李彥妮，胡艷云,2，陳文軍，金忠秀

由于食品與水中的青霉素類抗生素(penicillins, PCs)殘留可能會(huì)帶來健康風(fēng)險(xiǎn)[1-3]，因此有必要對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。由于PCs在食品及水中常以痕量存在，檢測(cè)前需要進(jìn)行富集分離[4]，常見的富集分離方法中，傳統(tǒng)固相萃取柱如硅膠鍵合C8，其富集分離PCs的回收率不高且操作繁瑣[5]。沸石咪唑酯骨架結(jié)構(gòu)材料(zeolitic imidazolate frameworks, ZIFs)結(jié)合了無機(jī)沸石的高穩(wěn)定性和金屬有機(jī)骨架材料的孔隙率高、比表面積大等優(yōu)點(diǎn)，是一種非常有潛力的高效吸附劑[6-8]。

該研究通過合成ZIFs磁性復(fù)合材料：Fe3O4@ZIF-67[9]，并將其作為磁性分散微固相萃取(dispersive micro-solid phase extraction，DMSPE)吸附劑，結(jié)合液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(liquid chromatography-tandem mass spectrometry, LC-MS/MS)測(cè)定水樣中6種PCs殘留。對(duì)基于Fe3O4@ZIF-67的磁性DMSPE富集水樣中6種PCs的富集效率、影響機(jī)理及影響因素進(jìn)行了探討。

1 材料與方法

1.1 化學(xué)試劑FeCl3·6H2O、NaHCO3、L-抗壞血酸、Co(NO3)2·6H2O、2-甲基咪唑(純度≥98%，購(gòu)自上海阿拉丁試劑有限公司)；鹽酸(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為36%)、氨水(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為28%，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑廠)；無水乙醇、甲醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯(色譜純，購(gòu)自美國(guó)TEDIA公司)；超純水均為本實(shí)驗(yàn)室自制。 阿莫西林(amoxicillin，AML)、氨芐西林(ampicillin，AMP)、青霉素V(penicillin V，PNV)、苯唑西林(oxacillin，OX)、氯唑西林(cloxacillin，OB)、雙氯西林(dicloxacillin，DX)標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%，購(gòu)自德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司)。標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：準(zhǔn)確稱取6種PCs標(biāo)準(zhǔn)品各5 mg(精確至0.01 mg)，用乙腈定容到50 ml的棕色容量瓶中，作為儲(chǔ)備液。工作溶液和混標(biāo)溶液用超純水將儲(chǔ)備液稀釋至所需濃度來制備。在-4 ℃下避光保存。Fe3O4@ ZIF-67根據(jù)唐祝興 等[9]的方法合成。

1.2 儀器條件6種PCs通過配備Eclipse XDB-C18柱(3.5 μm，2.1 mm×150 mm)的HPLC-MS/MS(型號(hào)：4000，購(gòu)自美國(guó) AB SCIEX公司)進(jìn)行檢測(cè)。柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量:10 μl。流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為0.1%甲酸水溶液；洗脫梯度：0.00～3.00 min，95% B；3.01～13.00 min，50% B；13.01～16.00 min，25% B；16.01～20.00 min，95% B。流速:0.3 ml/min。檢測(cè)模式：電噴霧源(ESI)正模式；離子源溫度：400 ℃；電噴霧電壓：5 500 V；霧化氣電壓：0.055 MPa；氣簾氣壓力：0.079 MPa；輔助氣流速：6 L/min；聚焦電壓：90 V；碰撞室出口電壓：10 V；采集方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)。表1為優(yōu)化的質(zhì)譜參數(shù)。

使用透射電子顯微鏡(transmission electron microscope，TEM，型號(hào)：JEM-2010)、掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope，SEM，型號(hào)：JSM-6480LV)均購(gòu)自日本電子株式會(huì)社，表征Fe3O4納米顆粒與Fe3O4@ZIF-67的形態(tài)。使用自動(dòng)比表面積和孔徑分布分析儀(型號(hào)：Autosorb-iQ，購(gòu)自美國(guó)Quantachrome公司)測(cè)定Fe3O4@ZIF-67的BET比表面積和平均孔徑。使用能量色散X射線光譜儀(energy dispersive X-ray spectroscopy，EDS)(型號(hào)：IE 300 X，購(gòu)自日本電子株式會(huì)社)對(duì)Fe3O4@ZIF-67進(jìn)行元素分析。

表1 6種PCs的質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)參數(shù)

1.3 Fe3O4@ZIF-67對(duì)PCs藥物的DMSPE條件實(shí)驗(yàn)

1.3.1吸附劑用量實(shí)驗(yàn) 取10、15、20、25 mg Fe3O4@ZIF-67，分別加入到含有每種PCs 500 ng的50 ml河水樣品中，渦旋(2 000 r/min)10 min，將磁鐵放在離心管的底部以聚集并分離Fe3O4@ZIF-67，以HPLC-MS/MS測(cè)定吸附后的樣品溶液中PCs的含量。通過已吸附的PCs的量與樣品溶液中的初始含量的比值來計(jì)算萃取效率(R)[10]。

1.3.2萃取時(shí)間實(shí)驗(yàn) 取10 mg的Fe3O4@ZIF-67加入到50 ml河水加標(biāo)樣品中(每種PCs 500 ng)。渦旋提取，采樣間隔設(shè)置為0、1、3、5、7、10、15、20、30、60 min，磁鐵分離后，測(cè)定樣品溶液中PCs的濃度，計(jì)算萃取效率，確定最佳萃取時(shí)間。

1.3.3樣品溶液pH 在樣品溶液中加入甲酸或氨水溶液，調(diào)節(jié)樣品溶液的pH 3.0～9.0之間，渦旋提取10 min。其他條件同“1.3.2”項(xiàng)，計(jì)算不同pH下的萃取效率。

1.3.4洗脫條件實(shí)驗(yàn) 10 mg的 Fe3O4@ZIF-67，加入到50 ml河水加標(biāo)樣品中，調(diào)節(jié)樣品溶液的pH在6.0，渦旋提取10 min，磁鐵分離后，用2 ml不同的洗脫溶劑[乙腈、甲醇 ∶乙腈(V ∶V，1 ∶1)和甲醇]洗脫P(yáng)Cs，共洗脫2次。渦旋2 min。合并2次洗脫液，使用氮?dú)獯抵粮稍铮? ml乙腈 ∶0.1%甲酸水溶液(V ∶V，5 ∶95)定容后，過0.22 μm濾膜進(jìn)樣。計(jì)算不同洗脫液的萃取效率。

1.4 基于Fe3O4@ZIF-67的DMSPE富集水樣中的PCs所有的水樣包括飲用水、河水、養(yǎng)殖水、池塘水收集于本地。取50 ml水樣過0.22 μm的濾膜，調(diào)節(jié)pH調(diào)節(jié)至6.0。加入10 mg Fe3O4@ZIF-67，渦旋10 min，磁鐵分離Fe3O4@ZIF-67。用2 ml甲醇溶液從Fe3O4@ZIF-67中洗脫P(yáng)Cs，共洗脫2次，渦旋2 min。磁鐵分離后，合并萃取液并使用氮?dú)獯抵粮稍?，加? ml乙腈 ∶0.1%甲酸水溶液(V ∶V ，5 ∶95)，渦旋1 min后過0.22 μm濾膜，供HPLC-MS/MS檢測(cè)。

1.5 基質(zhì)效應(yīng)將空白河水樣品、空白養(yǎng)殖水樣按照上述前處理方法處理后，用空白基質(zhì)溶液配制濃度為1.0、10.0、100.0 μg/L的PCs樣品溶液，通過比較含有樣品基質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)化合物的峰面積和溶解在純?nèi)軇┲械臉?biāo)準(zhǔn)化合物的峰面積之比來計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)(matrix effects ,MEs)[11]。相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviations，RSD)用于檢驗(yàn)分析結(jié)果的精密度：

數(shù)據(jù)用Excel軟件進(jìn)行初步處理，然后采用SPSS18.0軟件進(jìn)行單因素方差（One-Way ANOVA）分析，Duncan's法進(jìn)行多重比較，以P＜0.05表示差異顯著。試驗(yàn)數(shù)據(jù)及結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

1.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線采用外標(biāo)法定量，配制8個(gè)濃度為1.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0、200.0、400.0 μg/L 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，以濃度對(duì)峰面積作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以3倍信噪比(S/N=3)和10倍的信噪比(S/N=10)來計(jì)算水樣中的6種PCs的檢測(cè)限 (limits of detection, LOD)和定量限 (limits of quantitation, LOQ)。

2 結(jié)果

2.1 Fe3O4及Fe3O4@ZIF-67的表征Fe3O4納米顆粒的粒徑約5～10 nm，顆粒團(tuán)聚但顆粒間有界限。見圖1A。修飾后的Fe3O4@ZIF-67粒徑約為500～600 nm，有具有核殼結(jié)構(gòu)。見圖1B。Fe3O4@ZIF-67的SEM圖(圖1C)可以看出材料表面具有ZIF-67特征的十二面體結(jié)構(gòu)，由ZIF-67殼包裹著團(tuán)聚的Fe3O4核組成。表征結(jié)果顯示ZIF-67成功接枝在磁性Fe3O4顆粒上，形成了粗糙的表面。Fe3O4@ZIF-67的EDS元素分析圖(圖1D)表明，材料中主要含有C、Co、N、O和Fe元素。Fe3O4@ZIF-67的BET比表面積檢測(cè)結(jié)果為841.7 m2/g，平均孔徑3.37 nm。該材料的比表面積大，孔徑較小，可為PCs的吸附提供了豐富的吸附位點(diǎn)。

圖1 Fe3O4和Fe3O4@ZIF-67表征圖

2.2 基于磁性Fe3O4@ZIF-67的DMSPE提取PCs的條件優(yōu)化

2.2.1吸附劑用量的影響 吸附劑用量為10 mg時(shí)，6種PCs的萃取效率為90.2%～96.8%，吸附劑用量增加至25 mg時(shí)，萃取效率無明顯變化。

2.2.2萃取時(shí)間的影響 萃取時(shí)間從1 min變化到10 min時(shí)，6種PCs的回收率隨著萃取時(shí)間的增加逐漸增加，在1 min時(shí)，回收率低于80%，而10 min時(shí)6種PCs的回收率均能達(dá)到90%以上，并隨著時(shí)間的增加無明顯變化(圖2A)。

2.2.3pH值的影響 在樣品溶液pH 3.0～9.0范圍內(nèi)時(shí)，6種PCs的回收率呈現(xiàn)了先增加后減少的趨勢(shì)。從pH 3.0到6.0，回收率從78.8%～89.0%增加到90.3%～97.5%。pH進(jìn)一步增加，回收率緩慢下降。pH為6.0時(shí)回收率最高。見圖2B。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)采用基質(zhì)效應(yīng)來定量的評(píng)價(jià)DMSPE方法的凈化效果以及樣品中的共萃雜質(zhì)對(duì)質(zhì)譜響應(yīng)的影響。如表2所示，在3個(gè)濃度水平下，河水和養(yǎng)殖水中的6個(gè)PCs的MEs分別為90.3%～102.2%和 89.6%～105.6%。MEs的結(jié)果顯示采用本方法提取后，水樣中可能的共萃雜質(zhì)對(duì)質(zhì)譜響應(yīng)影響較小。

圖2 萃取時(shí)間與pH值對(duì)PCs的萃取效率的影響

表2 不同濃度下河水樣品與養(yǎng)殖水樣品中Fe3O4@ZIF-67對(duì)6種PCs的基質(zhì)效應(yīng) (n=3，μg/L)

圖3 空白河水樣品中添加濃度為0.1 μg/L的PCs的提取離子流色譜圖

2.4 方法驗(yàn)證外標(biāo)法標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的6種PCs的線性相關(guān)系數(shù)R2為0.999 1～0.999 9，在1.0～400.0 μg/L濃度范圍內(nèi)顯示了良好的線性關(guān)系。水樣中6種PCs的LOD為0.01～0.06 μg/L，LOQ為0.03～0.19 μg/L(表3)。在河水和養(yǎng)殖水中分別添加濃度為0.1、1.0、10.0 μg/L 3個(gè)水平的PCs，并計(jì)算添加回收率，結(jié)果列于表3，在河水和養(yǎng)殖水中6種PCs的平均回收率分別為79.2%～96.6%和75.9%～94.8%。空白河水中添加濃度為0.1 μg/L的PCs的提取離子流色譜圖見圖3，在低濃度水平下可得到良好的質(zhì)譜響應(yīng)。

3 討論

對(duì)基于磁性Fe3O4@ZIF-67的DMSPE提取PCs的條件進(jìn)行優(yōu)化。萃取時(shí)間、樣品溶液的pH、洗脫溶液均影響著PCs的萃取效率。采用渦旋萃取時(shí)，PCs在吸附劑材料表面的吸附到10 min時(shí)可達(dá)到萃取平衡，低于10 min無法達(dá)到吸附平衡。由于PCs中含有β-內(nèi)酰胺環(huán)，而ZIF-67為CoN4四面體和μ2-橋接的咪唑基連接組成，因此PCs與Fe3O4@ZIF-67之間的作用力推測(cè)主要來源于β-內(nèi)酰胺環(huán)上N、O原子與咪唑環(huán)之間的氫鍵作用力以及疏水作用力，溶液的pH值會(huì)影響PCs和Fe3O4@ZIF-67的表面電荷及密度，進(jìn)而影響到化合物和吸附劑之間的氫鍵作用力和萃取效率。在pH 3.0～9.0范圍內(nèi)，6種PCs的萃取呈現(xiàn)先增加后減弱的趨勢(shì)，但增加和減弱的幅度不大。這可能是由于PCs和吸附之間以疏水作用力占主，氫鍵作用力為次。而pH值主要影響氫鍵作用力，因此對(duì)萃取效率的影響并不大?？紤]到在pH為6.0時(shí)，萃取效率比其他pH值條件下稍高。選擇樣品溶液的pH值為6.0。由于Fe3O4@ZIF-67比表面積大，在吸附劑用量從10 mg增加至25 mg，6種PCs的萃取效率無明顯變化。10 mg的Fe3O4@ZIF-67可足夠吸附濃度水平為10 μg/ml的50 ml水樣中PCs，這是由于吸附劑的比表面積大，吸附容量高。洗脫溶液使用甲醇洗脫的效果優(yōu)于乙腈和甲醇∶乙腈(V∶V，1∶1)。這可能是因?yàn)镻Cs是偏極性化合物，而甲醇的極性比乙腈好，洗脫效果更佳。因此2×2 ml甲醇作為洗脫劑。

表3 河水和養(yǎng)殖水樣品中6種PCs的平均回收率, RSD、LOD和LOQ(n=6)

方法驗(yàn)證的結(jié)果顯示1.0～400.0 μg/L的濃度范圍內(nèi)，6種PCs具有良好的線性關(guān)系。在不同水樣中三個(gè)添加濃度水平下，可以獲得滿意的回收率，得到較低LOD與LOQ，能夠滿足水中痕量污染物分析的要求。

以上研究說明，基于Fe3O4@ZIF-67的DMSPE方法簡(jiǎn)單快速、萃取效率高、重復(fù)性好、吸附容量高，結(jié)合LC-MS/MS可實(shí)現(xiàn)對(duì)水中6種PCs的同時(shí)快速靈敏的檢測(cè)。本研究建立的磁性DMSPE方法進(jìn)一步拓展了ZIFs材料在飲用水樣品與環(huán)境水樣品中有機(jī)污染物前處理分析中的應(yīng)用。