官宇　余偉　辜運(yùn)富　張宗錦　馮文龍　楊軍偉

摘要：為揭示PGPR菌劑（植物根際促生菌）對(duì)蜈蚣草修復(fù)砷污染土壤的影響機(jī)理，為植物—微生物聯(lián)合修復(fù)砷污染土壤提供技術(shù)支撐，采用盆栽試驗(yàn)將PGPR菌劑加入受砷脅迫的蜈蚣草中進(jìn)行培養(yǎng)，利用變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，簡稱DGGE）技術(shù)對(duì)接種PGPR菌劑的盆栽蜈蚣草根際細(xì)菌多樣性進(jìn)行研究，并分析根際細(xì)菌在重金屬與PGPR菌劑脅迫下的群落結(jié)構(gòu)特征。測定根際土壤中的砷含量、pH值、有機(jī)質(zhì)含量、有效磷含量、速效鉀含量，根據(jù)植株外在發(fā)育情況與內(nèi)在的營養(yǎng)物質(zhì)及對(duì)砷修復(fù)量進(jìn)行比較，得出芽孢桿菌（Bacillus）添加細(xì)桿菌屬（Microbacterium）細(xì)菌對(duì)蜈蚣草生長發(fā)育起到重要影響。典范對(duì)應(yīng)分析（canonical correspondence analysis，簡稱CCA）結(jié)果顯示，pH值、速效氮含量、有效磷含量是影響土壤種群結(jié)構(gòu)、促進(jìn)蜈蚣草吸附砷的重要因素。

關(guān)鍵詞：PGPR菌劑;蜈蚣草;多樣性;砷修復(fù)

中圖分類號(hào)： X172;S182? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2020）19-0275-05

收稿日期：2020-02-26

基金項(xiàng)目：四川省煙草研發(fā)項(xiàng)目計(jì)劃（編號(hào)：20180027）。

作者簡介：官 宇（1983—），男，重慶北碚人，碩士，農(nóng)藝師，研究方向?yàn)闊煵菰耘?。E-mail：18871453@qq.com。

通信作者：余 偉，碩士，農(nóng)藝師，研究方向?yàn)闊煵菰耘?。E-mail：1029443321@qq.com。

隨著經(jīng)濟(jì)全球化的快速發(fā)展，經(jīng)濟(jì)遺留垃圾所帶來的環(huán)境問題逐漸突顯，如木材防腐劑帶來的As-Zn 復(fù)合污染[1]，農(nóng)藥的過度使用造成As-Pb在土壤中的富集[2]。這些殘留重金屬的累積不僅會(huì)對(duì)土壤本身造成污染，影響土壤中的生態(tài)環(huán)境，還會(huì)通過食物鏈進(jìn)入到人體，威脅人類健康[3]。因此，土壤重金屬修復(fù)技術(shù)逐漸受到廣泛的關(guān)注，一般包括以下幾種：固定、穩(wěn)定化技術(shù)和土壤淋洗技術(shù)、原位電動(dòng)修復(fù)技術(shù)、生物修復(fù)技術(shù)等[4-5]。相比植物修復(fù)而言，這些技術(shù)都存在著成本比較高，對(duì)環(huán)境影響程度大等缺點(diǎn)[6]。

近年來，關(guān)于植物修復(fù)重金屬污染土壤的研究越來越多，其中超富集植物的研究是發(fā)展植物修復(fù)技術(shù)的基礎(chǔ)。超富集植物是一種可以在體內(nèi)超量累積重金屬并能將其從土壤中分離的特殊植物[7]。其中，蜈蚣草是首次報(bào)道發(fā)現(xiàn)的一種砷的超富集植物[8]，它具有耐砷特性，對(duì)砷的富集能力極強(qiáng)，最大含砷量是一般植株的數(shù)萬倍甚至數(shù)十萬倍[9]，因此將蜈蚣草用于砷污染土壤的修復(fù)具有很大的研究意義。植物-微生物協(xié)同修復(fù)技術(shù)是目前最有發(fā)展?jié)摿Φ囊环N生物修復(fù)技術(shù)，可充分發(fā)揮植物與微生物的各自優(yōu)勢，取長補(bǔ)短，提高污染土壤修復(fù)效率，杜絕二次污染，利用植物根際促生細(xì)菌（PGPR）菌劑與植物協(xié)同進(jìn)行砷污染土壤修復(fù)是當(dāng)前砷污染土壤生物修復(fù)的研究熱點(diǎn)。

本試驗(yàn)對(duì)前期從蜈蚣草中提取出的植物根際促生細(xì)菌（PGPR）進(jìn)行培養(yǎng)后制成菌劑，并將其接種于蜈蚣草盆栽之中，探究盆栽試驗(yàn)條件下，接種PGPR菌劑對(duì)砷污染土壤中蜈蚣草根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性的影響，并結(jié)合盆栽試驗(yàn)中植株生長狀況、土壤理化性質(zhì)、土壤砷含量的測定結(jié)果，分析PGPR菌劑對(duì)蜈蚣草生長、土壤中砷富集特性的影響，以期篩選出最佳菌劑組合，為植物-微生物聯(lián)合修復(fù)砷污染土壤提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 盆栽試驗(yàn)

本試驗(yàn)于2016—2019年在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)溫江校區(qū)進(jìn)行。從網(wǎng)上選購33株長勢幾乎完全相同的蜈蚣草進(jìn)行1株1盆的盆栽培養(yǎng)，除其中3盆不加菌劑作為空白對(duì)照（CK）之外，其他所有植株均按每3盆為1組加入不同組合的PGPR菌劑，PGPR菌劑直接接種在根圍土壤中，并向每株植株土壤（包括空白對(duì)照）中加入亞砷酸鈉，使砷的含量為150 mg/kg。將所有植株放入光照室內(nèi)進(jìn)行人工培養(yǎng)6個(gè)月。其中，編號(hào)T1～T10為試驗(yàn)組，空白對(duì)照組為T11。以芽孢桿菌（Bacillus）、農(nóng)桿菌（Agrobacterium）、假單胞菌（Pseudomonas）這3類種屬細(xì)菌設(shè)置菌劑組合，具體處理見表1。

1.2 蜈蚣草稱質(zhì)量

培養(yǎng)6個(gè)月后挖取盆栽蜈蚣草，每株植株以其根基處為中心，提取10 cm×10 cm正方形土壤內(nèi)根系，洗凈后分開保存。將根系與植株地上部在110 ℃ 下殺青0.5 h，隨后調(diào)整溫度至75 ℃恒溫烘干，稱質(zhì)量，以干質(zhì)量（表2）作為蜈蚣草生物量[10]。

1.3 蜈蚣草根際土總DNA的提取

采集每個(gè)重復(fù)樣品中長勢最好的蜈蚣草根際土壤，稱取質(zhì)量相當(dāng)于0.5 g風(fēng)干土的新鮮土樣（約0.612 g），采用土壤DNA提取試劑盒[FastDNA spin kit for soil （Qbiogene公司生產(chǎn)）]中給定的操作步驟進(jìn)行土壤總DNA的提取。

1.4 16S rRNA基因擴(kuò)增

利用巢氏聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）對(duì)提取出的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，第1輪以27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-TACGGYTACCTTGTTACGA-3′）為引物。PCR體系為50 μL：混合液25 μL，引物各4 μL，DNA 4 μL，雙蒸水（ddH2O）13 μL。PCR程序：94 ℃ 預(yù)變性5 min;94 ℃變性1 min，53 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，循環(huán)33次;72 ℃ 10 min[11]。第2輪以338F（GC）[5′-（CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG）CCTACGGGAGGCAGCAG-3′]和518R（5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′）為引物。PCR 體系：Mix 25 μL，引物各4 μL，DNA 4 μL，加ddH2O至總體積50 μL。PCR 程序：94 ℃5 min;94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，循環(huán)30次;72 ℃ 10 min[12]。

1.5 變性梯度凝膠電泳

取第2輪PCR產(chǎn)物15 μL進(jìn)行變性梯度凝膠電泳（DGGE）分析，設(shè)置變性劑濃度梯度為30%～60%，聚丙烯酰胺凝膠濃度為8%，在1×TAE緩沖液中于電壓為120 V、溫度為60 ℃下恒溫電泳7 h。電泳完成后，用硝酸銀進(jìn)行染色[13]。DGGE圖譜用數(shù)碼相機(jī)進(jìn)行拍照。

1.6 克隆與測序

切取“1.5”節(jié)中DGGE條帶（PCR產(chǎn)物）用Clean-Up試劑盒進(jìn)行純化后，與pGEM-T Easy Vector載體進(jìn)行連接，利用大腸桿菌（Escherichia coli） DH5α感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞用氨芐青霉素抗性基因和PCR進(jìn)行檢測。通過藍(lán)白斑篩選陽性克隆子并送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.7 數(shù)據(jù)處理

利用Excle對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行基本處理和分析，SPSS 17.0進(jìn)行Duncans 單因素方差分析;通過Bio-Rad公司的Quantity One 4.4進(jìn)行DGGE圖譜分析;基于Neighbor-joining法，用MEGA 5.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹;利用Shannon多樣性指數(shù)（H）、豐富度（S）和均勻度（Eh）來評(píng)價(jià)群落結(jié)構(gòu)多樣性;采用CANOCO 4.5軟件中的典型相關(guān)分析（canonical correlation analysis，簡稱CCA）程序?qū)ν寥兰?xì)菌群落與土壤理化性質(zhì)間的內(nèi)在關(guān)系進(jìn)行分析（P<0.05）。多樣性指數(shù)計(jì)算公式為

H=-∑niNlnniN。（1）

Eh=HlnS。（2）

式中：ni為單一條帶的強(qiáng)度;N為所有條帶的總強(qiáng)度;S為每個(gè)泳道總的條帶數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同PGPR菌劑組合處理下的土壤理化性質(zhì)分析

從表3可以看出，土壤樣品為酸性土壤，對(duì)比空白對(duì)照，各菌劑組合會(huì)降低土壤中pH值;蜈蚣草對(duì)酸性土壤有較強(qiáng)的耐受性，且在酸性環(huán)境下對(duì)重金屬依舊有很強(qiáng)的吸附性[14]，所以pH值的改變不影響其吸砷效果。通過對(duì)比各處理數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，T1試驗(yàn)組土壤中有機(jī)質(zhì)、有效磷、速效鉀、速效氮含量最高。另外，這3組處理的共同點(diǎn)是菌劑組合中均包括芽孢桿菌（Bacillus），可以推測芽孢桿菌（Bacillus）的添加對(duì)植株的生長環(huán)境有優(yōu)化作用。

2.2 不同PGPR菌劑組合處理下的土壤群落結(jié)構(gòu)分析

DGGE圖譜中處在不同位置上的條帶代表的細(xì)菌不同，條帶數(shù)量越多，說明該樣品生物多樣性越豐富;菌落種屬越多，其條帶強(qiáng)度越強(qiáng)[15]。從圖1可以看出，每個(gè)泳道中的條帶在數(shù)量、強(qiáng)弱和位置上均存在差異性，且每個(gè)泳道有各自的優(yōu)勢條帶，表明PGPR菌劑的添加，改變了土壤中細(xì)菌的種群結(jié)構(gòu)。

將這11個(gè)樣品進(jìn)行DGGE后，對(duì)電泳圖譜中各樣品的共有以及特異性條帶進(jìn)行切膠回收及克隆測序，共得到13條有效序列（A1～A13）。把測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫內(nèi)序列進(jìn)行Blast比對(duì)，找出同源性最高的序列，進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，結(jié)果如圖2所示。

系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，13條回收序列所對(duì)應(yīng)的分屬于鏈霉菌屬 （Streptomyces ）、草酸桿菌屬（Oxalobacteraceae）、Thermosporotrichaceae、黃單胞菌屬（Xanthomonadaceae）、硝化桿菌（Nitrobacter）、伯克氏菌屬（Burkholderiales）、疣微菌屬（Verrucomicrobium）、不可培養(yǎng)細(xì)菌（Uncultured bacterium）、γ-變形菌（Gammar proteobacterium）、乳桿菌屬（Acidobacterium）、綠色彎菌（Chloroflexi）、微桿菌屬（Microbacterium）、假黃單胞菌屬（Pseudoxanthomonas）。說明不同處理下的蜈蚣草根際土壤細(xì)菌具有一定的多樣性和豐度。

根據(jù)圖2通過Quantity one進(jìn)行多樣性指數(shù)計(jì)算。由表4可以看出， 不同處理的蜈蚣草樣品根際土壤中微生物的豐富度、多樣性、均勻度有所不同。其中，T1、T9、T10處理的多樣性指數(shù)明顯優(yōu)勢于其他處理，表明添加不同PGPR菌劑對(duì)蜈蚣草根際土壤的微生物群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的影響存在差異。

2.3 土壤理化性質(zhì)與根際土壤中細(xì)菌多樣性指數(shù)的相關(guān)性分析

由表5可以看出，土壤微生物群落多樣性指數(shù)均與總砷含量呈極顯著負(fù)相關(guān);多樣性指數(shù)、均勻度與有效磷含量呈顯著正相關(guān)，說明蜈蚣草根際微生物群落結(jié)構(gòu)受土壤總砷含量和有效磷含量明顯影響。

2.4 土壤理化性質(zhì)與土壤樣品優(yōu)勢細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)的CCA分析

圖3顯示，第1排序軸解釋了細(xì)菌群落變化的12.2%，第2排序軸解釋了細(xì)菌群落變化的7.9%。圖3中箭頭連線的長度表示相應(yīng)理化性質(zhì)與群落結(jié)構(gòu)的相關(guān)程度的大小，連線越長表示其對(duì)群落結(jié)構(gòu)的影響越大?？芍琾H值與2個(gè)排序軸呈負(fù)相關(guān)，而速效氮含量、速效鉀含量與第1排序軸相關(guān)程度較高，且箭頭線較長，說明與第1排序軸相關(guān)的土壤理化性質(zhì)為速效鉀含量和速效氮含量（P<0.05）。而在第2排序軸上有效磷含量箭頭線較長，說明其對(duì)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)具有較大影響（P<0.05）?？傮w來看，本研究中土壤速效氮、速效鉀、有效磷含量是影響蜈蚣草根際微生物群落結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵土壤理化因子。

3 討論

3.1 不同處理下的PGPR菌劑對(duì)蜈蚣草長勢和土壤理化性質(zhì)的影響

劉鵬等研究指出，PGPR菌劑在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用效果較好[16]。本試驗(yàn)通過變換PGPR菌劑組合的方式，對(duì)砷脅迫下的蜈蚣草進(jìn)行澆灌培養(yǎng)，篩選出品質(zhì)、效果最好的PGPR菌劑組合，以提高蜈蚣草對(duì)于土壤中砷吸附的效應(yīng)。通過綜合對(duì)比發(fā)現(xiàn)，雖然有一部分組合菌劑對(duì)蜈蚣草并未起到促砷吸附作用，但仍然篩選出了3組與空白對(duì)照相比，對(duì)蜈蚣草長勢、吸砷效果促進(jìn)作用更強(qiáng)的菌劑，即T1、T9、T10。研究顯示，不同微生物對(duì)蜈蚣草的促砷吸附效果有所不同[17]。

土壤微生物數(shù)量、種類變化對(duì)土壤中的有機(jī)質(zhì)礦化速度及各種養(yǎng)分的狀態(tài)有所影響，所以，好的微生物群落結(jié)構(gòu)可以促進(jìn)土壤理化指標(biāo)的轉(zhuǎn)化，從而提高土壤養(yǎng)分含量[18]。通過盆栽試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照相比，對(duì)蜈蚣草有促進(jìn)砷吸收作用的PGPR菌劑組合處理的土壤各項(xiàng)理化性質(zhì)皆得到了改善。

3.2 不同PGPR菌劑組合對(duì)蜈蚣草根際中菌落結(jié)構(gòu)的影響

通過分析DGGE圖譜可以看到，與空白對(duì)照相比，添加不同PGPR菌劑組合的植株根際土壤細(xì)菌多樣性、群落結(jié)構(gòu)均存在差異性，由此表明，PGPR菌劑的添加，對(duì)土壤的種群結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了影響。向土壤添加或接種外源微生物會(huì)對(duì)土壤中原微生物群落結(jié)構(gòu)造成直接或間接的影響，從而影響土壤所發(fā)揮的生態(tài)效應(yīng)[19]。

3.3 土壤環(huán)境因子對(duì)蜈蚣草根際土壤群落的影響

土壤的環(huán)境因子會(huì)改變土壤中的微生物種群結(jié)構(gòu)，典范對(duì)應(yīng)分析將環(huán)境因子作為約束條件進(jìn)行排序分析，從而分析出環(huán)境因子對(duì)微生物群落所產(chǎn)生的影響。有研究指出，根際土壤中的細(xì)菌群落數(shù)量與pH值、速效磷含量、速效氮含量呈顯著相關(guān)[20]。在本研究中土壤速效氮和速效磷和速效鉀是影響砷脅迫下蜈蚣草根際土壤微生物群落變異的重要因子。而在筆者所在研究團(tuán)隊(duì)前期研究中也發(fā)現(xiàn)，土壤鉀含量及有效性也是影響細(xì)菌群落多樣性和豐富度的重要因素[21]?？梢?，土壤氮磷鉀等養(yǎng)分是影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的重要因素，也影響著土壤砷的有效性進(jìn)而調(diào)控蜈蚣草對(duì)砷污染土壤的修復(fù)效果[22]。

4 結(jié)論

PGPR菌劑會(huì)對(duì)砷脅迫下的蜈蚣草生物量、砷富集量以及根際微生物群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生明顯影響，其中以添加芽孢桿菌（Bacillus）細(xì)菌的處理對(duì)蜈蚣草生長發(fā)育影響最明顯。砷脅迫下，蜈蚣草根際微生物群落結(jié)構(gòu)受土壤速效氮、速效鉀、有效磷含量的影響。

參考文獻(xiàn)：

[1]楊曉梅. CCA的應(yīng)用現(xiàn)狀及環(huán)境與人體健康評(píng)估[J]. 四川林業(yè)科技，2011，32（1）：69-73.

[2]王?；郏ê愀?，羅 瑛，等. 土壤重金屬污染及植物修復(fù)技術(shù)[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2009，25（11）：210-214.

[3]崔巖山，陳曉晨，付 瑾. 污染土壤中鉛砷的生物可給性研究進(jìn)展[J]. 生態(tài)環(huán)境學(xué)報(bào)，2010，19（2）：480-486.

[4]葉文玲，樊 霆，魯洪娟，等. 蜈蚣草的植物修復(fù)作用對(duì)土壤中砷總量及形態(tài)分布的影響研究[J]. 土壤通報(bào)，2014，45（4）：1003-1007.

[5]羅 磊，張淑貞，馬義兵. 土壤中砷吸附機(jī)理及其影響因素研究進(jìn)展[J]. 土壤，2008，40（3）：351-359.

[6]李有志，羅 佳，張燦明，等. 湘潭錳礦區(qū)植物資源調(diào)查及超富集植物篩選[J]. 生態(tài)學(xué)雜志，2012，31（1）：16-22.

[7]楊啟良，武振中，陳金陵，等. 植物修復(fù)重金屬污染土壤的研究現(xiàn)狀及其水肥調(diào)控技術(shù)展望[J]. 生態(tài)環(huán)境學(xué)報(bào)，2015，24（6）：1075-1084.

[8]謝景千，雷 梅，陳同斌，等. 蜈蚣草對(duì)污染土壤中As、Pb、Zn、Cu的原位去除效果[J]. 環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2010，30（1）：165-171.

[9]李小林，顏 森，張小平，等. Pb-Zn礦區(qū)重金屬污染對(duì)微生物數(shù)量及放線菌群落結(jié)構(gòu)的影響[J]. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2011，30（3）：486-475.

[10]尹元萍，張雅瓊，申毓晗，等. 利用根系形態(tài)構(gòu)型篩選磷高效大豆基因型[J]. 分子植物育種，2015，13（5）：999-1008.

[11]邢 薇，左劍惡，林 甲，等. 20 ℃ EGSB反應(yīng)器中顆粒污泥的微生物種群結(jié)構(gòu)分析[J]. 環(huán)境科學(xué)，2008，29（9）：2558-2563.

[12]劉 棟. 野生與養(yǎng)殖大鯢腸道微生物多樣性分析及產(chǎn)酶活性研究[D]. 漢中：陜西理工學(xué)院，2016.

[13]喻國輝，牛春艷，陳遠(yuǎn)鳳，等. 利用16S rDNA結(jié)合gyrA和gyrB基因?qū)ι姥挎邨U菌R31的快速鑒定[J]. 中國生物防治學(xué)報(bào)，2010，26（2）：160-166.

[14]Andrade J，Corredig M. Vitamin D3 and phytosterols affect the properties of polyglycerol polyricinoleate （PGPR） and protein interfaces[J]. Food Hydrocolloids，2016，54：278-283.

[15]李榜江，王龍昌，龍明忠，等. 極端酸性條件下蜈蚣草對(duì)重金屬污染環(huán)境的修復(fù)效應(yīng)[J]. 水土保持學(xué)報(bào)，2013，27（5）：183-187.

[16]劉 鵬，劉訓(xùn)理. 中國微生物肥料的研究現(xiàn)狀及前景展望[J]. 農(nóng)學(xué)學(xué)報(bào)，2013，3（3）：26-31.

[17]楊 倩. 微生物提高植物修復(fù)砷污染土壤的效果和機(jī)理研究[D]. 武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.

[18]周法永，盧 布，顧金剛，等. 我國微生物肥料的發(fā)展階段及第三代產(chǎn)品特征探討[J]. 中國土壤與肥料，2015（1）：12-17.

[19]Sang M K，Kim D K. Plant growth-promoting rhizobacteria suppressive to Phytophthora blight affect microbial activities and communities in the rhizosphere of pepper （Capsicum annuum L.） in the field[J]. Applied Soil Ecology，2012，62：88-97.

[20]楊 超，劉國順，邱立友，等. 不同植煙土壤微生物數(shù)量調(diào)查研究[J]. 中國煙草科學(xué)，2007，28（5）：3l-36.

[21]Gu Y F，Bai? Y，Xiang Q J，et al. Degradation shaped bacterial and archaeal communities with predictable taxa and their association patterns in Zoige wetland at Tibet plateau[J]. Scientific Reports，2018，8：3884.

[22]Liao X Y，Chen T B，Xiao X Y，et al. Selecting appropriate forms of nitrogen fertilizer to enhance soil arsenic removal by Pteris Vittata：a new approach in phytoremediation[J]. International Journal of Phytoremediation，2007，9（4）：269-280.