楊留洋，高 倩，程 民，徐婷娟，胡世蓮，沈國棟

胃癌是常見惡性腫瘤之一，我國胃癌每年新發(fā)病例與死亡病例均接近全球的一半[1]。由于缺乏特異的生物標(biāo)志物及靶向治療藥物，這給胃癌診治帶來許多困難，大多數(shù)患者治療后生存期仍然較短[2]。WNT/β-catenin通路是WNT信號中的經(jīng)典通路，在胚胎發(fā)育及成體干細(xì)胞更新中發(fā)揮關(guān)鍵作用，其信號異常激活被認(rèn)為與腫瘤發(fā)生有關(guān)[3]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)WNT/β-catenin通路中轉(zhuǎn)錄因子7類似物2(transcription factor 7-like 2，TCF7L2)能促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖及對化療耐藥[4]，但其具體機(jī)制尚不清楚。該研究揭示了TCF7L2與配體WNT7b通過相互增強(qiáng)表達(dá)的正反饋方式促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖與轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制，為尋找用于胃癌診療的標(biāo)志物分子及研發(fā)新藥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1病例資料 按照安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)方案(編號：2019-X(H)-001)，收集2019年5～12月在安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院行胃癌手術(shù)且病理診斷為胃腺癌的標(biāo)本17例(患者均簽署了知情同意書)。

1.1.2細(xì)胞株與試劑 人胃癌細(xì)胞株NCI-N87(以下簡稱N87)與SGC7901購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所。胎牛血清(FBS)購自美國Clark公司；RPMI1640培養(yǎng)基購自美國Corning公司；RIPA裂解液及5×蛋白上樣緩沖液購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；蛋白磷酸酶及蛋白酶抑制劑(cocktail)購自瑞士Roche公司；BCA試劑盒與化學(xué)發(fā)光顯影液購自美國Thermo-fisher公司；β-actin兔抗人抗體、TCF7L2兔抗人抗體及辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG購自美國Cell Signaling Technology公司；人重組WNT7b蛋白購自臺灣Abnova公司；放線菌素D購自美國MCE公司；RNA抽提試劑盒購自德國Analytik Jena公司；逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒及熒光定量PCR(qPCR)試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)公司；PCR芯片購自美國Qiagen公司；LipoHigh脂質(zhì)體高效轉(zhuǎn)染試劑、G418(遺傳霉素) 與TRIzol購于生工生物工程(上海)股份公司；TCF7L2過表達(dá)質(zhì)粒與shTCF7L2質(zhì)粒由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司構(gòu)建；TOP-flash和pRL-TK質(zhì)粒購自上海權(quán)陽生物科技公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測系統(tǒng)購自美國Promega公司。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) N87、SGC7901等人胃癌細(xì)胞株培養(yǎng)于含10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中飽和濕度條件下培養(yǎng)。

1.2.2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 提前24 h在6孔培養(yǎng)板中移植N87或SGC7901細(xì)胞(約4×10個(gè)5/孔)，待細(xì)胞生長約60%滿度時(shí)即可用于轉(zhuǎn)染。將LipoHigh轉(zhuǎn)染試劑按照說明書配制為0.25 ml轉(zhuǎn)染液，另配0.25 ml含0.5 μg pcDNA3.1-TCF7L2或者shTCF7L2質(zhì)粒的無血清培養(yǎng)基，室溫孵育5 min，將上述2種溶液混合后室溫孵育20 min，逐滴加入6孔培養(yǎng)板，于培養(yǎng)箱中孵育6 h，更換含有血清的完全培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，分別得到瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的SGC7901/TCF7L2與N87/shTCF7L2細(xì)胞；穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株則后續(xù)培養(yǎng)在含0.5 mg/ml G418的完全培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選、 挑取單克隆后獲得。

1.2.3mRNA穩(wěn)定性檢測 參考Li et al[5]的方法，在6孔板中培養(yǎng)N87細(xì)胞(4×105個(gè)/孔)，待細(xì)胞貼壁，分為對照組和WNT7b組(培養(yǎng)基中含量為200 ng/ml)分別處理48 h后，加入放線菌素D(培養(yǎng)基中含量為2 μg/ml)分別處理2、4、6 h，收取細(xì)胞后使用qPCR方法檢測。

1.2.4qPCR檢測 分別使用TRIzol法抽提組織樣本RNA，RNA抽提試劑盒提取并純化胃癌細(xì)胞株的RNA，測定樣品RNA濃度和純度后，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后使用qPCR試劑盒進(jìn)行檢測，參數(shù)如下：94 ℃、30 s預(yù)變性；94 ℃、5 s，60 ℃、30 s(熒光采集)，共40個(gè)循環(huán)，讀取每個(gè)反應(yīng)的Ct值，2-ΔΔCt表示基因相對表達(dá)量。GAPDH作為內(nèi)參，引物名稱與序列見表1。

表1 qPCR引物名稱與序列

1.2.5Western blot檢測 提取各組N87細(xì)胞總蛋白，BCA法測定各組蛋白濃度，加入蛋白上樣緩沖液后于水浴鍋中煮沸8 min，經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶室溫條件下封閉1 h。一抗以兔抗人β-actin為內(nèi)參，兔抗人TCF7L2為目的蛋白，4 ℃孵育過夜；二抗為HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG。滴加顯影液后使用化學(xué)發(fā)光成像儀成像并運(yùn)用Chemi Analysis分析軟件對蛋白電泳條帶灰度值進(jìn)行定量分析。蛋白相對定量=目的蛋白灰度值/同標(biāo)本內(nèi)參灰度值，將對照的蛋白相對定量設(shè)為1。

1.2.6雙熒光素酶報(bào)告基因檢測 按照雙熒光素酶報(bào)告基因檢測系統(tǒng)說明書，取轉(zhuǎn)染有報(bào)告基因質(zhì)粒的N87細(xì)胞，加入Dual-Glo試劑孵育10 min以使細(xì)胞充分裂解，然后使用Glomax多重?zé)晒鈾z測儀測量螢火蟲螢光素酶活性；然后加入Stop&Glo試劑孵育10 min，測量海腎螢光素酶活性。最后以海腎螢光素酶活性的測量值標(biāo)準(zhǔn)化螢火蟲螢光素酶活性值。

1.2.7細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 選取80%滿度的SGC7901細(xì)胞消化培養(yǎng)在96孔板，每孔加入2 000個(gè)細(xì)胞，分為WNT7b組、對照組：WNT7b組加入200 ng/ml WNT7b，對照組加入同體積PBS，每組至少設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。然后置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24～72 h后，更換新鮮培養(yǎng)基，每孔加入10 μl CCK-8工作液，在培養(yǎng)箱中孵育4 h，在450 nm波長測定吸光度。對于SGC7901/TCF7L2、N87/shTCF7L2及其對照細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)采用類似方法操作。

1.2.8細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 將N87細(xì)胞、N87/shTCF7L2細(xì)胞、SGC7901細(xì)胞、SGC7901/TCF7L2細(xì)胞分別培養(yǎng)在6孔板中，待細(xì)胞貼壁生長至80%滿度時(shí)，用100 μl無菌移液槍頭沿孔中間輕輕劃過，然后用PBS洗滌細(xì)胞2次以除去漂浮細(xì)胞。其中N87細(xì)胞分為對照組與WNT7b組，WNT7b組加入200 ng/ml WNT7b，對照組加入PBS。上述細(xì)胞分別于0與20 h后拍照，觀察劃痕愈合情況并測量距離。

1.2.9Transwell實(shí)驗(yàn) 使用SGC7901細(xì)胞，消化離心后用無血清培養(yǎng)基重懸計(jì)數(shù)，分別將100 μl含5×103細(xì)胞懸液加入Transwell上室，對照組下室加入200 μl完全培養(yǎng)基，WNT7b組的下室則含有200 ng/ml WNT7b。在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育12 h后取出小室，用4 %中性福爾馬林固定，棉簽小心擦去上室細(xì)胞，結(jié)晶紫染色，雙蒸水洗滌后用鑷子取下小室底膜，50%甘油封片，10×物鏡明場觀察并隨機(jī)選取10個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)分析。

2 結(jié)果

2.1 胃癌細(xì)胞中TCF7L2調(diào)控WNT7b基因表達(dá)通過分析過表達(dá)TCF7L2的SGC7901/TCF7L2與質(zhì)粒載體對照細(xì)胞株以及敲低TCF7L2的N87/shTCF7L2與對照細(xì)胞株的PCR芯片數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示受TCF7L2調(diào)控基因表達(dá)最顯著的WNT配體是WNT7b(表2)。然后通過17例臨床胃癌標(biāo)本檢測胃癌組織TCF7L2與WNT7b的轉(zhuǎn)錄水平均高于配對的癌旁正常組織，二者表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系(圖1)，結(jié)果提示W(wǎng)NT7b可能是TCF7L2調(diào)控的下游靶基因之一。

圖1 qPCR檢測胃癌組織TCF7L2和WNT7b的mRNA表達(dá)水平

2.2 WNT7b上調(diào)胃癌細(xì)胞TCF7L2表達(dá)與WNT/β-catenin信號活性使用200 ng/ml重組人WNT7b蛋白分別處理N87細(xì)胞24、48、72、96 h，當(dāng)WNT7b處理時(shí)間達(dá)到24 h后可見細(xì)胞中TCF7L2的mRNA表達(dá)量上升(t=-6.124,P=0.004)，并且其表達(dá)量隨著WNT7b刺激時(shí)間的延長而逐漸升高(48 h組與24 h組之間比較，t=-4.798,P=0.001)。為分析WNT7b對TCF7L2的mRNA半衰期的影響，使用2 μg/ml放線菌素D處理N87細(xì)胞以抑制新的mRNA合成，處理2 h即可顯示W(wǎng)NT7b組比對照組的TCF7L2 mRNA水平降低(t=3.5,P=0.035)；并且隨著放線菌素D處理時(shí)間的延長，WNT7b組的TCF7L2的mRNA表達(dá)量衰減速率比對照組小些，提示W(wǎng)NT7b增強(qiáng)了TCF7L2的mRNA穩(wěn)定性(圖2)。為分析WNT7b對TCF7L2蛋白表達(dá)的影響，使用Western blot法檢測結(jié)果顯示W(wǎng)NT7b處理的細(xì)胞TCF7L2蛋白表達(dá)水平上調(diào)，平均達(dá)到對照的4.8倍(圖3A)。進(jìn)一步使用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測系統(tǒng)證實(shí)WNT7b能上調(diào)胃癌細(xì)胞β-catenin/TCF轉(zhuǎn)錄活性(t=-3.729,P=0.027，40 mmol/L LiCl處理作為陽性對照，圖3)。這些結(jié)果提示W(wǎng)NT7b可能通過增強(qiáng)TCF7L2的mRNA穩(wěn)定性而提高TCF7L2的蛋白表達(dá)水平，從而上調(diào)胃癌細(xì)胞WNT/β-catenin信號通路的活性。

表2 TCF7L2影響WNT配體表達(dá)水平

圖2 qPCR法檢測N87細(xì)胞中TCF7L2 mRNA水平

圖3 WNT7b組增強(qiáng)N87細(xì)胞中TCF7L2蛋白表達(dá)和β-catenin/TCF結(jié)合活性

2.3 WNT7b與TCF7L2促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖為觀察WNT7b對胃癌細(xì)胞增殖能力的影響，使用200 ng/ml WNT7b重組蛋白處理SGC7901細(xì)胞，24 h后檢測，顯示W(wǎng)NT7b組細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)(t=-5.583,P=0.009)，且隨著培養(yǎng)時(shí)間延長到72 h，促進(jìn)細(xì)胞增殖的效果相應(yīng)增強(qiáng)(圖4A)。然后，比較過表達(dá)TCF7L2的SGC7901/TCF7L2細(xì)胞與對照細(xì)胞的增殖能力，顯示培養(yǎng)48 h后兩組細(xì)胞數(shù)之間出現(xiàn)顯著性差異(t=-19.701,P<0.001)，過表達(dá)TCF7L2組的細(xì)胞增殖明顯加快(圖4B)；反之，敲低TCF7L2表達(dá)的N87細(xì)胞培養(yǎng)24 h后其增殖能力就出現(xiàn)下降(t=-7.662,P=0.007，圖4C)。

2.4 WNT7b與TCF7L2增強(qiáng)胃癌細(xì)胞的遷移能力使用200 ng/ml WNT7b重組蛋白處理SGC7901細(xì)胞，采用劃痕實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示W(wǎng)NT7b刺激20 h的SGC7901細(xì)胞遷移距離較長(t=-6.919,P=0.009，圖5A)；Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示W(wǎng)NT7b刺激20 h能夠誘導(dǎo)SGC7901細(xì)胞遷移(t=-7.951,P<0. 001，圖5B)。類似的，劃痕實(shí)驗(yàn)檢測顯示過表達(dá)TCF7L2的SGC7901/TCF7L2細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)(P<0.001)，而敲低TCF7L2表達(dá)的N87/shTCF7L2細(xì)胞的遷移能力減弱(t=-9.558,P<0.001，圖5C)。

3 討論

由于缺乏特異的生物標(biāo)志物和靶向治療藥物，胃癌患者的總體生存期較短[6]。研究[7]表明WNT/β-catenin信號通路在胃腸道等多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用，因此針對該通路研制藥物可能是治療腫瘤的一種有效措施。WNT/β-catenin信號通路需要依賴β-catenin入核與轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，已知TCF/LEF家族包括TCF1、LEF1、TCF3與TCF7L2四個(gè)成員，TCF7L2是其中功能較為復(fù)雜的一個(gè)成員。盡管已有一些報(bào)道提示TCF7L2在腸和胰腺等腫瘤中的作用，但其在胃癌中的作用尚不清楚[8]。另外，WNT配體目前發(fā)現(xiàn)有19種，已有報(bào)道多種WNT配體與胃癌有關(guān)：如WNT1與胃癌的分期及預(yù)后有關(guān)[9]；WNT2B與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)[10]；WNT5A在胃癌的進(jìn)展期表達(dá)增多，可以指征不良預(yù)后[11]；WNT6表達(dá)水平與胃癌惡性進(jìn)展正相關(guān)，與化療響應(yīng)負(fù)相關(guān)[12]以及WNT10B高表達(dá)和胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)[13]等。WNT7b作為WNT配體家族的重要成員，早期研究表明其參與胚胎發(fā)育過程中多種器官和組織的發(fā)生[14]。近年的研究[15]表明WNT7B在約有10%的乳腺癌中高表達(dá)，且表達(dá)越高預(yù)示患者預(yù)后越差，但尚未見到在胃癌中的研究報(bào)道。

圖4 WNT7b與TCF7L2促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖

圖5 WNT7b與TCF7L2增強(qiáng)胃癌細(xì)胞遷移能力

本課題組前期研究顯示TCF7L2分子在胃癌等腫瘤中存在過度表達(dá)[4]。在此基礎(chǔ)上，本研究通過對胃癌中受TCF7L2調(diào)控的WNT配體表達(dá)分析，顯示W(wǎng)NT7b受影響最顯著，而且在胃癌組織中WNT7b與TCF7L2的表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系，提示W(wǎng)NT7b可能是TCF7L2調(diào)控的下游靶基因之一。通過使用WNT7b重組活性蛋白刺激胃癌細(xì)胞顯示W(wǎng)NT7b反過來能通過增強(qiáng)TCF7L2 mRNA的穩(wěn)定性而上調(diào)TCF7L2的蛋白表達(dá)水平，進(jìn)而提高了胃癌細(xì)胞WNT/β-catenin信號通路活性。細(xì)胞增殖及Transwell和劃痕實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果顯示W(wǎng)NT7b具有促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖與遷移的作用。總之，這些結(jié)果表明WNT7b與TCF7L2之間存在相互促進(jìn)表達(dá)的作用，共同發(fā)揮對胃癌細(xì)胞增殖與遷移能力的調(diào)控。結(jié)果也提示W(wǎng)NT7b與TCF7L2有可能成為胃癌相關(guān)標(biāo)記物分子與藥物治療靶點(diǎn)。但關(guān)于WNT7b與TCF7L2之間相互作用的具體機(jī)制及其臨床應(yīng)用價(jià)值還有待深入研究。