張 林，龐春潔

（馬應(yīng)龍藥業(yè)集團股份有限公司，湖北 武漢 430064）

牛黃是我國的一種傳統(tǒng)名貴中藥材，為牛的膽結(jié)石，藥用價值較高，其功效主要為解毒、息風(fēng)、涼肝、開竅、豁痰、清熱等[1]。牛黃在我國具有較大的需求量，大約有超過600種中成藥是以牛黃為原料制作而成的。然而在牛體內(nèi)，天然牛黃的自然發(fā)生率卻比較低，無法有效滿足中成藥生產(chǎn)以及臨床的實際需求。人工牛黃則是將新鮮的牛膽汁作為原料，配以膽酸、?；撬?、膽紅素、微量元素等加工制作而成的一種牛黃替代品[2]。有研究顯示，人工牛黃其成份與天然牛黃相近，在某些應(yīng)用領(lǐng)域可取代天然牛黃入藥，具有較好的臨床效果。牛黃的主要有效成分之一就是膽紅素，膽紅素含量的水平直接影響牛黃質(zhì)量，也是牛黃的重要評價依據(jù)[3]。本研究選擇液相色譜法測定人工及天然牛黃中膽紅素成分的含量，以檢測兩種牛黃有效成份差異，希望能為新藥開發(fā)提供技術(shù)資料以及試驗依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

選用安捷倫1260型高效液相色譜儀，北京賽多利斯儀器有限公司的1/10000電子分析天平；昆山超聲儀器有限公司的KQ-500DE型超聲波清洗器。

1.2 試藥

牛黃選購山東省藥材公司的天然牛黃以及湖南迪博制藥有限公司的人工牛黃；選用中國藥品生物制品鑒定所的膽紅素對照品；甲醇、三氯甲烷、水分別選擇、色譜純、分析純、二次純化水。

2 方 法

2.1 制備溶液

取適量的膽紅素對照品，放置在棕色量瓶內(nèi)，選擇二甲亞砜將其溶解，制作成每毫升含0.58 mg膽紅素的對照品溶液，該溶液即為儲備液。準確量取10.0 mg牛黃樣品，置在5 ml棕色量瓶內(nèi)，選擇二甲亞砜進行稀釋、定容到刻度，進行10分鐘超聲處理，然后進行5分鐘離心處理，選取上清液過0.22 μm濾膜即可得到供試品溶液。

2.2 色譜條件

選擇Agilent C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；選擇甲醇-三氯甲烷-1%醋酸（65:32:3）作為流動相，檢測波長設(shè)置為455 nm，流速設(shè)置為每分鐘1.0 ml。

2.3 色譜分析

①制備標準曲線：選取2.0 ml對照品儲備液，放置在10 ml棕色量瓶內(nèi)，通過二甲亞砜將其稀釋到刻度。分別選取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 ml該溶液，放置于5 ml棕色量瓶內(nèi)，選擇二甲亞砜稀釋、定容到刻度。3次進樣，對色譜圖進行記錄，對膽紅素平均濃度以及峰面積作線性回歸，獲回歸方程Y=19158X-4859.5，r=0.9998，結(jié)果顯示當膽紅素濃度處于2.29～27.78 μg/ml范圍時，線性關(guān)系比較理想。②精密度試驗：選擇9.27 μg/ml濃度20 μl的膽紅素對照品溶液，重復(fù)6次進樣，對峰面積進行測定；結(jié)果顯示色譜峰面積平均值為215659，RSD為2.57%。顯示進樣精密度比較理想。③穩(wěn)定性試驗：選取放置在避光、常溫條件下的20 μl人工牛黃供試品溶液，在0、1、2、3、4、5、8、10小時進樣，對膽紅素峰面積進行測量，結(jié)果顯示峰面積平均值為252278，RSD=2.32%。分析結(jié)果顯示在避光、常溫條件下放置10小時的穩(wěn)定性比較理想。④重復(fù)性試驗：準確量取6份批號相同的人工牛黃供試品，進樣測定，結(jié)果顯示膽紅素含量平均值為4.73μg/mg，RSD=2.25%，重復(fù)性比較理想。⑤回收率試驗：準確量取9份人工牛黃，并將其分為3組，每組各3分。分別在3組樣品中加入3種高、中、低不同的含量的膽紅素對照品溶液，并將其制作成供試品溶液。準確選取20μl供試品溶液進樣，每一樣品重復(fù)測量3次膽紅素含量，對回收率進行計算。

2.4 測定樣品

選取人工牛黃和天然牛黃，按上述方法將其制作成供試品溶液。準確量取20 μl供試品溶液進樣，重復(fù)測量3次膽紅素含量。

3 結(jié) 果

3.1 回收率計算結(jié)果

高、中、低三種不同的含量的膽紅素加樣回收率分別為98.42%、98.62%、98.48%，具體測定結(jié)果如表1所示。

表1 回收率計算結(jié)果

3.2 樣品測定結(jié)果

經(jīng)3次測定，天然牛黃膽紅素含量為（44.21±0.27）μg/mg，人工牛黃為（4.92±0.24）μg/mg。

4 討 論

本試驗中對甲醇-三氯甲烷-醋酸、甲醇-三氯甲烷-磷酸作為流動相的選擇，進行對比分析，由于磷酸容易析出結(jié)晶，而1%醋酸和0.5%磷酸作為流動相效果類似，故本研究選擇甲醇-三氯甲烷-1%醋酸（65:32:3）作為流動相。由于膽紅素的穩(wěn)定性較差，選擇索氏提取或回流法提取的效果并不理想，所以本研究選擇超聲進行提取。對于提取溶劑選擇上，通過對比試驗發(fā)現(xiàn)，相對于三氯甲烷等提取劑，二甲亞砜的提取率更高，因此本試驗的提取溶劑選擇二甲亞砜。在超聲時間選擇上，分別試驗10分鐘、15分鐘、20分鐘，發(fā)現(xiàn)超聲10分鐘提取率最高。同時由于膽紅素在光照、加溫時易出現(xiàn)不穩(wěn)定性[4]，建議在HPLC測定中選擇棕色量瓶。

分析本研究結(jié)果可發(fā)現(xiàn)，和天然牛黃相比較，人工牛黃膽紅素含量僅為（4.92±0.24）μg/mg，而天然牛黃的膽紅素含量達（44.21±0.27）μg/mg，兩者差異明顯。提示，在選擇人工牛黃入藥時，其用量可以適當增加。

綜上所述，兩種牛黃其有效成份含量存在明顯差異，HPLC法可對人工牛黃以及天然牛黃的有效成分含量進行精確測定，該方法操作簡單方便，準確性高。