐留時(shí)間為50ms；入口電壓EP10V；監(jiān)測(cè)離子對(duì)、DP和CE詳見表3。

表3 質(zhì)譜參數(shù)

2 結(jié)果與討論

2.1 提取條件的優(yōu)化

本試驗(yàn)采用乙腈、1%乙酸乙腈、1%甲酸乙腈3種溶劑作為提取劑，對(duì)提取效果進(jìn)行比較，結(jié)果表明1%甲酸乙腈的提取率最高，此結(jié)果與有關(guān)報(bào)道一致[7]。

磺胺類和喹諾酮類化合物在酸化條件下溶解度比較大，使用酸化乙腈提取可提高提取率，因此本方法選用1%甲酸乙腈作為提取劑。由于肉類原料都含有一定量的水分，所以實(shí)驗(yàn)過(guò)程中添加無(wú)水硫酸鈉以去除基質(zhì)中的水分，利于氮吹濃縮，同時(shí)硫酸鈉的存在可使蛋白質(zhì)的變性進(jìn)一步的分散，防止樣品凝結(jié)成塊狀影響目標(biāo)物的提取，從而提高回收率。

肉類原料還含有大量的脂肪，提取液中仍存在部分的脂類物質(zhì)，而這8種藥物均不溶于正己烷，故采用正己烷除去脂類物質(zhì)，達(dá)到進(jìn)一步凈化提取液的效果。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

分別準(zhǔn)確稱取8種藥物的標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解，配制成200mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，再用(甲醇∶0.1%甲酸水=1∶1)稀釋配制成1mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

通過(guò)進(jìn)樣泵以20μL的流速進(jìn)1mg/L的混標(biāo)，來(lái)優(yōu)化各個(gè)單標(biāo)的離子對(duì)和其它質(zhì)譜條件。

先通過(guò)Q1掃描，確定化合物的母離子并優(yōu)化母離子的去簇電壓DP。再通過(guò)MS2掃描，找出各個(gè)化合物的待選子離子。

最后通過(guò)MRM掃描優(yōu)化其碰撞能量CE，使得母離子與子離子組成的離子對(duì)強(qiáng)度達(dá)到最大時(shí)為最佳，選擇響應(yīng)值較高、干擾較小的兩對(duì)子離子為定性離子，響應(yīng)值最高的作為定量離子(優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)見表3)。

圖1為8種藥物在優(yōu)化條件下的MRM色譜圖。

圖1 8種藥物的MRM色譜圖

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量限

為了消除基質(zhì)效應(yīng)，減小實(shí)驗(yàn)誤差，本研究采用1.3.3的方法配制基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。以定量離子峰面積和對(duì)應(yīng)的濃度(μg/L)進(jìn)行線性回歸分析，所用的8種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在1～100μg/L范圍內(nèi)線性良好。相關(guān)系數(shù)為0.9956～0.9998，均大于現(xiàn)行有效的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 27404-2008中檢測(cè)方法確認(rèn)對(duì)校準(zhǔn)曲線的技術(shù)要求0.99[8]。以10倍信噪比計(jì)算8種藥物的定量限，如表4所示，均低于或等于國(guó)標(biāo)方法GB/T 20759-2006和GB/T 21312-2007中規(guī)定的定量限[9,10]。

表4 方法精密度(n=6)和加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4 回收率和精密度

按1.3.4的方法進(jìn)行回收率和精密度試驗(yàn)，結(jié)果見表4。在5μg/kg的添加水平下，回收率為75.4%～102%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.8%～9.1%；在10μg/kg的添加水平下，回收率為67.8%～101%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.2%～7.9%；在50μg/kg的添加水平下，回收率為79.4%～115%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.1%～6.5%。均符合實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范GB/T 27404-2008中對(duì)回收率和精密度的技術(shù)要求[8]。

3 總結(jié)

本研究應(yīng)用HPLC-MS/MS法檢測(cè)肉類原料中的兩類8種獸藥殘留，采用基于正離子掃描的MRM監(jiān)測(cè)模式，用保留時(shí)間和離子對(duì)定性，響應(yīng)值高的碎片離子作為定量離子，基質(zhì)匹配外標(biāo)法定量。結(jié)果表明，所測(cè)定的目標(biāo)物分離良好，重現(xiàn)性好，操作步驟簡(jiǎn)便、快捷?；前奉惈F藥殘留的定量限最低可達(dá)1μg/kg，喹諾酮類的恩諾沙星的定量限為3μg/kg，完全能滿足目前國(guó)內(nèi)外對(duì)肉類原料中相應(yīng)藥物最大殘留量的要求。所涉8種藥物在1～100μg/L范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)為0.9956～0.9998，在低、中、高3個(gè)添加水平下，加標(biāo)回收率為67.8%～115%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.2%～9.1%，表明該方法具有良好的準(zhǔn)確性和精密度，在實(shí)際應(yīng)用中，檢測(cè)效果良好，分析時(shí)間較短，可用于肉類原料中多種獸藥殘留的快捷高通量檢測(cè)。