華金仁 鄭 芳 程慧明 潘 玫

江西省婦幼保健院，江西省南昌市 330006

葡萄胎是一種常見良性滋養(yǎng)細胞疾病，存在惡變傾向，臨床極易因治療不當或其他因素，致使葡萄胎轉(zhuǎn)變?yōu)榻q毛膜癌或侵蝕性葡萄胎，影響患者生命健康[1]。目前認為，妊娠滋養(yǎng)細胞腫瘤一個重要特征為腫瘤細胞破壞力強、經(jīng)血行轉(zhuǎn)移時間早，故早期預(yù)防、治療葡萄胎惡變至關(guān)重要[2]。葡萄胎惡變影響因素較多，包括年齡、孕次、先行妊娠間隔時間等。近年來，研究發(fā)現(xiàn)印跡基因可經(jīng)單親傳遞某些遺傳性狀，對胎兒及胎盤正常發(fā)育、細胞分化及增殖產(chǎn)生影響[3]。而胰島素樣生長因子2(IGF2)基因?qū)儆谟≯E基因研究史上最早被發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性印跡基因。H19是目前唯一發(fā)現(xiàn)的不表達蛋白質(zhì)而在mRNA水平上發(fā)揮作用的印跡基因。目前，臨床就葡萄胎惡變與印跡基因H19和IGF2表達相關(guān)性研究仍較少。本研究重點分析了葡萄胎惡變與印跡基因H19和IGF2表達的關(guān)系，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 隨機選取2016年9月—2018年9月本院78例葡萄胎患者。納入標準：(1)符合《婦產(chǎn)科學(xué)》[4]中葡萄胎診斷標準，經(jīng)胸片、B超或術(shù)后病理等檢查確診為良性葡萄胎；(2)可獲得首次清宮新鮮葡萄胎組織；(3)臨床資料完整。排除標準：(1)既往有清宮術(shù)史；(2)葡萄胎排出前存在陰道轉(zhuǎn)移或肺轉(zhuǎn)移；(3)有家族性葡萄胎史。其中，年齡20～39歲，平均年齡(28.21±6.23)歲；孕次1～4次，平均孕次(2.85±0.74)次；產(chǎn)次0～3次，平均產(chǎn)次(1.26±0.64)次；完全性葡萄胎28例，部分性葡萄胎50例。

1.2 方法

1.2.1 儀器與試劑：儀器包括日本Thermo公司提供的臺式低溫微量高速離心機、江蘇蘇州凈化設(shè)備廠提供的超凈工作臺、美國Bio-Rad公司提供的分光光度儀及PCR儀、德國Sartorius公司提供的凝膠成像系統(tǒng)等。試劑包括上海金穗生物有限公司提供的無水乙醇、南京金斯瑞生物科技有限公司提供的H19、IGF2引物等。

1.2.2 實驗方法：取25～50mg新鮮葡萄胎組織，以1ml DNAiso Reagent滴入，勻漿，至無塊狀沉淀，室溫下靜置5min。離心，10min，取上清液。加入DNAiso Reagent 1/2體積量無水乙醇，觀察出現(xiàn)云霧狀DNA沉淀，倒出上清液，離心管底部留DNA沉淀。以75%乙醇1ml滴入，上下顛倒，離心，棄乙醇。去乙醇后基因組DNA沉淀室溫下干燥，持續(xù)30s；滅菌水溶解，置于-80℃冰箱備用。以分光光度儀檢測DNA濃度(OD 260nm×50×0.04)、純度(OD 260nm/OD 280nm)。設(shè)計H19、IGF2引物，經(jīng)BLASH驗證。H19 PCR反應(yīng)儀95℃預(yù)變形，持續(xù)5min；95℃變性，持續(xù)30s；61℃退火，持續(xù)30s；72℃延伸，持續(xù)10s。共35個循環(huán)，4℃。IGF2 PCR反應(yīng)儀95℃預(yù)變形，持續(xù)5min；95℃變性，持續(xù)30s；58℃退火，持續(xù)30s；72℃延伸，持續(xù)10s。共35個循環(huán)，72℃延伸，持續(xù)5min，4℃。混勻1μl 6×DNA上樣緩沖液、5μl PCR液，上樣于3%瓊脂糖凝膠，電泳，EB染色，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察。H19陽性為出現(xiàn)397bp擴增條帶，僅出現(xiàn)397bp為a型等位基因表達，僅出現(xiàn)168bp或229bp為b型等位基因表達，出現(xiàn)397bp、168bp、229bp為ab型等位基因表達。IGF2陽性為出現(xiàn)236bp擴增條帶，僅出現(xiàn)236bp為a型等位基因表達，僅出現(xiàn)173bp為b型等位基因表達，出現(xiàn)236bp、173bp為ab型等位基因表達。

1.2.3 隨訪：清宮術(shù)后每隔3個月隨訪1次，共12個月。觀察葡萄胎惡變率，惡變采用有無陰道異常流血、婦科檢查、胸片、盆腔彩超等檢查確診。隨訪結(jié)束時，惡變19例，未惡變59例。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 以SPSS20.0軟件分析所得數(shù)據(jù)。計數(shù)資料以χ2檢驗對比。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 H19基因在葡萄胎組織中等位基因表達 兩組H19DNA基因型、RNA等位基因表達對比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 H19基因在葡萄胎組織中等位基因表達分析[n(%)]

2.2 IGF2基因在葡萄胎組織中等位基因表達 兩組IGF2DNA基因型、RNA等位基因表達對比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 IGF2基因在葡萄胎組織中等位基因表達分析[n(%)]

3 討論

妊娠滋養(yǎng)細胞疾病在臨床上較為常見，主要源自胎盤滋養(yǎng)細胞，且涉及類型較多，包括葡萄胎、胎盤部位滋養(yǎng)細胞腫瘤等，其中葡萄胎最為常見。葡萄胎雖屬于良性病變，但也存在一定惡變傾向。據(jù)調(diào)查，50%左右絨毛膜癌、侵蝕性葡萄胎由葡萄胎惡變所致[5]，而早期預(yù)測、診斷葡萄胎惡變，對指導(dǎo)治療方案制定，改善預(yù)后，具有重要價值[6]。印跡基因是僅表達某一親本來源的等位基因，在遺傳性疾病、腫瘤發(fā)生及發(fā)展中發(fā)揮一定作用。

H19、IGF2為目前被較好認知的印跡基因類型，屬同一個基因印跡群。其中，H19基因?qū)儆谀冈葱杂≯E基因，有一酶切位點RSAI，而IGF2屬于父源性印跡基因，有一酶切位點APAI。當樣本為純合子時，較難準確鑒別是單等位基因表達還是雙等位基因表達，故臨床采用RFLP技術(shù)進行印跡狀態(tài)研究時，需先明確基因型，選取雜合子，以確定基因印跡表達。目前認為，印跡基因表達改變在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中有一定作用，而基因甲基化是影響基因印跡改變的重要因素，多出現(xiàn)在生殖細胞分裂時。但臨床就葡萄胎惡變中H19、IGF2表達改變有無關(guān)聯(lián)仍無明確結(jié)論，且相關(guān)研究較少。本研究就該問題進行分析，自表1、表2可以看出，葡萄胎惡變與未惡變患者兩種印跡基因DNA基因型、RNA等位基因表達均無顯著差異，推測H19、IGF2基因表達與葡萄胎惡變無明顯相關(guān)性，但本研究并未明確相關(guān)具體機制，今后仍需加大研究力度，進行更深層次調(diào)查分析。

綜上所述，H19、IGF2基因表達與葡萄胎惡變無明顯相關(guān)性，但相關(guān)具體機制仍未明確，今后仍需大量研究。