□ 張倩瑤 梁世君 桐廬縣檢驗檢測中心

大豆糖蜜的主要成分是糖，含量在58%～65%，包括低聚糖、二糖和少量單糖。次要成分包括蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、礦物質(zhì)、大豆皂苷（6%～15%）、大豆異黃酮（0.8%～2.5%）和其他有機成分，包括酚酸，無色花青素等[1]。

異黃酮僅存在于豆科的蝶形花亞科[2]等少數(shù)植物中。目前鑒于異黃酮具有雌激素類性質(zhì)，因?qū)θ梭w健康有益而被廣泛關注[3]。大豆糖蜜作為異黃酮的豐富來源，關于其的提取與富集研究文獻主要是一些專利，國內(nèi)相關的研究報道還不是很多[4]。

大豆皂苷毒副作用很小，并且具有很多有益的生理功能[5]。隨著大豆皂苷在食品領域應用的增加和其眾多的有益生理功效，其商業(yè)價值正逐漸得到人們的重視，這也就促進了對大豆皂苷產(chǎn)品生產(chǎn)提取工藝的研究。

超聲輔助提取技術的原理是超聲波傳播過程中產(chǎn)生的強烈空化、擾動效應，可增大提取溶劑中物質(zhì)分子運動頻率和速度，增強溶劑穿透力，從而加速提取溶劑中的目標成分進入溶劑，促進提取的進行。目前，超聲輔助提取技術被廣泛應用于油脂提取、食品添加劑、食品原料中活性成分[6]和糖類物質(zhì)等的提取分離。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

大豆異黃酮標準品（純度99.9%，購于sigma 公司），大豆糖蜜由山東萬德福實業(yè)集團有限公司提供，Waters 600 高效液相色譜儀（美，Waters 公司），臺式離心機TPL—5（上海安亭科學儀器廠），KJ—300 超聲波發(fā)生器（無錫市科潔超聲電子設備有限公司），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 RE—52（上海亞榮生化儀器廠）。

1.2 實驗方法

大豆糖蜜（粘稠液體狀）經(jīng)過稀釋、酸沉、離心后得到大豆糖蜜沉淀，沉淀經(jīng)冷凍干燥后得到大豆糖蜜沉淀干粉，為實驗原料。

大豆皂苷含量的測定：香草醛—高氯酸法[7]。

大豆異黃酮總量測定：外標法，HPLC法[8]，反向色譜柱，C18柱250 mm×4.6 mm×5 μm；流動相，A 相：三氟乙酸—乙腈溶液，三氟乙酸體積分數(shù)為0.5%；B 相：三氟乙酸水溶液（三氟乙酸體積分數(shù)0.05%）；檢測器類型：紫外檢測器；測定波長，254 nm；色譜柱溫度，34 ℃；洗脫方式：梯度洗脫；流速，1 mL/min；進樣量，20 μL。

脂類測定：氯仿甲醇法[9]。

總糖含量測定：苯酚—硫酸法[10]。

1.2.1 超聲輔助提取異黃酮

準確稱取一定量的經(jīng)冷凍真空干燥后的大豆糖蜜沉淀粉末，按照一定的料液比加入90%丙酮—水溶液，在設定溫度下經(jīng)超聲提取一段時間后，過濾，濾渣再用相同體積分數(shù)溶液在普通磁力攪拌下提取1 h，合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去丙酮，測定其異黃酮總量，3 次重復。分別考察超聲功率(超聲頻率為20 kHz)、料液比、提取時間對提取效果的影響，得到最佳的超聲輔助提取條件。

1.2.2 回流提取皂苷

提取異黃酮后的濾渣，改變丙酮和水比例，調(diào)節(jié)pH 值，在一定溫度下，加熱回流提取皂苷，濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去丙酮，測皂苷含量。

1.2.3 提取率和純度的計算

提取率和純度按照公式（1）和(2)計算。

2 結(jié)果與討論

2.1 大豆糖蜜沉淀成分分析

由表1 可以看出，大豆糖蜜經(jīng)酸沉后，異黃酮和皂苷的含量（一般糖蜜中異黃酮含量為0.8%～2.5%，皂苷含量為6%～15%）有所上升。這主要是由于大豆糖蜜中含有大量的碳水化合物，主要是一些水溶性的糖類，而低聚糖和單糖、雙糖等是不帶電荷的，所以在酸性條件下不會沉淀下來。皂苷和異黃酮以及大部分磷脂、植酸、酚酸等分子帶負電荷，在酸性條件下因形成聚集體而沉淀下來，從而實現(xiàn)了初步富集。酸沉沉淀中，異黃酮和皂苷含量高，適合作為提取異黃酮和皂苷的原料。

表1 大豆糖蜜沉淀成分分析

2.2 超聲功率對異黃酮提取率的影響

準確稱取糖蜜沉淀干粉6 份，每份10 g，按照料液比1 ∶10 加入一定體積分數(shù)的丙酮水溶液，室溫條件下，在頻率20 kHz，不同功率條件下超聲30 min，除去丙酮，測定提取液中的異黃酮總量。比較超聲功率對異黃酮提取率的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 超聲功率對異黃酮提取率的影響

由圖1 可以看出，當超聲功率在150 W 時，異黃酮的提取率達到最大，過高和過低都會降低異黃酮的提取率。這可能是由于超聲功率越低，超聲產(chǎn)生的機械作用越弱，而功率過高時，產(chǎn)生的空化效應弱，有效成分的溶出不充分，在空化作用的最佳結(jié)合點上，有效成分溶出最完全，總異黃酮提取率最大[11]。因而確定150 W 為適宜的提取功率。

2.3 超聲時間對異黃酮提取率的影響

準確稱取糖蜜沉淀干粉6 份，每份10 g，按照料液比1 ∶10 加入一定體積分數(shù)的丙酮水溶液，室溫條件下，頻率20 kHz，功率150 W 條件下超聲不同時間，除去丙酮，測定提取液中異黃酮總量。比較超聲時間對異黃酮提取率的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 超聲時間對異黃酮提取率的影響

由圖2 可以看出，隨著超聲時間的增加，異黃酮提取率呈上升趨勢，但在30 min 后，異黃酮提取率隨著提取時間的增加而呈下降趨勢。造成異黃酮提取率下降的原因可能是在長時間超聲作用下，丙二?；蠖管盏幕钚曰鶊F遭到破壞，降解為糖苷型異黃酮，糖苷型異黃酮的羥基也容易發(fā)生反應而被破壞，降低了總異黃酮含量，從而提取率呈降低趨勢。這在不同時間提取液中異黃酮的HPLC 圖譜中也可以看出。

國外文獻中也有報道提出，在提取異黃酮時，長時間的超聲會造成羥自由基發(fā)生反應，從而使目標產(chǎn)物發(fā)生降解[12]。因此30 min 是能達到較高異黃酮提取率的最佳時間。

2.4 料液比對異黃酮提取率的影響

準確稱取糖蜜沉淀干粉5 份，每份10 g，按照不同料液比加入一定體積分數(shù)的丙酮水溶液，室溫條件下，頻率20 kHz，不同功率條件下超聲30 min，濾液除去丙酮，測定提取液中異黃酮總量。比較超聲功率對異黃酮提取率的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 料液比對異黃酮提取率的影響

由圖3 可以看出，隨著料液比的增加，異黃酮提取率逐漸增加，但1 ∶20 與1 ∶30 的提取率相差不大，提取液用量大也會相應的增加成本，所以選用1 ∶20 的料液比作為超聲提取的最佳料液比。

2.5 異黃酮和皂苷提取工藝條件的確定

丙酮是一種弱極性有機溶劑，對異黃酮有較高的溶解度[13]。而皂苷的分子量較大，極性大，易溶于極性較大的溶劑中。所以可以通過控制調(diào)節(jié)丙酮和水的比例以及調(diào)節(jié)不同的pH 值，分步提取異黃酮和皂苷，得到兩者的粗品，為下一步的分離純化提供方便。得出的具體工藝流程和工藝條件見圖4。

圖4 提取異黃酮和皂苷的工藝流程

2.6 最佳工藝條件下提取異黃酮和皂苷

在最佳工藝條件下分步提取得到異黃酮和皂苷粗品，分別旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去丙酮后凍干樣品，測定粗品的質(zhì)量以及異黃酮和皂苷的含量，并計算得到異黃酮粗品和皂苷粗品中異黃酮和皂苷的純度以及提取率，如表2。

3 結(jié)論

本文研究了用丙酮水溶液作為提取溶劑，超聲輔助提取，后加熱回流提取異黃酮和皂苷，得到了較高提取率和純度的異黃酮和皂苷粗品。

1.一定比例的丙酮水溶液作為異黃酮的良好溶劑，在超聲輔助提取下，異黃酮的提取率達到85.96%，純度為11.48%。

表2 異黃酮和皂苷的提取率與純度

2.改變丙酮和水的比例，調(diào)節(jié)pH值，將濾渣進一步提取，可達到提取率為 76.91%，純度為57.80%的皂苷粗品。

3.提取溶劑丙酮可回收再利用，對環(huán)境污染小，兩次分步提取可得到異黃酮和皂苷粗品，工藝過程簡單，提取率高，可進行大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。