葛亮，茍慶云，趙金鳳，高偉，詹江華

膽管炎是膽道閉鎖肝門-空腸吻合術(shù)（Kasai術(shù)）后最常見且最嚴(yán)重的并發(fā)癥，發(fā)生率高達(dá)60%～90%，嚴(yán)重影響患兒的自體肝生存時間［1-3］。膽管炎的病理基礎(chǔ)包括膽管的萎縮、消失和壞死，但Kasai術(shù)后膽管炎的特征性改變卻鮮有報道。既往研究表明Kasai 術(shù)時肝組織的炎癥浸潤程度可以作為預(yù)測Kasai 術(shù)后膽管炎發(fā)生的指標(biāo)之一［4］；CD8+細(xì)胞比例降低，CD4+/CD8+細(xì)胞比值升高以及CD68+細(xì)胞比例下降，提示患兒預(yù)后較差［5］。由于臨床上不主張應(yīng)用有創(chuàng)性的肝組織活檢來診斷Kasai術(shù)后膽管炎，因此目前缺乏膽管炎發(fā)作時肝臟組織病理學(xué)改變，CD4、CD8 及CD68 表達(dá)的研究。本研究擬通過對Kasai術(shù)后膽管炎的病理學(xué)研究，探討肝臟CD4、CD8及CD68 表達(dá)與膽管炎的關(guān)系，以期為Kasai 術(shù)后膽管炎的診治提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2016年5月—2018年11月于天津市第一中心醫(yī)院完成肝移植手術(shù)的膽道閉鎖患兒27 例，其中男12 例，女15 例，年齡4.6～8.2 個月，平均（6.4±1.0）個月。所有患兒既往均于天津市兒童醫(yī)院普外科行膽道造影及肝組織活檢確診為膽道閉鎖，并行Kasai術(shù)。10例患兒因Kasai術(shù)后頻發(fā)膽管炎而行肝移植手術(shù)（頻發(fā)膽管炎組），男6 例，女4例；年齡 4.6～8.2 個月，平均（7.0±1.1）個月。17 例患兒因Kasai 術(shù)后黃疸未消退及肝功能衰竭而行肝移植手術(shù)，其中既往未發(fā)生膽管炎者10例（無膽管炎組），男4例，女6例；年齡4.9～7.8個月，平均（6.1±0.8）個月；既往發(fā)生早期膽管炎者7例（早期膽管炎組），男2例，女5例；年齡5.2～6.7個月，平均（6.2±0.6）個月。本研究經(jīng)天津市兒童醫(yī)院及天津市第一中心醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，標(biāo)本取材經(jīng)家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 膽管炎診斷標(biāo)準(zhǔn) 排除其他疾病或原因無法解釋的高熱；皮膚鞏膜黃染加重或退后反復(fù)出現(xiàn)；大便顏色變淺或再次出現(xiàn)陶土色；血清總膽紅素（total bilirubin，TBil）與直接膽紅素（direct bilirubin，DBil）升高；血常規(guī)提示C 反應(yīng)蛋白（C-reactive protein，CRP）及中性粒細(xì)胞升高［3］。術(shù)后1個月內(nèi)發(fā)生的膽管炎為早期膽管炎；術(shù)后半年內(nèi)膽管炎發(fā)作次數(shù)≥3次為頻發(fā)膽管炎。

1.3 方法

1.3.1 資料收集 收集患兒肝移植術(shù)前的臨床資料，包括性別、年齡、Kasai手術(shù)年齡、自體肝生存時間、肝移植術(shù)前白細(xì)胞計數(shù)（white blood cell，WBC）、CRP、肝移植術(shù)前肝功能指標(biāo)［白 蛋 白（albumin，ALB）、丙 氨 酸 轉(zhuǎn) 氨 酶（alanine aminotransferas，ALT）、天 冬 氨 酸 轉(zhuǎn) 氨 酶（aspartate aminotransferase，AST）、DBil、堿 性 磷 酸 酶（alkaline phosphatase，ALP）、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶（γ-glutamyl transferas，GGT）］，以及膽管炎發(fā)生情況。

1.3.2 肝組織標(biāo)本處理 取患兒肝移植時病肝的肝門部肝組織，經(jīng)10%福爾馬林溶液固定，8～24 h后經(jīng)石蠟包埋儲存，所有過程均處于同一實驗條件。

1.3.3 HE染色 病理切片經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度乙醇水洗，蘇木素浸染5 min，經(jīng)酸化伊紅乙醇液浸染2 min，梯度乙醇脫水，透明劑浸泡至透明，中性樹膠封片等一系列操作。在光學(xué)顯微鏡下觀察肝纖維化、膽管增生、肝組織炎性細(xì)胞浸潤程度及膽栓情況等。肝纖維化分級標(biāo)準(zhǔn)（METAVIR 分級標(biāo)準(zhǔn)［6］）：F0，無纖維化；F1，肝匯管區(qū)輕度纖維化；F2，鄰近匯管區(qū)輕度橋接纖維化；F3，伸向鄰近匯管區(qū)重度橋接纖維化；F4，肝硬化、假小葉形成。膽管增生分級標(biāo)準(zhǔn)［7］：0 級，平均每個視野＜5 個增生膽管；1 級，平均每個視野為5～9 個增生膽管；2 級，平均每個視野≥10 個增生膽管；3 級，2 級的基礎(chǔ)上增生膽管形態(tài)扭曲異常、細(xì)小等表現(xiàn)。炎性細(xì)胞浸潤分級標(biāo)準(zhǔn)：計算匯管區(qū)炎性細(xì)胞數(shù)目（N）與細(xì)胞核總數(shù)（T）的比值（I）；1 級，I＜25%；2 級，25%≤I＜50%；3 級，50%≤I＜75%；4 級，I≥75%。膽栓分級標(biāo)準(zhǔn)［8］：1 級，匯管區(qū)無膽栓；2級，僅幾個匯管區(qū)的少量膽管有膽栓；3級：每個匯管區(qū)的少量膽管存在膽栓；4 級：幾乎所有匯管區(qū)的全部小膽管存在膽栓。

1.3.4 免疫組化染色 病理切片脫蠟至水，枸櫞酸鹽緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)15 min，冷卻至室溫，PBS 沖洗5 min×3 次，于3%H2O2中37 ℃孵育10 min，用PBS 沖洗5 min×3 次，滴加一抗（兔抗人CD8 單克隆抗體、小鼠抗人CD4、CD68 單克隆抗體，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），于冰箱中4 ℃過夜，次日取出置于室溫30 min，PBS洗5 min×3次，加二抗（辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔/鼠IgG聚合物，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）后37 ℃孵育30 min，PBS 洗5 min×3 次，經(jīng)DAB（試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）顯色5～10 min，鏡下（×100）觀察染色情況，充分水洗，蘇木素液染核，脫水、透明、中性樹膠封片。免疫組化陽性標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)染色強(qiáng)度分為無棕黃色（陰性）、淡棕黃色（弱陽性）、棕黃色（陽性）、棕褐色（強(qiáng)陽性）。切片內(nèi)讀取任意5 張視野，用同一計算機(jī)成像系統(tǒng)留取相同倍數(shù)顯微鏡下圖片，采用ImagePro Plus 6.0 自動分析系統(tǒng)（美國 Media Cybernetics 公司）進(jìn)行半定量分析，計算CD4、CD8、CD68 蛋白的平均光密度（AOD）值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計處理，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間多重比較行LSD-t檢驗；非正態(tài)分布的計量資料以M（P25，P75）表示，多組間比較采用Kruskal-WallisH檢驗。多組間率的比較采用R×C列聯(lián)表資料的χ2檢驗，組間多重比較采用Brunden 法進(jìn)行顯著性水平校正。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3 組患者一般資料比較 3 組患兒的性別、年齡、Kasai手術(shù)年齡及自體肝生存時間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，見表1。3 組肝移植術(shù)前WBC、CRP 及肝功能指標(biāo)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，見表2。頻發(fā)膽管炎組中有4 例患兒入院時存在膽管炎，肝移植前經(jīng)抗感染及抗炎治療后，體溫恢復(fù)正常，CRP降低，其中3例患兒WBC較治療前好轉(zhuǎn)，而肝功能指標(biāo)無明顯改善，見表3。

Tab.1 Comparison of general data of children between three groups表1 3組膽道閉鎖患兒一般資料比較

2.2 HE染色結(jié)果 3組患兒肝移植時肝纖維化、膽管增生和膽栓分級差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。頻發(fā)膽管炎組肝組織匯管區(qū)可見大量炎性細(xì)胞浸潤，以淋巴細(xì)胞為主，肝竇間隙也可見散在的炎性細(xì)胞浸潤；其炎性細(xì)胞浸潤程度較無管炎組和早期膽管炎組嚴(yán)重，見表4、圖1。

2.3 免疫組化染色結(jié)果 CD4 蛋白在匯管區(qū)及肝小葉周邊呈陽性表達(dá)，呈棕黃色（圖2）；CD8 蛋白主要在匯管區(qū)呈強(qiáng)陽性表達(dá)，呈棕褐色（圖3）；CD68蛋白在匯管區(qū)和肝竇間隙均呈強(qiáng)陽性表達(dá)，呈棕褐色（圖4）。3 組間CD4 蛋白的表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義；頻發(fā)膽管炎組CD8、CD68 蛋白表達(dá)水平均高于無膽管炎組和早期膽管炎組（P＜0.05），見表5。

Tab.2 Comparison of hematological parameters between the three groups of children表2 3組膽道閉鎖患兒血液學(xué)指標(biāo)比較

Tab.3 Changes of hematological parameters before and after treatment in 4 children with cholangitis表3 4例膽管炎患兒治療前后血液學(xué)指標(biāo)改變情況

Tab.4 Comparison of pathological results in each group of children with biliary atresia表4 各組膽道閉鎖患兒病理結(jié)果比較

Fig.1 Comparison of inflammatory cell infiltration between the three groups(HE，×100)圖1 3組肝組織標(biāo)本炎性細(xì)胞浸潤程度比較（HE，×100）

Fig.2 The expressions of CD4 in liver tissues of three groups(immunohistochemical staining，×100)圖2 3組肝臟組織標(biāo)本中CD4的表達(dá)情況（免疫組化染色，×100）

Fig.3 The expressions of CD8 in liver tissues of three groups(immunohistochemical staining，×100)圖3 3組肝臟組織標(biāo)本中CD8的表達(dá)情況（免疫組化染色，×100）

Fig.4 The expressions of CD68 in liver tissues of three groups(immunohistochemical staining，×100)圖4 3組肝臟組織標(biāo)本中CD68的表達(dá)情況（免疫組化染色，×100）

Tab.5 Expressions of CD4，CD8 and CD68 proteins in three groups表5 3組膽道閉鎖患兒CD4、CD8及CD68蛋白的表達(dá) （AOD，）

Tab.5 Expressions of CD4，CD8 and CD68 proteins in three groups表5 3組膽道閉鎖患兒CD4、CD8及CD68蛋白的表達(dá) （AOD，）

＊P＜0.05；a與無膽管炎組比較，b與早期膽管炎組比較，P＜0.05

組別無膽管炎組早期膽管炎組頻發(fā)膽管炎組F n 10 7 10 CD4 0.099 0±0.016 7 0.104 2±0.022 3 0.114 6±0.014 7 2.028 CD8 0.188 4±0.031 3 0.198 1±0.036 1 0.233 8±0.036 6ab 4.651＊CD68 0.160 7±0.019 0 0.165 4±0.013 3 0.190 2±0.024 0ab 6.151＊

3 討論

Kasai術(shù)是目前治療膽道閉鎖的首選治療方式。膽管炎是膽道閉鎖Kasai 術(shù)后最常見的并發(fā)癥，且Kasai術(shù)后一旦發(fā)生膽管炎，其反復(fù)發(fā)作的概率高達(dá)90%［9］。反復(fù)發(fā)作膽管炎將對肝臟造成持續(xù)性損害，加速肝硬化過程，導(dǎo)致自體肝生存時間縮短［10-11］。術(shù)后膽管炎的防治是保證膽道閉鎖治療成功的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。目前膽道閉鎖術(shù)后膽管炎的發(fā)病機(jī)制仍不明確，可能與肝內(nèi)膽管發(fā)育障礙及膽管損傷、腸道微生物遷移、腸道內(nèi)容物反流及肝門部淋巴回流障礙等因素相關(guān)。術(shù)后膽管炎的診斷基于患兒的臨床表現(xiàn)及血液學(xué)指標(biāo)檢查，國內(nèi)尚未見開展肝穿刺活檢病理檢查證實膽管炎發(fā)作的研究，且缺乏膽管炎治療效果的評價標(biāo)準(zhǔn)［12］。

有研究顯示，Kasai術(shù)可使肝內(nèi)部分有功能的膽管在一定程度上引流膽汁，緩解肝內(nèi)膽汁淤積，減輕炎癥反應(yīng)，進(jìn)而降低炎癥對膽管的損傷［13］。但膽管炎發(fā)作時可導(dǎo)致膽管的萎縮、壞死和消失。免疫細(xì)胞在小膽管周圍的浸潤及膽管上皮細(xì)胞的壞死可導(dǎo)致部分膽管阻塞。反復(fù)發(fā)作膽管炎患兒肝內(nèi)膽管增生嚴(yán)重，匯管區(qū)膽栓形成，肝細(xì)胞可見淤膽，炎性細(xì)胞浸潤嚴(yán)重［8］。膽管炎發(fā)作越頻繁，其肝內(nèi)炎癥越明顯［14］。本研究行HE 染色示頻發(fā)膽管炎組患兒存在嚴(yán)重的肝纖維化、膽管增生、膽栓程度及炎性細(xì)胞浸潤，與以上研究一致。但肝纖維化、膽管增生及膽栓程度與無膽管炎組和早期膽管炎組無明顯差異，考慮原因是這3種指標(biāo)均為膽道閉鎖患兒肝臟終末期改變，而并非膽管炎的特征性改變。頻發(fā)膽管炎組匯管區(qū)炎性細(xì)胞浸潤程度明顯高于無膽管炎組和早期膽管炎組，提示匯管區(qū)炎性細(xì)胞浸潤是膽管炎的特征性表現(xiàn)，其中淋巴細(xì)胞浸潤在膽管炎的發(fā)作中起重要作用。

有研究表明，免疫系統(tǒng)參與膽道閉鎖的發(fā)病，肝內(nèi)膽管周圍T淋巴細(xì)胞浸潤是膽道閉鎖的病理學(xué)特征，CD4+和CD8+T細(xì)胞是其主要的細(xì)胞類型，主要分布于匯管區(qū)［15］。CD68 是巨噬細(xì)胞/單核細(xì)胞的標(biāo)志，肝臟中的巨噬細(xì)胞（即Kupffer細(xì)胞）主要存在于肝竇中［16-17］。CD8+T 細(xì)胞的特異性免疫反應(yīng)參與膽管上皮細(xì)胞的損傷，在膽道閉鎖肝纖維化中發(fā)揮重要作用［18］。研究表明，膽道閉鎖患兒肝組織中均有CD4+、CD8+細(xì)胞浸潤，它們不僅可圍繞小膽管周圍形成袖套樣結(jié)構(gòu)，在與匯管區(qū)相鄰的肝竇內(nèi)往往呈團(tuán)狀聚集現(xiàn)象，鄰近匯管區(qū)的肝細(xì)胞也有明顯的胞漿疏松化、水腫變性等病理改變。膽道閉鎖患兒肝組織和纖維斑塊存在CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞浸潤，手術(shù)吻合部位存在炎癥反應(yīng)，這可能是術(shù)后膽管炎的發(fā)病基礎(chǔ)［19］。有研究發(fā)現(xiàn)Kasai 術(shù)時肝組織中CD8+T 細(xì)胞浸潤減少是術(shù)后膽管炎發(fā)生的危險因素，可能與CD8+T 細(xì)胞不具有細(xì)胞毒性作用但仍存在免疫調(diào)節(jié)作用有關(guān)［20］。本研究結(jié)果顯示，頻發(fā)膽管炎組CD8、CD68蛋白表達(dá)水平均高于無膽管炎組和早期膽管炎組，提示膽管炎發(fā)作時炎性細(xì)胞種類及數(shù)量發(fā)生改變，可能與細(xì)菌或病毒介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)相關(guān)。

膽管炎的主要治療藥物包括抗生素、激素和利膽藥物，臨床上對于膽管炎的治療更多依賴于經(jīng)驗用藥?；純后w溫恢復(fù)正常、黃疸消退、糞便顏色變深等常被視為膽管炎治療有效，但是肝臟的病理改變是否恢復(fù)正常卻無從考證。本研究頻發(fā)膽管炎組中有4 例患兒入院時就存在膽管炎發(fā)作，肝移植前經(jīng)抗感染及抗炎治療后，血常規(guī)中的炎癥指標(biāo)較前明顯好轉(zhuǎn)，肝功能變化不顯著，但是肝臟仍然存在嚴(yán)重的炎性細(xì)胞浸潤，提示膽管炎可成為Kasai術(shù)后慢性遷延性疾病，其反復(fù)發(fā)作加重肝纖維化，導(dǎo)致肝功能衰竭。

肝組織活檢因其有創(chuàng)性在臨床膽管炎診斷及療效評價中的應(yīng)用受到了很大限制。雖然未能選取膽管炎發(fā)作時的肝組織標(biāo)本是本研究的不足之處，但是因頻發(fā)膽管炎而行肝移植患兒的標(biāo)本能夠部分表現(xiàn)出膽管炎的病理改變，仍具有一定的研究價值。未來期待通過膽管炎的病理改變研究，建立一種簡便、安全、有效的檢查標(biāo)準(zhǔn)來評估膽管炎的預(yù)后和轉(zhuǎn)歸。

綜上所述，Kasai術(shù)后膽管炎肝臟病理改變主要為匯管區(qū)炎性細(xì)胞浸潤，是CD8+T細(xì)胞和CD68+肝巨噬細(xì)胞參與的炎癥反應(yīng)。對于反復(fù)發(fā)作的膽管炎，是否應(yīng)延長抗感染及抗炎的治療時間有待進(jìn)一步研究驗證。