花 蕾，鄭先斌,2，郭偉茜，陶振超，周 燕，楊麗萍，張洋洋，黃一凡，孫 斌，楊 婧，何 健，高 勁

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)是我國常見的頭頸部惡性腫瘤，2018年全球新發(fā)病例129 000例，中國占近一半，放射治療是其主要治療方式[1]。盡管近些年NPC臨床診療水平不斷提高，仍有20%～30%的患者發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致治療失敗，影響患者的整體生存率[2]。因此，NPC遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是臨床面臨的主要問題，鑒定NPC轉(zhuǎn)移相關(guān)靶點尤為重要。

長鏈非編碼RNAs(long non-coding RNAs，lncRNAs)是一類由大于200個核苷酸組成的RNAs。在細(xì)胞中，lncRNAs可以通過4種作用模式發(fā)揮生物學(xué)功能：① 調(diào)控下游基因轉(zhuǎn)錄；② 阻斷分子的作用和信號通路；③ 將蛋白復(fù)合物定位到特定的DNA序列上；④ 起“中心平臺”的作用[3-4]。目前，越來越多參與NPC發(fā)生發(fā)展的lncRNAs被發(fā)現(xiàn)。例如，HOX轉(zhuǎn)錄反義RNA(HOX transcript antisense RNA，HOTAIR)能夠直接激活血管內(nèi)皮生長因子A(vascular endothelial growth factor-A，VEGFA)[5]的轉(zhuǎn)錄，調(diào)控基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metallopeptidase 9，MMP-9)和p21蛋白(protein 21，p21)的水平[6]，參與NPC的進展。lncRNA-LET通過調(diào)控MAPK/ERK 通路的表達(dá)譜[7]或多梳蛋白zeste基因增強子類同源物2(enhancer of zeste homolog 2，EZH2)抑制[8]，影響NPC細(xì)胞增殖。然而，lncRNAs與NPC轉(zhuǎn)移相關(guān)的潛在機制少有報道。該研究通過高通量測序篩選出在轉(zhuǎn)移與非轉(zhuǎn)移NPC患者外周血樣本中差異表達(dá)的lncRNAs，并預(yù)測其潛在機制。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本收集選取2018年10月1日～2019年5月1日安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院西區(qū)(安徽省腫瘤醫(yī)院)確診為NPC的5例患者，所有患者均首次診斷為NPC。其中發(fā)生遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移者3例，未發(fā)生轉(zhuǎn)移者2例。抽取患者外周血標(biāo)本5 ml，提取樣本中上層血清，分裝至無RNA酶小管，于液氮中凍存保存。所有研究對象均知情同意參加本項實驗，且該過程經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審查批準(zhǔn)。

1.2 RNA提取和鑒定根據(jù)Takara RNAiso (Code No.9180/9109)說明書提取血清樣品中的總RNA。提取完畢后，進行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)電泳條帶檢測總RNA完整性，并使用NanoDrop 1000分光光度計檢測總RNA濃度及純度。

1.3 文庫構(gòu)建測序文庫構(gòu)建采用每份樣品中1～2 μg總RNA，先經(jīng)過去除核糖體RNA處理，產(chǎn)物RNA用于下一步文庫構(gòu)建?；赿UTP的鏈特異性，將文庫構(gòu)建分為多個步驟，包括：將mRNA富集后的RNA進行片段化處理；通過逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA模板；加入dUTP形成互補鏈，合成雙鏈cDNA；在各種聚合酶的作用下，使雙鏈cDNA添加多聚A尾，且修復(fù)末端；Illumina特異性接頭使用連接酶進行連接；最后經(jīng)PCR擴增并純化，得到RNA測序文庫。

1.4 文庫質(zhì)檢構(gòu)建好的文庫將使用Agilent 2100生物芯片分析系統(tǒng)進行質(zhì)量檢測，內(nèi)容包括文庫濃度、片段大小、是否含有接頭等項目，并通過定量PCR方法進行文庫的最終定量，根據(jù)定量結(jié)果及最終測序數(shù)據(jù)量的要求，混合不同樣品的測序文庫進入下一步測序流程。

1.5 上機測序混合處理完成的不同樣品的測序文庫，經(jīng)過氫氧化鈉溶液處理變性為單鏈DNA，稀釋為特定濃度后，通過測序儀進行原位擴增，擴增出的片段末端使用測序儀檢測150個循環(huán)。

1.6 測序數(shù)據(jù)分析和基因功能分析產(chǎn)生的測序數(shù)據(jù)通過測序質(zhì)控后，將經(jīng)過預(yù)處理過濾步驟產(chǎn)生的數(shù)據(jù)比對到參考基因組上，將比對結(jié)果進行統(tǒng)計分析后進行l(wèi)ncRNAs和轉(zhuǎn)錄本表達(dá)定量分析、lncRNAs表達(dá)水平分析、差異表達(dá)lncRNAs篩選、基因本體論(gene ontology，GO)、功能顯著性富集分析(GO enrichment analysis)、京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路顯著性富集分析等一系列分析，初步探討NPC轉(zhuǎn)移相關(guān)lncRNAs潛在機制。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理使用R軟件中的Ballgown包進行樣本表達(dá)水平的定量，以及組間的lncRNAs的差異表達(dá)分析。設(shè)定閾值為1.5倍差異，P<0.05，且組內(nèi)FPKM均值≥0.5來篩選差異表達(dá)lncRNAs。

2 結(jié)果

2.1 文庫質(zhì)量評估及測序數(shù)據(jù)質(zhì)量控制表1為lncRNAs在轉(zhuǎn)移與非轉(zhuǎn)移NPC中的表達(dá)譜，序列數(shù)和堿基數(shù)分別代表各樣本的總序列及總堿基數(shù)。對每個樣品的序列統(tǒng)計代表錯誤識別概率為0.1%的Q30，一般情況下認(rèn)為Q30≥80%則認(rèn)為測序質(zhì)量合格。本研究所涉及樣本測序數(shù)據(jù)Q30均≥90%，表明測序質(zhì)量合格。

通過高通量測序，共鑒定出1 726條lncRNAs在5例NPC患者血液樣本中表達(dá)，其中1 328條lncRNAs在NPC轉(zhuǎn)移組中表達(dá)較高，398條lncRNAs在NPC轉(zhuǎn)移組中表達(dá)較低。在轉(zhuǎn)移組表達(dá)較高的lncRNAs中，有2條lncRNAs的表達(dá)量差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Fold Change>1.5，P<0.05)，在轉(zhuǎn)移組表達(dá)較低的lncRNAs中，有12條lncRNAs的表達(dá)量差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Fold Change>1.5，P<0.05)，如表2所示，lncRNA ENST00000610778是表達(dá)差異較大的lncRNA，F(xiàn)C值為4 011.71，在轉(zhuǎn)移組中含量低，非轉(zhuǎn)移組含量高。

表1 測序數(shù)據(jù)量統(tǒng)計

表2 差異表達(dá)lncRNAs列表

2.2 lncRNAs相應(yīng)基因的GO分析lncRNAs的功能往往與其相應(yīng)周圍編碼蛋白的基因具有功能相似性，因此可以根據(jù)基因功能注釋數(shù)據(jù)庫GO對差異表達(dá)的lncRNAs周圍編碼基因按照功能進行分類及注釋，GO注釋內(nèi)容包括：生物學(xué)過程(biological process, BP)、分子生物學(xué)功能(molecular function, MF)和細(xì)胞學(xué)組分(cellular components, CC)。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，差異lncRNAs的周圍編碼基因生物學(xué)過程主要集中于翻譯、核糖體大亞基組裝、SRP依賴的膜靶向共翻譯蛋白、病毒轉(zhuǎn)錄、核轉(zhuǎn)錄mRNA分解代謝過程、翻譯啟動以及rRNA加工，涉及基因包括NACA、RPL3、RPL12，如圖1A所示。分子生物學(xué)功能富集于核糖體結(jié)構(gòu)成分，涉及基因包括RPL3、RPL12，如圖1B所示。細(xì)胞學(xué)組分富集于胞質(zhì)大核糖體亞基、黏著斑，涉及基因包括RPL3、RPL12，如圖1C所示。

2.3 lncRNAs周圍對應(yīng)mRNAs的KEGG通路分析經(jīng)過KEGG通路分析后發(fā)現(xiàn)，差異表達(dá)的lncRNAs對應(yīng)同位基因在“核糖體”(Ribosome)通路富集。如圖2、3所示。

圖1 差異表達(dá)lncRNAs周圍對應(yīng)編碼基因的GO注釋氣泡圖

圖2 差異表達(dá)lncRNAs對應(yīng)周圍編碼基因的

3 討論

人類基因組計劃和DNA元件百科全書計劃研究[3]結(jié)果顯示，人類基因組中非編碼的RNA占了大部分區(qū)域，其中的lncRNAs曾一度被認(rèn)為是轉(zhuǎn)錄噪音。lncRNAs依據(jù)從基因組中被轉(zhuǎn)錄位置的不同，可被分為5大類：正義鏈、反義鏈、雙向、內(nèi)含子間、基因型[3-4]，這種位置關(guān)系很大程度上與lncRNAs功能有關(guān)。隨著生物信息技術(shù)以及分子生物學(xué)的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)多種lncRNAs在生命活動中發(fā)揮重要作用，包括腫瘤轉(zhuǎn)移。例如，一項lncRNAs與NPC轉(zhuǎn)移相關(guān)的研究表明，AFAP1-AS1在體外實驗中通過調(diào)節(jié)肌動蛋白絲完整性促進癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移[9]，而另一項96例NPC石蠟包埋樣本的回顧性分析發(fā)現(xiàn)，AFAP1-AS1在浸潤淋巴細(xì)胞中高表達(dá)的患者更容易發(fā)生轉(zhuǎn)移[10]。lncRNA H19也是NPC的促癌基因之一，能通過抑制miR-630 的活性而不是直接的相互作用來調(diào)節(jié) EZH2 的表達(dá)，促進NPC細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移[11]。也有新發(fā)現(xiàn)的lncRNAs在NPC中被探究，例如，LOC284454影響細(xì)胞骨架和黏附相關(guān)的Rho/Rac 信號通路，促進NPC的遷移和侵襲[12]，lncRNA-n326322通過激活PI3K/AKT 和 ERK/MAPK通路促進NPC細(xì)胞的增殖和遷移[13]。除此之外，lncRNAs在NPC中也可直接與靶基因結(jié)合，通過靶基因影響其功能。NPCCAT1和LncRNA PXN-AS1-L可分別結(jié)合YY1和SAPCD2促進細(xì)胞增殖和遷移[14-15]。當(dāng)然，也有部分lncRNAs在NPC中影響生物學(xué)功能的機制尚不明確。

本研究中，筆者通過嚴(yán)格控制入組標(biāo)準(zhǔn)，篩選出2例無轉(zhuǎn)移的NPC患者，3例轉(zhuǎn)移NPC患者，其中轉(zhuǎn)移患者均為全身多發(fā)轉(zhuǎn)移。并成功提取患者外周血中的總RNA，使用全轉(zhuǎn)錄組測序方法檢測樣本中的lncRNAs，結(jié)果顯示，差異表達(dá)的lncRNAs有14條，表達(dá)差異較大的為lncRNA ENST00000610778，其對應(yīng)的基因為AC245060.5，定位于22號染色體。在NPC轉(zhuǎn)移患者的血清中含量低，在非轉(zhuǎn)移NPC患者血清中含量高，與轉(zhuǎn)移組比較，差異倍數(shù)為4 011.71。這些差異表達(dá)的lncRNAs對應(yīng)的基因富集到不同區(qū)域，參與細(xì)胞信號通路的調(diào)節(jié)。通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，基因中RPL3、RPL12均編碼一種核糖體蛋白，分別定位于22號、9號染色體，真核細(xì)胞80S核糖體定位于胞質(zhì)，由60S大亞基和40S小亞基組成，60S大亞基含有46個核糖體蛋白，40S小亞基含有33個核糖體蛋白。而RPL3、RPL12均為60S亞基的組成部分。參與GO注釋生物學(xué)過程、分子生物學(xué)功能、細(xì)胞學(xué)組分以及KEGG通路。其中，參與的生物學(xué)過程最多，共有7個，包括翻譯、核糖體大亞基組裝、SRP依賴的膜靶向共翻譯蛋白、該圖為KEGG網(wǎng)站的核糖體通路具體組成，紅框部分L3、L12分別為RPL3、RPL12的簡稱，代表RPL3、RPL12參與核糖體通路病毒轉(zhuǎn)錄、核轉(zhuǎn)錄mRNA分解代謝過程、翻譯啟動以及rRNA加工。分子生物學(xué)功能富集于核糖體結(jié)構(gòu)成分，細(xì)胞學(xué)組分富集于胞質(zhì)大核糖體亞基、黏著斑。值得注意的是，RPL3、RPL12在KEGG信號通路中主要參與核糖體通路，KEGG網(wǎng)站中對應(yīng)編號為map03010，在中心法則中負(fù)責(zé)翻譯過程，由此推測本研究中它們相應(yīng)的lncRNA ENST00000465618、ENST00000497322/ ENST00000497825，也可能與蛋白質(zhì)的合成有關(guān)，具有潛在研究價值。可針對這些具有潛在研究價值的lncRNAs，在分子水平、細(xì)胞水平揭示它們與NPC轉(zhuǎn)移發(fā)生的相關(guān)性及具體作用機制，為NPC轉(zhuǎn)移的診斷和治療提供靶點。

圖3 核糖體通路組成

盡管lncRNAs與NPC相關(guān)性研究逐漸深入，但真正應(yīng)用到實際臨床工作中還需更多投入。主要難點在于：① lncRNAs自身作用復(fù)雜，且存在相互串?dāng)_，還有可能存在其他潛在機制，本研究鑒定出的lncRNA ENST00000610778、lncRNA ENST00000465618、ENST00000497322/ENST00000497825前期研究很少，尚未有文獻(xiàn)報道其具體功能及作用機制；② 一種lncRNA往往參與多種疾病的發(fā)生，NPC特異性的lncRNAs很少報道，轉(zhuǎn)移特異性的lncRNAs更是少見，因此，需要更大的樣本量去發(fā)現(xiàn)和鑒定相關(guān)的lncRNAs；③ 實驗室研究轉(zhuǎn)化以及與臨床應(yīng)用的整合面臨挑戰(zhàn)，需要多學(xué)科的交叉、整合與協(xié)作。后續(xù)本課題組將繼續(xù)圍繞上述lncRNAs對NPC生物學(xué)影響深入展開體外及體內(nèi)研究，為lncRNAs在NPC的臨床應(yīng)用提供基礎(chǔ)。

本研究補充了人體外周血樣本中轉(zhuǎn)移性NPC的表達(dá)譜，鑒定出與非轉(zhuǎn)移性NPC患者差異表達(dá)的一系列l(wèi)ncRNAs，提示lncRNAs可能參與NPC的轉(zhuǎn)移過程，利用lncRNAs與其相應(yīng)基因的功能相關(guān)性，對它們參與的生物學(xué)過程以及信號通路進行預(yù)測，為lncRNAs在NPC轉(zhuǎn)移過程中的生物學(xué)作用及潛在機制研究提供思路和方向。