李文杰 倪建秀 丁春暉 陳濤 陳桂芳

摘要 [目的]建立超高效液相色譜-串聯質譜（UPLC-MS/MS）同位素內標法同時測定青蝦中磺胺類、氟喹諾酮類、四環(huán)素類、酰胺醇類4大類27種獸藥殘留量的檢測方法。[方法]青蝦樣品經86%（V/V）酸化乙腈（3%甲酸）-水溶液（含0.1 mol/L EDTA）提取后，提取液經分散固相萃取法凈化，以UPLC-MS/MS測定，內標法定量。[結果]27種獸藥在各自線性范圍內呈良好的線性關系（R2≥0.99），磺胺類、氟喹諾酮類、酰胺醇類、四環(huán)素類的定量限分別為2.0、2.0、1.0、50.0 μg/kg，回收率在70.1%～110.0%，相對標準偏差（RSD）在0.2%～9.8%。[結論]該方法前處理簡單、準確、對環(huán)境友好，適用于青蝦中獸藥殘留的高通量快速檢測分析。

關鍵詞 QuEChERS-超高效液相色譜-串聯質譜法;同位素內標法;獸藥殘留;青蝦

中圖分類號 TS254.7? 文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2021）24-0197-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.24.048

Simultaneous Determination of 27 Veterinary Drug Residues in Freshwater Shrimp by QuEChERS-UPLC-MS/MS

LI Wen-jie，NI Jian-xiu，DING Chun-hui et al （Quality Inspection Institute of Agricultural Products of Nanjing，Nanjing，Jiangsu 210036）

Abstract [Objective]To establish an ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS） with isotope-labelled internal standard method，which was used to determine multiclass veterinary drugs residues simultaneously including sulfonamides，fluoroquinolones，tetracyclines and amphenicols in freshwater shrimp.[Method] The samples were extracted with 86% （V/V）acidified acetonitrile（3% formic acid）-water（containing 0.1 mol/L EDTA），then the extract was purified by dispersive solid phase extraction （DPSE）.The samples were determined by UPLC-MS/MS and quantified by internal standard method.[Result]27 kinds of veterinary drugs showed good linear relationship in their respective linear ranges （R2≥0.99）.The limits of quantification of sulfonamides，fluoroquinolones，amide alcohols and tetracyclines were 2.0，2.0，1.0，50.0 μg/kg，respectively.The recovery rates were 70.1%-110.0%.The relative standard deviations were 0.2%-9.8%.[Conclusion]The method is simple，accurate and environment-friendly，which is suitable for high-throughput rapid detection and analysis of veterinary drug residues in freshwater shrimp.

Key words QuEChERS-UPLC-MS/MS;Isotope internal standard method;Veterinary drug residue;Freshwater shrimp

基金項目

2018年度江蘇省第五期“333工程”科研項目（BRA2018121）。

作者簡介 李文杰（1980—）， 男， 江蘇宜興人，高級工程師，碩士，從事農產品質量安全檢測與風險評估研究。通信作者，高級工程師，碩士，從事農產品質量安全檢測工作。

收稿日期 2021-04-29

青蝦，學名日本沼蝦（Macrobrachium nipponense），是南京水產養(yǎng)殖的特色產業(yè)，養(yǎng)殖面積達4 666.67 hm2，產值超10億元，規(guī)模僅次于螃蟹，尤其是2019年開始南京大面積推廣養(yǎng)殖生長速度更快、抗病抗逆能力更強的新品種“太湖2號”，在科技創(chuàng)新、凈化水環(huán)境、富民增收等方面發(fā)揮著重要作用[1]。近年來養(yǎng)殖者反映青蝦出現散發(fā)性死亡[2]，需要合理使用獸藥，防治消化道細菌感染等疾病[3]。因此，獸藥殘留成為青蝦質量安全的一個關注熱點。

目前，國內外動物性產品中獸藥殘留檢測的前處理方法主要有固相萃取法、QuEChERS法、基質固相分散萃取法等[4-6]，檢測方法主要有液相色譜法、液相色譜-串聯質譜法[7-8]，超高效液相色譜-串聯質譜法（UPLC-MS/MS）因具有高靈敏度、高選擇性的優(yōu)勢已被廣泛用于獸藥多殘留分析[9]，因此在青蝦樣品中同時檢測磺胺類12種、氟喹諾酮類8種、酰胺醇類3種、四環(huán)素類4種計27種獸藥多殘留測定具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 儀器與試材

ACQUITY UPLC I-Class超高效液相色譜儀（Waters公司）;QTRAP 5500質譜儀（SCIEX公司）;BP211D電子天平（賽多利斯公司）;KS501振蕩器（IKA公司）;AllegraX-30R臺式高速冷凍離心機（貝克曼公司）;MS3渦旋混合器（IKA公司）;MV5全自動平行濃縮儀（萊伯泰科公司）。27種獸藥標準品和10種同位素內標（德國Dr.Ehrenstorfer公司，純度>99.8%）;乙腈為色譜純（TEDIA公司）;乙酸銨為色譜純（美國Sigma-aldrich公司）;40～63 μm PSA、40～63 μm C18凈化劑、甲酸，均為色譜純，上海安譜實驗科技有限公司;乙二胺四乙酸（EDTA）、無水硫酸鈉，均為分析純，南京化學試劑股份有限公司;實驗室用水為Milli-Q超純水。

青蝦樣品為南京市地產例行監(jiān)測樣品。

1.2 標準溶液配制

1.2.1 獸藥標準儲備液。

1.2.1.1 標準儲備液。分別精密稱取各獸藥標準品適量，用甲醇溶解并定容，配制成質量濃度均為100 μg/mL的標準儲備液，于-20? ℃保存。

1.2.1.2 內標儲備液。分別精密稱取各獸藥內標適量，用甲醇溶解并定容，配制成質量濃度均為100 μg/mL的內標儲備液，于-20? ℃保存。

1.2.2 獸藥混合標準使用液。

1.2.2.1 混合標準使用液。分別吸取適量獸藥標準儲備液（100 μg/mL），用甲醇配制成中間液，再分別吸取2.00 mL磺胺類標準中間液（2.0 μg/mL）、2.00 mL氟喹諾酮類標準中間液（2.0 μg/mL）、4.00 mL酰胺醇類標準中間液（1.0 μg/mL）、10.00 mL四環(huán)素類標準中間液（10 μg/mL）置于50 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，混勻，置于-20? ℃冰箱保存?；前奉?、氟喹諾酮類、酰胺醇類和四環(huán)素類獸藥的質量濃度分別為80、80、40和2 000 μg/L。

1.2.2.2 混合內標使用液。分別吸取5.00 mL磺胺類、氟喹諾酮類、酰胺醇類內標中間液（10 μg/mL）和5.00 mL四環(huán)素類內標儲備液（100 μg/mL）置于50 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，混勻，置于-20? ℃冰箱保存，內標工作液的質量濃度磺胺類、氟喹諾酮類、酰胺醇類均為1.0 μg/L，四環(huán)素類為10.0 μg/L。

1.2.3 獸藥混合標準工作曲線溶液。吸取適量27種獸藥混合標準使用液和混合內標使用液，用初始流動相稀釋，磺胺類和氟喹諾酮類質量濃度為20～400 μg/L，四環(huán)素類質量濃度為50～800 μg/L，酰胺醇類質量濃度為1～200 μg/L，于4 ℃條件保存。

1.3 樣品前處理

1.3.1 采樣和試樣制備。抽取有代表性的青蝦樣品，至少取10尾清洗后[10]，去蝦頭、蝦皮，得到整條蝦肉絞碎混合均勻備用，試樣量為400 g。

1.3.2 提取。

稱取2.00 g試樣于50 mL聚丙烯離心管中，加入10 μL混合內標工作液，加入1.0 mL水和0.4 mL 0.1 mol/L EDTA溶液，混勻1 min后再加入8.6 mL 3%酸化乙腈，于渦旋混合器上混合1 min后振蕩20 min，以4 ℃、10 000 r/min 離心5 min，取上清液。

1.3.3 凈化。

取5.0 mL上清液，加入DSPE混合凈化劑（50 mg PSA+150 mg C18+900 mg無水硫酸鈉），渦旋30 s后，4 000 r/min離心10 mim，取上清液過0.22 μm濾膜，供液相色譜-串聯質譜測定。

1.4 液相色譜-串聯質譜條件

1.4.1 液相色譜條件。色譜柱為ACQUITY UPLC CSH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），前端連接ACQUITY UPLC CSH保護柱（2.1 mm×5 mm，1.7 μm）。流動相A為2 mmol/L乙酸銨+0.1%甲酸水溶液，流動相B為乙腈。梯度洗脫程序為0.1～2.0 min，3%B～15%B;2.0～5.0 min，15%B～22%B;5.0～11.0 min，22%B～25%B;11.0～12.0 min，25%B～30%B;12.0～13.0 min，30%B～35%B;13.0～13.5 min，35%B～80%B;13.5～16.0 min，80%B～90%B;16.0～16.1 min，90%B～3%B;16.1～18.0 min維持3%B。流速0.3 mL/min，進樣量5 μL，流路在1.0～16.0 min進入質譜，在1.0 min之前和16.0 min之后切向廢液，柱溫為40 ℃。

1.4.2 質譜條件。

電噴霧離子源ESI;1.0～2.5、5～16 min進行正離子模式掃描，2.5～5.0 min進行負離子模式掃描（氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、氟苯尼考-D3、氯霉素-D5）;霧化氣壓力為413.7 kPa，氣簾氣壓力為206.8 kPa，輔助加熱氣壓力為344.7 kPa，碰撞氣設置為Medium，以上4種氣體均為氮氣;離子源溫度為600? ℃;正離子化電壓為4 500 V;負離子化電壓為-4 500 V;多反應監(jiān)測（MRM）采集模式;其他參數見表1。

2 結果與分析

2.1 試驗條件的優(yōu)化

2.1.1 提取劑的優(yōu)化。

獸藥多殘留分析所選用的溶劑包括乙腈-水-緩沖液、乙腈-水-酸、甲醇-水-酸等溶劑，甲醇提取時會帶入更多的極性基質干擾物，且蛋白沉淀松散，增加后續(xù)凈化難度[11]。因EDTA是一種良好的螯合劑，不僅能夠有效分散基質，還能競爭性地去除基質中存在的金屬離子，使四環(huán)素和部分氟喹諾酮類化合物游離出來，在EDTA與無機離子螯合釋放出四環(huán)素后，利用一些酸化劑來調節(jié)體系的pH可以更進一步地促進四環(huán)素的提取效率[12]，另外，EDTA的弱電離性也能促進體系的電離平衡，抑制溶液中的酸性離子對磺胺類化合物的沖擊[13]。因酸度過量時，大部分磺胺類待測物都會發(fā)生一定程度的損失，降低提取效率[12-13]。故該試驗選擇先加入1.0 mL水和0.4 mL 0.1 mol/L EDTA溶液，混勻1 min后再加入8.6 mL甲酸乙腈混勻1 min，250 r/min 振蕩20 min提取，4種提取試劑組成見表2，比較不同提取溶劑對獸藥回收率的影響。

通過單因素方差分析，結果顯示，在α=0.05水平上，四環(huán)素類差異顯著，不同提取溶劑回收率見圖1，提取試劑3回收率在70.1%～119.0%，而磺胺類、氟喹諾酮類、酰胺醇類差異不顯著，回收率分別為45.0%～120.0%、40.0%～162.5%、72.0%～109.5%，因此，該方法最終選擇提取試劑3，即86%（V/V）酸化乙腈（3%甲酸）-水溶液（含0.1 mol/L EDTA）。

2.1.2 凈化方法的選擇及條件的優(yōu)化。該研究比較了MAS-Q NANO、DSPE混合凈化劑（PSA+C18+無水硫酸鈉）和Cleanert LipoNo這3種凈化試劑對去除色素和降低基質干擾的效果，結果顯示，采用LipoNo凈化后目標分析物干擾峰較多，且上機液顏色較深，而DSPE混合凈化劑在色素和基質干擾方面效果良好，NANO和LipoNo最佳提取凈化的條件還有待進一步研究。

2.1.3 定性與定量方法的選擇。

在相同的質譜條件下，將樣品質譜圖與基質加標質譜圖進行對照，樣品保留時間與基質加標陽性樣品保留時間相對偏差在5%以內，且檢測的離子相對豐度與濃度相當的校正標準品相對豐度一致?；迮c次強碎片離子豐度比符合相關要求，最終確定樣品中的獸藥殘留。因同位素內標法更適用于測定藥物中微量組分或雜質的含量，且能避免試驗前處理操作中的目標成分丟失造成的定量不準確，降低基質效應，該研究選擇了內標法定量，各目標物定量對應的氘代化合物見表3。

2.2 獸藥基質加標質譜圖 按“1.4”色譜質譜條件，分別對27種獸藥加標樣品進行測定，27種獸藥50 ng/mL基質加標質譜圖如圖2所示。

2.3 方法的線性范圍和檢出限

以標準系列峰面積與內標峰面積之比對其質量濃度進行線性回歸分析，以10倍信噪比計算定量限（LOQ）。結果表明，27種獸藥在各自線性范圍內呈良好的線性關系，且決定系數（R2）大于0.99（表1），磺胺類、氟喹諾酮類、酰胺醇類和四環(huán)素類的LOQ分別為2.0、2.0、1.0和50.0 μg/kg（表4）。

2.4 回收率和精密度

在青蝦空白基質中分別添加3個濃度水平的獸藥混合標準工作液，每個添加濃度重復6次，計算添加回收率和測定結果的相對標準偏差（RSD）。從表4

可以看出，在LOQ、2LOQ、5LOQ 3個加標水平上，磺胺類平均回收率在71.4%～110.0%，RSD在0.2%～9.4%;氟喹諾酮類平均回收率在75.9%～109.8%，RSD在2.0%～9.6%;酰胺醇類平均回收率在84.3%～108.3%，RSD在3.2%～7.7%;四環(huán)素平均回收率在70.1%～109.0%，RSD在0.2%～9.8%;符合化學分析方法驗證確認和內部質量控制要求中關于正確度和精密度的要求[14]。

2.5 實際樣品測定 將該方法應用于檢測40批次青蝦中27種獸藥殘留，結果檢出恩諾沙星樣品3份，殘留量在24.7～70.8 μg/kg;用國家標準方法GB/T 21312—2007[15]測定，結果一致。

3 結論

該研究建立了青蝦中4類共27種獸藥QuEChERS凈化的樣品前處理和UPLC-MS/MS同位素內標法，與國標方法相比，實現了多獸藥殘留同時檢測。采用3個加標水平的獸藥對該方法進行驗證，結果表明，該方法操作簡便、快速、結果穩(wěn)定，能滿足日常檢測工作需要。

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