錢晶，王小紅，藍宇

急性胰腺炎（acute pancreatitis，AP）是臨床常見的急腹癥之一，其以輕癥多見，病程呈自限性，其中10%～30%的患者會進展為重癥急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）［1］。SAP病情進展快，病情危重，常并發(fā)多臟器功能不全綜合征，病死率高達20%～30%［2］，給家庭和社會帶來沉重負擔。因此，探索SAP 的發(fā)病機制，尋找有效的治療藥物尤為重要。研究表明，AP的嚴重程度取決于炎癥反應及胰蛋白酶激活的狀況，自噬受損則可能會促進胰腺腺泡細胞內胰蛋白酶原的激活以及炎癥反應的加?。?-4］。本課題組前期實驗結果表明，雪蓮注射液對SAP 大鼠有確切的治療作用［5-6］。目前有關雪蓮注射液治療SAP患者的臨床報道尚少見。本研究旨在探討雪蓮注射液對SAP 的臨床治療作用及其作用機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2018 年6 月—2019 年9 月在南京鼓樓醫(yī)院集團儀征醫(yī)院普通外科及消化科住院治療的SAP患者。納入標準：（1）按照《中國急性胰腺炎診治指南（2013，上海）》標準確診AP［7］。SAP的診斷標準為具備AP的臨床表現(xiàn)和生物化學改變，須伴有持續(xù)的器官功能衰竭，即持續(xù)48 h 以上且不能自行恢復的呼吸系統(tǒng)、心血管或腎臟功能衰竭，可累及1個或多個臟器。（2）發(fā)病24 h內入院。排除標準：（1）慢性疾病臨終狀態(tài)者。（2）合并外傷、免疫缺陷病、嚴重心血管疾病、終末期肝腎疾病、惡性腫瘤者，以及孕婦、哺乳期婦女。（3）近3個月內使用激素或免疫抑制劑者。（4）存在嚴重慢性臟器功能障礙，患者正進行有可能干擾本研究的其他治療。（5）病因含有醫(yī)源性或正在進行有可能干擾本研究的其他治療。（6）臨床研究期間死亡或未能執(zhí)行完整治療方案者。納入符合上述條件的SAP患者50例，其中男27例，女23例；年齡28～72 歲，平均（52.78±13.55）歲。采用隨機數(shù)字表法將其分為常規(guī)治療組25例和常規(guī)治療+雪蓮注射液治療組（雪蓮注射液組）25 例。另擇同期健康體檢志愿者25 例為正常對照組。正常對照組、常規(guī)治療組和雪蓮注射液組年齡分別為（54.20±13.22）、（51.36±14.00）、（51.80±13.39）歲，男女分別是15/10、12/13、14/11例，3組年齡（F=0.320）、性別（χ2=0.753）比較差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經本院倫理委員會批準，獲患者或家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 治療方法 常規(guī)治療組患者住院后即給予禁食、水，胃腸減壓、生長抑素（瑞士Merck Serono SA Aubonne Branch 公司產品，3 mg/支）抑制胰液分泌，烏司他?。◤V東天普生化醫(yī)藥股份有限公司產品，10萬U/支）抑制胰酶，雷貝拉唑（江蘇奧賽康藥業(yè)股份有限公司產品，20 mg/支）抑制胃酸，導瀉、消脹、止痛、抗感染及營養(yǎng)支持等治療。雪蓮注射液組在常規(guī)治療的基礎上，給予0.5%雪蓮注射液（新疆西域藥業(yè)有限公司產品，2 mL/支，含總黃酮10 mg/支，國藥準字號為Z65020023）4 mL，肌內注射，每日1 次，連用10 d。正常對照組不給予任何治療。

1.3 觀察指標 （1）自噬及炎性因子。治療前及治療后10 d晨起空腹抽取受檢者外周靜脈血，采集的血液標本常溫下靜置2 h，然后高速離心機4 ℃下以3 000 r/min 離心15 min，取上清液，分裝入EP 管中，放置入-80 ℃冰箱內保存。采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）［8］檢測血清Beclin-1、微管相關蛋白1輕鏈3（LC3）水平，試劑盒購自武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司；采用ELISA［9］檢測血清核因子（NF）-κB p65、腫瘤壞死因子（TNF）-α、白細胞介素（IL）-1β及IL-10水平，試劑盒購自深圳晶美生物工程有限公司，具體操作步驟按試劑盒說明書進行。（2）急性生理與慢性健康評分（APACHE）Ⅱ和胰腺改良CT 嚴重指數(shù)評分（MCTSI）。采用APACHEⅡ評分［10］評估 AP 病情變化及預后，胰腺 MCTSI 評分［11］評估SAP炎癥反應及胰腺壞死程度。（3）記錄常規(guī)治療組、雪蓮注射液組患者的住院時間及腹痛緩解時間。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SAS 8.2 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理。計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，3 組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行LSD-t檢驗；2組間比較采用獨立樣本t檢驗；各組治療前后各指標比較采用重復測量資料的方差分析，組內不同時間點各指標比較采用Profile 法，同一時間點各指標2 組間比較采用Lsmeanst法；計數(shù)資料以例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 3 組自噬及炎性因子水平比較 治療前，常規(guī)治療組和雪蓮注射液組患者血清Beclin-1、LC3、NF-κB p65、TNF-α、IL-1β 和IL-10 水平均明顯高于正常對照組（P＜0.05），常規(guī)治療組與雪蓮注射液組差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與治療前比較，治療后10 d 常規(guī)治療組和雪蓮注射液組血清Beclin-1、LC3、NF-κB p65、TNF-α 和IL-1β 水平明顯降低，IL-10水平明顯升高（P＜0.05）。治療后10 d雪蓮注射液組血清Beclin-1、LC3、NF-κB p65、TNF-α和IL-1β 水平低于常規(guī)治療組，IL-10水平高于常規(guī)治療組（P＜0.05），見表1。

2.2 常規(guī)治療組與雪蓮注射液組APACHEⅡ、胰腺MCTSI 評分比較 治療前，雪蓮注射液組與常規(guī)治療組APACHEⅡ、胰腺MCTSI 評分差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與治療前比較，治療后10 d 常規(guī)治療組和雪蓮注射液組APACHEⅡ、胰腺MCTSI 評分均明顯降低。治療后10 d 雪蓮注射液組APACHEⅡ、胰腺MCTSI 評分均低于常規(guī)治療組（P＜0.05），見表2。

2.3 常規(guī)治療組與雪蓮注射液組住院時間、腹痛緩解時間比較 雪蓮注射液組患者住院時間和腹痛緩解時間分別為（17.84±2.88）d、（5.36±0.81）d，明顯低于常規(guī)治療組的（22.16±3.26）d、（7.52±1.09）d（t分別為4.960、8.090，P＜0.05）。

3 討論

目前AP的發(fā)病機制尚未闡明，研究認為炎癥反應及胰腺腺泡細胞異常自噬對AP 的發(fā)生發(fā)展具有重要作用。受損的胰腺腺泡細胞可釋放多種炎性因子，從而產生炎性細胞浸潤及細胞炎性因子間的級聯(lián)放大效應，導致胰腺腺泡細胞的壞死［12-13］。自噬與炎癥反應密切相關，自噬受損，炎性小體不能被及時清除，導致炎性小體過度堆積，誘導IL-1β表達水平上調，上調的IL-1β 進一步加重自噬受損并且促進了胰蛋白酶原的激活，從而導致AP 的發(fā)生發(fā)展［14］。

Beclin-1 基因也稱BECN1 基因，是酵母自噬相關基因6 的同系物，也是哺乳動物參與自噬的特異性基因。 Beclin-1 與磷酸肌醇 3 激酶（phosphoinositide-3-kinase，PI3K）結合是自噬中自噬體形成的起始條件。LC3 是公認的自噬體標志物，可在一定程度上反映自噬體的數(shù)量［15］。作為Rel蛋白家族的轉錄調節(jié)子，NF-κB是由5個亞基（p50、p52、p65、c-Rel、Rel B）組成的同源或異源二聚體，而NF-κB p65 是其主要亞基。在正常生理條件下，NF-κB與κB抑制劑（inhibitor of the kappa B，IκB）蛋白家族成員結合而失活。通過細胞刺激啟動細胞內第二信使系統(tǒng)可以誘導IκB磷酸化或酸化，導致IκB從NF-κB 中降解和分離，進一步激活NF-κB，使其從細胞質遷移到細胞核，并與DNA啟動子區(qū)域中相應靶基因的結合位點結合，從而產生一系列與免疫炎癥反應相關的基因轉錄程序，同時誘導包括TNF-α、IL-1β 及IL-6 在內的多種促炎細胞因子的高表達。NF-κB 激活使p65 磷酸化，使其從細胞質遷移到細胞核，并在其中進一步調節(jié)轉錄。IL-10可以通過抑制NF-κB 的活性及其與DNA 結合能力來阻止NF-κB啟動相關促炎因子基因的轉錄，而NF-κB通路是參與調節(jié)人體炎癥反應的重要信號通路［16］。

Tab.1 Comparison of serum levels of Beclin-1,LC3,NF-κB p65,TNF-α,IL-1β and IL-10 between three groups表1 3組血清Beclin-1、LC3、NF-κB p65、TNF-α、IL-1β和IL-10水平比較 （n=25，）

Tab.1 Comparison of serum levels of Beclin-1,LC3,NF-κB p65,TNF-α,IL-1β and IL-10 between three groups表1 3組血清Beclin-1、LC3、NF-κB p65、TNF-α、IL-1β和IL-10水平比較 （n=25，）

＊P＜0.05；a與正常對照組比較，b與常規(guī)治療組比較，P＜0.05；F1為同一組別治療前、后比較；F2為3組治療前比較，t為常規(guī)治療組與雪蓮注射液組治療后比較

組別正常對照組常規(guī)治療組雪蓮注射液組F2或t LC3（μg/L）Beclin-1（μg/L）治療前0.14±0.02 0.71±0.08a 0.71±0.08a 543.790＊治療后10 d-0.43±0.04 0.33±0.04b 9.750＊F1 F1 F1 1 995.440＊3 547.780＊治療前0.15±0.02 0.92±0.08a 0.91±0.08a 1 114.440＊治療后10 d-0.59±0.04 0.49±0.04b 9.737＊2 722.840＊4 561.560＊NF-κB p65（mg/L）治療前10.86±1.39 41.50±3.67a 41.48±3.77a 495.030＊治療后10 d-29.13±2.93 22.92±3.72b 7.698＊6 753.080＊112 028.000＊組別正常對照組常規(guī)治療組雪蓮注射液組F2或t IL-1β（mg/L）IL-10（mg/L）TNF-α（mg/L）治療前12.56±1.43 60.89±6.96a 61.49±7.25a 564.320＊治療后10 d F1 F1 F1 47.38±4.41 36.36±4.39b 10.563＊697.390＊1 919.840＊治療前2.51±0.85 6.52±1.49a 6.68±1.54a 52.970＊治療后10 d-5.60±1.55 4.61±1.50b 2.624＊409.190＊4 526.300＊治療前9.88±1.18 13.14±1.92a 13.36±1.98a 371.100＊治療后10 d-21.17±1.91 29.74±1.68b 17.493＊35 921.900＊26 380.000＊

Tab.2 Comparison of APACHEⅡand pancreas MCTSI scores between two groups表2 常規(guī)治療組與雪蓮注射液組APACHEⅡ、胰腺MCTSI評分比較 （n=25，分，）

Tab.2 Comparison of APACHEⅡand pancreas MCTSI scores between two groups表2 常規(guī)治療組與雪蓮注射液組APACHEⅡ、胰腺MCTSI評分比較 （n=25，分，）

＊P＜0.05

組別常規(guī)治療組雪蓮注射液組t APACHE Ⅱ胰腺MCTSI治療前15.00±1.44 15.12±1.48 0.290治療后10 d 11.68±1.22 10.40±1.00 4.070＊F F 888.900＊1 478.650＊治療前5.76±1.67 5.92±1.68 0.340治療后10 d 4.40±1.63 3.36±1.50 2.350＊29.390＊195.050＊

研究表明，NF-κB信號通路參與了SAP的發(fā)生、發(fā)展［17］。Yang 等［18］研究發(fā)現(xiàn)，抑制 NF-κB 信號通路，導致Beclin-l 及LC3Ⅱ表達水平下降，自噬空泡形成減少，AP嚴重程度減輕。自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤通過調節(jié)NF-κB 信號通路和蛋白酶-1-IL-1β信號通路來減弱自噬通量并減輕炎癥反應，從而降低炎性因子水平，減少對器官的損傷［19］。本研究結果顯示，SAP 患者入院時血清Beclin-1、LC3、NF-κB p65、TNF-α、IL-1β、IL-10 均較正常對照組明顯升高，提示炎癥反應NF-κB信號通路及胰腺腺泡細胞異常自噬參與SAP 的發(fā)生發(fā)展，與以往文獻報道一致。

雪蓮注射液是從天山雪蓮中提取的以雪蓮黃酮為主要成分的純中藥單方制劑，具有抗氧化、抗炎和免疫調節(jié)等作用，且無明顯毒性和不良反應［20］。本課題組前期動物實驗研究發(fā)現(xiàn)，雪蓮注射液可通過抑制SAP大鼠NF-κB信號通路的激活，調節(jié)細胞因子的合成與釋放，從而減輕胰腺損傷；其可通過激活PI3K/蛋白激酶B 信號通路，改善腦微循環(huán)，從而對大鼠SAP并發(fā)腦損傷具有治療作用［5-6］。

本研究結果顯示，與治療前比較，治療后10 d常規(guī)治療組和雪蓮注射液組血清Beclin-1、LC3水平明顯降低，且雪蓮注射液組血清Beclin-1、LC3 水平低于常規(guī)治療組，提示雪蓮注射液具有抑制SAP 患者胰腺腺泡細胞異常自噬的作用；另外，與治療前比較，治療后10 d 常規(guī)治療組和雪蓮注射液組血清NF-κB p65、TNF-α 和IL-1β 水平明顯降低，IL-10水平明顯升高；且雪蓮注射液組血清NF-κB p65、TNF-α 和IL-1β水平低于常規(guī)治療組，IL-10水平高于常規(guī)治療組，提示雪蓮注射液具有抑制SAP 患者炎癥反應NF-κB信號通路的作用。此外，治療后雪蓮注射液組APACHEⅡ及胰腺MCTSI評分下降幅度均高于常規(guī)治療組，且住院時間和腹痛緩解時間均低于常規(guī)治療組，提示雪蓮注射液對SAP 患者有較好的輔助治療作用。

綜上所述，雪蓮注射液可能通過抑制胰腺腺泡細胞異常自噬，阻斷NF-κB 信號通路，進一步抑制炎癥反應，從而對SAP患者發(fā)揮輔助治療作用。