常 樂(lè)

（長(zhǎng)治職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程系，山西長(zhǎng)治 046011）

牧草是反芻動(dòng)物正常瘤胃功能所必需的，為反芻動(dòng)物提供一種更經(jīng)濟(jì)有效的飼養(yǎng)方式。但牧草中高比例的結(jié)構(gòu)性碳水化合物限制了反芻動(dòng)物對(duì)牧草的自由采食和消化，因?yàn)樗鼈儨p慢了微生物的發(fā)酵速度。瘤胃微生物，尤其是纖維素分解菌和厭氧真菌的數(shù)量和多樣性是降解日糧纖維成分的必要條件（Wilson，2008）。因此，一種促進(jìn)纖維降解微生物生長(zhǎng)的方法將有利于增加瘤胃中纖維素和半纖維素的降解。大多數(shù)瘤胃纖維素降解微生物（如白瘤胃球菌、風(fēng)味瘤胃球菌、琥珀纖維桿菌和丁里維生物纖維隔離菌）都需要支鏈揮發(fā)性脂肪酸，如異丁酸、異戊酸和2-甲基丁酸（侯明杰等，2018）。瘤胃支鏈揮發(fā)性脂肪酸主要來(lái)源于日糧蛋白或細(xì)菌蛋白經(jīng)瘤胃氧化脫氨和纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸脫羧后的循環(huán)。Moharrery（2004）研究表明，支鏈揮發(fā)性脂肪酸可以提高綿羊瘤胃的干物質(zhì)表觀消化率和微生物生長(zhǎng)，增強(qiáng)微生物功能和酶活性。支鏈揮發(fā)性脂肪酸可以、用于合成支鏈氨基酸，即纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸。氨基酸通常對(duì)瘤胃微生物具有刺激作用，即使氨和碳水化合物超出所需，說(shuō)明氨基酸直接影響瘤胃微生物的生長(zhǎng)速率。Yang（2002）在體外試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，支鏈揮發(fā)性脂肪酸顯著提高了牧草中性洗滌纖消化率，而支鏈氨基酸的效果更佳。但每種支鏈氨基酸用于瘤胃發(fā)酵和底物降解的最佳劑量仍然未知。支鏈氨基酸對(duì)纖維物質(zhì)體外降解的數(shù)據(jù)較為有限。因此，本試驗(yàn)評(píng)估了不同劑量的纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸對(duì)小麥秸稈體外瘤胃發(fā)酵特性的影響。

1 材料與方法

1.1 瘤胃液接種試驗(yàn)選擇4頭帶有瘤胃瘺管的綿羊作為瘤胃液供體，飼喂商品濃縮料和補(bǔ)充小麥秸稈。在早上飼喂前從瘤胃瘺管收集內(nèi)容物，經(jīng)4層紗布過(guò)濾去除飼料顆粒。過(guò)濾后的瘤胃液轉(zhuǎn)移到一個(gè)預(yù)加熱（38℃）的保溫瓶中，并與二氧化碳混合，并加入緩沖液。

1.2 樣品孵育取1 g小麥秸稈樣品放入125 mL血清瓶。在每個(gè)發(fā)酵瓶中加入稱重的纈氨酸、亮氨酸或異亮氨酸，配制成濃度梯度為1、3、5和7 mmol/L。將100 mL瘤胃液加入到瓶中，用二氧化碳沖洗，之后裝上塞子，密封，并在38℃的水浴搖床（100 rpm/min）。未添加支鏈氨基酸的瓶子作為對(duì)照組，每組3個(gè)重復(fù)。孵育72 h后，用自來(lái)水冷卻，停止發(fā)酵。用pH計(jì)測(cè)定培育基的pH。用尼龍袋過(guò)濾每個(gè)瓶子的內(nèi)容物，收集底物殘?jiān)鼫y(cè)定干物質(zhì)和中性洗滌纖維。收集每個(gè)過(guò)濾發(fā)酵液10 mL，用于測(cè)定氨氮和揮發(fā)性脂肪酸濃度（Filipek 和 Dvorak，2009）。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)采用SPSS軟件一般線性模型進(jìn)行分析，采用Duncan’s法進(jìn)行多重比較，P＜0.05表示差異顯著，同時(shí)利用正交多項(xiàng)式分析支鏈氨基酸添加水平的線性和二次曲線效應(yīng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 纈氨酸對(duì)小麥秸稈體外發(fā)酵性能的影響由表1可知，添加纈氨酸對(duì)培養(yǎng)基的最終pH無(wú)顯著影響（P＞0.05）。氨氮濃度隨纈氨酸添加水平的增加有顯著上升趨勢(shì)（P=0.06）。與對(duì)照組相比，纈氨酸濃度在1 mmol/L或更高水平時(shí)，揮發(fā)性脂肪酸產(chǎn)量顯著增加（P＜0.05）。揮發(fā)性脂肪酸總量和支鏈揮發(fā)性脂肪酸濃度與纈氨酸添加水平表現(xiàn)為顯著線性和二次曲線效應(yīng)（P＜0.05）。除乙酸、異戊酸及乙酸與丙酸比值外，丙酸、丁酸、異丁酸和戊酸濃度隨纈氨酸水平的增加表現(xiàn)為顯著線性效應(yīng)（P＜0.05）。纈氨酸添加水平對(duì)干物質(zhì)和中性洗滌纖維體外降解量均無(wú)顯著影響（P＞ 0.05）。

2.2 亮氨酸對(duì)小麥秸稈體外發(fā)酵性能的影響由表2可知，隨著亮氨酸水平的升高，pH有顯著升高趨勢(shì)（P=0.06），同時(shí)氨氮和支鏈揮發(fā)性脂肪酸濃度表現(xiàn)為顯著線性升高（P＜0.05），而揮發(fā)性脂肪酸總量表現(xiàn)為顯著二次曲線效應(yīng)（P＜0.05）。乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸濃度隨亮氨酸水平的升高表現(xiàn)為顯著線性和二次曲線效應(yīng)（P＜0.05），而戊酸和乙酸與丙酸比值表現(xiàn)為顯著二次曲線效應(yīng)（P＜0.05），異戊酸表現(xiàn)為顯著線性升高效應(yīng)（P＜0.05）。亮氨酸添加水平對(duì)干物質(zhì)和有機(jī)物體外降解量均無(wú)顯著影響（P＞0.05）。

表1 纈氨酸對(duì)小麥秸稈體外發(fā)酵性能的影響

表2 亮氨酸對(duì)小麥秸稈體外發(fā)酵性能的影響

2.3 異亮氨酸對(duì)小麥秸稈體外發(fā)酵性能的影響由表3可知，pH和揮發(fā)性脂肪酸總量隨異亮氨酸水平的升高表現(xiàn)為顯著線性和二次曲線效應(yīng)（P＜0.05），而支鏈揮發(fā)性脂肪酸濃度表現(xiàn)為顯著線性升高（P＜0.05）。異亮氨酸添加水平對(duì)氨氮濃度無(wú)顯著影響（P＞0.05）。隨著異亮氨酸添加水平的升高，乙酸、丙酸、異戊酸及乙酸與丙酸比值均表現(xiàn)為顯著線性降低（P＜0.05），而丁酸、異丁酸和異戊酸濃度表現(xiàn)為顯著線性和二次曲線效應(yīng)（P＜0.05）。戊酸濃度不受異亮氨酸添加水平的影響（P＞0.05）。隨著異亮氨酸添加水平的升高，干物質(zhì)和中性洗滌纖維體外降解量有顯著降低的趨勢(shì)（P=0.08，P=0.07）。

表3 異亮氨酸對(duì)小麥秸稈體外發(fā)酵性能的影響

3 討論

Wang等（2008）研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)所有支鏈氨基酸從發(fā)酵培養(yǎng)基中去除后，瘤胃細(xì)菌和原生動(dòng)物的生長(zhǎng)受到抑制，微生物蛋白產(chǎn)量下降44.52%，說(shuō)明支鏈氨基酸是瘤胃微生物生長(zhǎng)所必需的氨基酸。與其他氨基酸相比，瘤胃微生物更難合成亮氨酸、異亮氨酸和苯丙氨酸，因此，考慮到纖維素分解菌的生長(zhǎng)和日糧結(jié)構(gòu)碳水化合物的降解，有必要向飼喂牧草的反芻動(dòng)物提供支鏈氨基酸。在本研究中，低濃度（1 mmol/L）纈氨酸和異亮氨酸提高了小麥秸稈中性洗滌纖維的降解性，這與Yang（2002）的研究結(jié)果一致。但當(dāng)添加纈氨酸和異亮氨酸的濃度超過(guò)1 mmol/L時(shí)，小麥秸稈的干物質(zhì)和中性洗滌纖維消化率有下降趨勢(shì)，因此，瘤胃微生物體外纖維的最佳濃度約為1 mmol/L。

添加支鏈氨基酸對(duì)瘤胃體外發(fā)酵的影響尚不清楚，在本研究中，通過(guò)補(bǔ)充纈氨酸或異亮氨酸，揮發(fā)性脂肪酸總量、乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、異戊酸和戊酸的濃度增加，這與Zain等（2008）的研究結(jié)果一致。揮發(fā)性脂肪酸的增加是由于底物降解加速和支鏈氨基酸代謝增加所致。亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸在瘤胃內(nèi)被厭氧細(xì)菌廣泛代謝，產(chǎn)生大量的異戊酸、2-甲基丁酸和異丁酸，這3種支鏈揮發(fā)性脂肪酸是瘤胃中大多數(shù)纖維降解微生物的必需生長(zhǎng)因子（馮仰廉，2004）。在本研究中，支鏈揮發(fā)性脂肪酸產(chǎn)量隨支鏈氨基酸添加量的增加而線性增加。添加支鏈氨基酸增加了揮發(fā)性脂肪酸的總濃度，但最終的pH保持不變。

人們一直認(rèn)為，纖維素分解瘤胃細(xì)菌利用氨作為唯一的氮源。但越來(lái)越多的研究與這一結(jié)論并不一致（Atasoglu等，2001），其發(fā)現(xiàn)苯丙氨酸對(duì)產(chǎn)琥珀酸菌基因的生長(zhǎng)至關(guān)重要。到目前為止，還沒(méi)有關(guān)于個(gè)別種類的纖維素分解細(xì)菌對(duì)支鏈氨基酸有特殊偏好的報(bào)告。本研究發(fā)現(xiàn)，添加低水平的支鏈氨基酸對(duì)中性洗滌纖維的降解有有益影響。但還需進(jìn)一步的純培養(yǎng)試驗(yàn)來(lái)確定支鏈氨基酸在不同種類的纖維素分解細(xì)菌中的偏好和需求。

4 結(jié)論

添加低濃度（1 mmo/L）的纈氨酸、亮氨酸或異亮氨酸，可使小麥秸稈的體外發(fā)酵產(chǎn)生較高的揮發(fā)性脂肪酸。但還需進(jìn)一步的體內(nèi)試驗(yàn)來(lái)探討支鏈氨基酸作為提高反芻動(dòng)物飼料利用率的添加效果。