趙明迪，范春玲，周玉龍，孫斌，郭東華，原冬偉，吳海燕，崔超偉，燕傳利

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，大慶 163319；2.黑龍江省青龍山農(nóng)場(chǎng)；3.山東省廣饒縣畜牧局）

化膿隱秘桿菌（Trueperella pyogenes），于1893年首次發(fā)現(xiàn)，原稱(chēng)化膿棒狀桿菌（Corynebacterium pyogenes），化膿放線菌（Actinomyces pyogenes），1997年pascual Ramos et.al 將該菌從放線菌屬中重新分類(lèi)為隱秘桿菌屬[1-2]。2011 年對(duì)化膿隱秘桿菌基于16 SrrNA 的系統(tǒng)進(jìn)化分析、磷脂組成和維生素K2 的存在與否等把A.pyogenes 被重新命名為T(mén)rueperella pyogenes（T.pyogenes），歸屬于Trueperella 屬。

化膿隱秘桿菌在隱秘桿菌屬中致病性最強(qiáng)，同時(shí)也是一種條件性致病菌，化膿隱秘桿菌不僅感染牛羊豬等經(jīng)濟(jì)類(lèi)動(dòng)物，同時(shí)也會(huì)感染貓，狗，兔，狐貍，猴，鵝，鴨等其他動(dòng)物，王一涵等[3]從豬呼吸道分離鑒定出化膿隱秘桿菌。王丹[4]從奶牛乳房炎病例中分離出化膿隱秘桿菌。李章程等[5]在山羊皮下膿腫病料采集中分離出化膿隱秘桿菌。楊樂(lè)等[6]從病牛病料中分離出化膿隱秘桿菌。王居海等[7]從犢?；撔苑窝字蟹蛛x出化膿隱秘桿菌。趙克雷等[8]在林麝膿灶中分離出化膿隱秘桿菌?；撾[秘桿菌不僅能感染各類(lèi)動(dòng)物，隨著近年來(lái)化膿隱秘桿菌的報(bào)道，也出現(xiàn)人類(lèi)感染化膿隱秘桿菌的病例，Gomez-Mateos J，et al[9]在心內(nèi)膜炎病例中分離出化膿隱秘桿菌，并確定化膿隱秘桿菌為主要病原菌。魏緒廷等[10]從糖尿病患者背痛引流中分流出化膿隱秘桿菌。也有人感染化膿隱秘桿菌的病例，是一種重要的人獸共患病。近年來(lái)，雖然對(duì)化膿隱秘桿菌有一定的研究，但化膿隱秘桿菌的致病機(jī)理尚不明確并缺乏有效的治療手段與預(yù)防機(jī)制，長(zhǎng)期以來(lái)對(duì)我國(guó)的養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失并威脅人類(lèi)的健康與安全。

化膿隱秘桿菌為革蘭氏陽(yáng)性菌種，且不易染色，具有多形性，多呈逗號(hào)狀、弧形或者短桿狀，無(wú)莢膜和芽孢，菌體著色不均，常散在，也有呈叢或2～4 個(gè)并列排列[3]?；撾[秘桿菌的生長(zhǎng)溫度為20～40 ℃，其中最適宜生長(zhǎng)溫度為37 ℃。好氧或兼性好氧，在5%～10% CO2環(huán)境條件下或添加血液、血清可促進(jìn)其生長(zhǎng)?；撾[秘桿菌在血瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)24～48 h后可形成針尖狀、表面光滑的、灰白色、直徑1 mm 的菌落，并且在菌落周?chē)纬搔?溶血環(huán)。

化膿隱秘桿菌能引起化膿隱秘桿菌病，自化膿隱秘桿菌于1983 年首次發(fā)現(xiàn)以來(lái)，世界各地相機(jī)發(fā)現(xiàn)此病菌，近年來(lái)發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，化膿隱秘桿菌常引起?；撾[秘桿菌肺炎，臨床癥狀常以咳嗽、流膿性鼻汁、化膿性肺炎，以及關(guān)節(jié)炎為主。其他動(dòng)物感染化膿隱秘桿菌常引起心內(nèi)膜炎、肝臟膿腫、乳腺炎、子宮內(nèi)膜炎、骨髓炎、流產(chǎn)、子宮感染而導(dǎo)致的不育與精囊炎等癥狀。給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了一定的經(jīng)濟(jì)損失，目前化膿隱秘桿菌的致病機(jī)理尚不明確，所以給治療與防控化膿隱秘桿菌造成了一定的困難。為了研究化膿隱秘桿菌的致病性，與免疫性，生長(zhǎng)曲線與毒力測(cè)定是重要的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)采用BHI 液體培養(yǎng)基對(duì)化膿隱秘桿菌HJ-1 進(jìn)行培養(yǎng)，通過(guò)測(cè)定生長(zhǎng)曲線對(duì)化膿隱秘桿菌HJ-1 的生長(zhǎng)規(guī)律進(jìn)行了解，同時(shí)測(cè)定化膿隱秘桿菌HJ-1 菌株對(duì)小鼠的半數(shù)致死量，為后續(xù)化膿隱秘桿菌的疫苗研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

化膿隱秘桿菌HJ-1 型由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)周玉龍老師惠贈(zèng)。黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)獸醫(yī)預(yù)防實(shí)驗(yàn)室保存。6 周齡SPF 級(jí)昆明小鼠，雌性，體重18～22 g，購(gòu)自遼寧省長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司。

1.1.2 主要試劑

革蘭氏染色液試劑盒購(gòu)。腦心浸液（BHI）液體培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂、優(yōu)質(zhì)胎牛血清、血液營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂、普通肉湯、血液營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板。

1.1.3 主要儀器

ZHJH-1112 超凈工作臺(tái)，BXP-280S 微生物培養(yǎng)箱，MLS-3750 高壓滅菌器，MoticBS 光學(xué)顯微鏡及成像系統(tǒng)，UV-2600 分光光度計(jì)，TG16 離心機(jī)，HZ80恒溫?fù)u床。

1.2 方法

1.2.1 化膿隱秘桿菌HJ-1 型的純化培養(yǎng)

將實(shí)驗(yàn)室保存的化膿隱秘桿菌HJ-1 型株使用無(wú)菌接菌環(huán)，三線法接種到血液營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，放置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，當(dāng)血液營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上出現(xiàn)β-溶血環(huán)和透明針尖樣菌落，挑取單菌落接種于5%血清的BHI 液體培養(yǎng)基中，置于37 ℃恒溫?fù)u床，培養(yǎng)30～48 h，觀察BHI 液體培養(yǎng)基渾濁度。

1.2.2 化膿隱秘桿菌HJ-1 型生化鑒定

取BHI 液體培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌液1 mL，12 000 rpm離心3 min，棄去上清液，用無(wú)菌接菌環(huán)勾取沉淀物進(jìn)行涂片并進(jìn)行革蘭氏染色。準(zhǔn)備干凈載玻片，并用95%酒精擦凈，紗布擦干，取生理鹽水滴與載玻片上，用無(wú)菌接菌環(huán)將菌落沉淀均勻涂勻，使其成為均勻的薄層。將載玻片涂面向上，背面在酒精燈的火焰上反復(fù)通過(guò)幾次進(jìn)行固定。初染：滴加草酸銨結(jié)晶紫，以剛好將涂菌區(qū)覆蓋為好，染色2 min，水洗。媒染：用碘液沖去殘留的水，并用碘液覆蓋2 min，水洗。脫色：棄去載玻片上殘留的水，用滴管滴加95%的乙醇充分覆蓋，脫色30 s，迅速水洗。復(fù)染：棄去載玻片上殘留的水，滴加復(fù)紅染液，使其完全覆蓋2 min，水洗，用濾紙吸干。使用顯微鏡油鏡對(duì)細(xì)菌的形態(tài)與特征進(jìn)行觀察并取菌液進(jìn)行細(xì)菌生化鑒定實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 化膿隱秘桿菌HJ-1 型生長(zhǎng)曲線的測(cè)定及細(xì)菌計(jì)數(shù)

將化膿隱秘桿菌HJ-1 型純培養(yǎng)后，取37 ℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)48 h 的化膿隱秘桿菌HJ-1 型菌液，按1%的比例接種到30 mL 5% BHI 液體培養(yǎng)基中，于37 ℃80 rpm 恒溫培搖床中培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24 h 各時(shí)間點(diǎn)取菌液1 mL，并以5%BHI 液體培養(yǎng)基為對(duì)照組測(cè)定其OD600值，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)重復(fù)測(cè)定3 次，取其平均值。

取 培 養(yǎng) 至2、4 、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24 h 時(shí)間點(diǎn)的化膿隱秘桿菌的菌液，做10 倍比稀釋?zhuān)慈?00 μL 菌液加入到900 μL 的生理鹽水中，充分混勻后，從中取100 μL 加入到900 μL 的生理鹽水中，充分混勻，依次稀釋?zhuān)棺罱K的稀釋倍數(shù)為1、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8，然后各取菌液100 μL，均勻涂布到血液營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，每個(gè)梯度重復(fù)3 次，置于37 ℃恒溫過(guò)夜培養(yǎng)，48 h 后計(jì)數(shù)平板菌落數(shù)，有效計(jì)數(shù)為每個(gè)平板20～300 個(gè)菌落。做細(xì)菌活體計(jì)數(shù)，觀察化膿隱秘桿菌HJ-1 型生長(zhǎng)狀況并繪制該菌株的生長(zhǎng)曲線。

1.2.4 化膿隱秘桿菌HJ-1 型感染小鼠半數(shù)致死的測(cè)定

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)，使用生理鹽水將化膿隱秘桿菌菌液分別稀釋到1.84×109，1.47×109，1.17×109，9.4×108，7.53×108，6.02×108，4.8×108，3.84×108，3×108，2.4×108，1.92×108，1.53×108cfu 等濃度，并接種小鼠腹腔注射，將小鼠隨機(jī)分成13 組，每組10 只小鼠，其中1～12組為感染組，第13 組為對(duì)照組注射等量的生理鹽水。根據(jù)改進(jìn)的寇氏法[11]計(jì)算出化膿隱秘桿菌HJ-1型的半數(shù)致死量（LD50）。

2 結(jié)果

2.1 化膿隱秘桿菌HJ-1 型培養(yǎng)

將化膿隱秘桿菌HJ-1 型菌株接種于血液營(yíng)養(yǎng)固體培養(yǎng)基，38 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，可見(jiàn)針尖樣，透明菌落，菌落直徑約1 mm，并有β-溶血環(huán)（圖1）。5%血清BHI 液體培養(yǎng)基，37 ℃80 rpm 培養(yǎng)38 h 液體渾濁，出現(xiàn)絮狀沉淀（圖2）。

2.2 化膿隱秘桿菌HJ-1 型生化鑒定

（1）細(xì)菌純培養(yǎng)后經(jīng)過(guò)革蘭氏染色，使用顯微鏡油鏡觀察可見(jiàn)，大量革蘭氏陽(yáng)性菌，多數(shù)為微彎曲短桿狀，呈v 字型，短桿狀，無(wú)芽孢，無(wú)莢膜，無(wú)鞭毛（圖3）。

（2）對(duì)菌液進(jìn)行生化鑒定結(jié)果（表1），符合化膿隱秘桿菌生化特性[4]，鑒定結(jié)果顯示該菌株為化膿隱秘桿菌。

圖1 化膿隱秘桿菌接種血液營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板Fig.1 Colonies of T.pyogenes on blood agar medium

圖2 化膿隱秘桿菌接種BHI 液體培養(yǎng)基Fig.2 T.pyogenes in serum BHI and formed moderate turbid

圖3 化膿隱秘桿菌HJ-1 革蘭氏染色結(jié)果（1 000×）Fig.3 Gram staining of T.pyogenes type HJ-1（1 000×）

表1 化膿隱秘桿菌HJ-1 生化鑒定結(jié)果Table 1 Results of biochemistry identification of HJ-1 isolated stained

表2 化膿隱秘桿菌細(xì)菌計(jì)數(shù)Table 2 The result of T.pyogenes count

2.3 化膿隱秘桿菌HJ-1 細(xì)菌計(jì)數(shù)及生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

根據(jù)（表1）顯示表明：化膿隱秘桿菌HJ-1 型在37 ℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)0～4 h 細(xì)菌生長(zhǎng)緩慢從8 h 開(kāi)始細(xì)菌快速生長(zhǎng)，12～14 h 為化膿隱秘桿菌HJ-1 型的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，生長(zhǎng)至22 h 細(xì)菌生長(zhǎng)至高峰，此時(shí)的OD600值為0.81，菌落數(shù)為6.4×1011cfu（表2），之后化膿隱秘桿菌HJ-1 型進(jìn)入平臺(tái)期（圖4）。

2.4 化膿隱秘桿菌HJ-1 型感染小鼠半數(shù)致死量測(cè)定

實(shí)驗(yàn)組前期已經(jīng)測(cè)定，化膿隱秘桿菌HJ-1 型感染小鼠最大致死量（Dm）為1.84×109cfu，逐步降低攻毒計(jì)量，直到測(cè)的小鼠未發(fā)生死亡的感染計(jì)量。并測(cè)定了該株化膿隱秘桿菌感染小鼠最低致死量（Dn）為1.53×108cfu，根據(jù)改進(jìn)寇氏算法計(jì)算出化膿隱秘桿菌HJ-1 感染小鼠的半數(shù)致死量，結(jié)果見(jiàn)（表3）。

圖4 化膿隱秘桿菌HJ-1 型生長(zhǎng)曲線Fig.4 Curve of T.pyogenes type HJ-1 plotted

表3 化膿隱秘桿菌HJ-1 型感染小鼠半數(shù)致死量測(cè)定Table 3 The measure of median lethal dose in mice

根據(jù)公式：半數(shù)致死量公式logLD50=Xm-i（Σp-0.5）

測(cè)定HJ-1 型化膿隱秘桿菌半數(shù)致死量為：4.16×108cfu

3 討論

隨著近年來(lái)報(bào)道化膿隱秘感染動(dòng)物的報(bào)道日漸增多，如張?zhí)焯斓萚12]豬膿腫部位的膿汁細(xì)菌分離培養(yǎng)，鑒定出化膿隱秘桿菌。千國(guó)勝等[13]在種鴨糊弄性關(guān)節(jié)炎分離鑒定處化膿隱秘桿菌。劉明春等[14]在奶牛子宮內(nèi)膜炎感染病料中分離鑒定處化膿隱秘桿菌?；撾[秘桿菌已經(jīng)對(duì)多種養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的危害，并且嚴(yán)重的威脅了動(dòng)物與人類(lèi)的健康，目前化膿隱秘桿菌感染疾病的預(yù)防與控制體系尚不完善，給該病的治療造成了很大困難[22]，因此，實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)化膿隱秘桿菌HJ-1 型生長(zhǎng)曲線及半數(shù)致死量測(cè)定，給之后化膿隱秘桿菌的疫苗研發(fā)與特效治療藥物奠定基礎(chǔ)。

生長(zhǎng)曲線的測(cè)定在微生物學(xué)研究中有著重要的意義，細(xì)菌生長(zhǎng)曲線可以直觀的反映出細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖的規(guī)律并可以根據(jù)細(xì)菌生長(zhǎng)規(guī)律可分為細(xì)菌的延遲期，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)菌生長(zhǎng)穩(wěn)定期以及衰亡期四個(gè)階段。測(cè)定細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線方法有很多，如比濁法，平板菌落計(jì)數(shù)法，稱(chēng)重質(zhì)量法等，如謝小偉等[15]對(duì)豬鏈球菌2 型生長(zhǎng)曲線的測(cè)定；靳國(guó)旺和蔡敏[16]對(duì)副豬嗜血桿菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定；李麗等[17]對(duì)產(chǎn)氨短桿菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定。實(shí)驗(yàn)相較于王璞[18]對(duì)化膿隱秘桿菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定，增加了比濁法與平板計(jì)數(shù)法法相結(jié)合，測(cè)定細(xì)菌時(shí)間間隔更短等優(yōu)勢(shì)。

半數(shù)致死量使在規(guī)定時(shí)間內(nèi)，通過(guò)一定的感染途徑，使一定體重或年齡的某種動(dòng)物半數(shù)死亡所需最小細(xì)菌數(shù)或毒素量。LD50使評(píng)價(jià)細(xì)菌毒力的重要參數(shù)之一，計(jì)算LD50的方法常用改進(jìn)式寇法，具有操作簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠等優(yōu)勢(shì)，如王蒙蒙等[19]糞腸球菌小鼠半數(shù)致死量的研究；柴春霞等[20]對(duì)豬乙型腦炎病毒SCYA201201 株感染小鼠半數(shù)致死量的研究；以及馬婷婷等[21]豬源奇異變形桿菌的分離鑒定及其毒力的測(cè)定都采用改進(jìn)寇氏法進(jìn)行半數(shù)致死量LD50的測(cè)定。實(shí)驗(yàn)測(cè)定化膿隱秘桿菌HJ-1 感染小鼠半數(shù)致死量為4.16×108cfu，與王璞[18]測(cè)定的化膿隱秘桿菌小鼠半數(shù)致死量LD50=2.01×109存在這一定差異可能由于菌株毒力差異與小鼠品種個(gè)體差異有關(guān)。

4 結(jié)論

測(cè)定了化膿隱秘桿菌HJ-1 的生長(zhǎng)曲線，確定其對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期為12～14 h，處于該時(shí)期的菌活力最強(qiáng)，感染能力最好，用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的化膿隱秘桿菌進(jìn)行感染具有更好的致病性。測(cè)定了化膿隱秘桿菌HJ-1型對(duì)小鼠的半數(shù)致死量LD50=4.16×108cfu。試驗(yàn)結(jié)果為以后研究化膿隱秘桿菌的致病力與對(duì)動(dòng)物的接種試驗(yàn)提供了依據(jù)。