孫延勤，張芳芳，沈娟，吳欣怡，李春保，陳穎，王瑋*

1(南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院，江蘇 南京，210095) 2(國家肉品質(zhì)量安全控制工程技術(shù)研究中心(南京農(nóng)業(yè)大學(xué))，江蘇 南京，210095) 3(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部肉及肉制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心(南京農(nóng)業(yè)大學(xué))，江蘇 南京，210095) 4(賽默飛世爾科技(中國)有限公司，上海,201206) 5(中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，北京,100176)

硝酸鹽和亞硝酸鹽可作為護(hù)色劑和防腐劑被添加到肉制品中，有助于改善肉色，抑制微生物的生長和繁殖，延長肉制品的貨架期[1]。但亞硝酸鹽會將人體的血紅蛋白轉(zhuǎn)化為高鐵血紅蛋白，使血液失去攜氧功能，并且具有致癌、致畸作用，過量甚至危及生命[2-6]。

當(dāng)前有效的檢測方法GB 5009.33—2016前處理操作較繁瑣，耗時(shí)較長，精密度差，回收率偏低。為此，本試驗(yàn)通過優(yōu)化前處理方法和儀器檢測條件，建立一種可同時(shí)檢測畜禽肉及其制品中硝酸鹽和亞硝酸鹽含量的抑制型離子色譜法。該方法在前處理時(shí)采用二氯甲烷和Na柱，可有效降低有機(jī)物和金屬離子等雜質(zhì)對硝酸鹽和亞硝酸鹽檢測的干擾，彌補(bǔ)國標(biāo)方法檢測的缺陷，旨在為我國肉類及其制品中硝酸鹽和亞硝酸鹽的快速檢測提供可靠的科學(xué)依據(jù)和堅(jiān)實(shí)的技術(shù)保障。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗(yàn)材料

供試材料包括各種畜禽肉及其制品，如豬肉、牛肉、羊肉、雞肉、鴨肉、腌臘肉制品、肉干制品、西式肉制品等樣品，南京農(nóng)貿(mào)市場和超市。

1.1.2 試劑

硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)液、亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)液(均為200 mg/kg，以各硝酸根離子濃度計(jì))，北京海岸鴻蒙標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)有限責(zé)任公司；二氯甲烷、甲醇、KOH(均為分析純)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。所有溶液均采用超純?nèi)ルx子水配制。

1.2 儀器與設(shè)備

ICS5000型離子色譜儀(配有電導(dǎo)檢測器，AERS型抑制器，CR-TC捕獲柱)、RP柱和Na柱，美國Thermo Fisher公司；D-16C高速冷凍離心機(jī)、CPA224S分析天平，德國Sartorius公司；TW20水浴鍋,德國JULABO公司；X025-12DTD超聲波清洗器，南京先歐儀器公司；各種量程微量移液器，德國Eppendorf公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品的前處理

1.3.1.1 自建方法

稱取2 g均質(zhì)樣品(精確至0.000 1 g)，置于50 mL離心管中，加入30 mL超純水，40 ℃超聲萃取30 min，每隔5 min振搖1次；75 ℃水浴加熱5 min，取出后冷卻至室溫，加入10 mL二氯甲烷，搖晃、分層、靜置，5 000 r/min離心10 min；取上清液依次過0.22 μm濾膜、RP柱和Na柱，棄去前3 mL上清液，待上機(jī)檢測。除不稱取樣品外，按照上述操作同時(shí)完成對應(yīng)的空白對照實(shí)驗(yàn)。

1.3.1.2 國標(biāo)方法[20]

按照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》(GB 5009.33—2016)中第一法規(guī)定的前處理方法，委托農(nóng)業(yè)農(nóng)村部肉及肉制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心(南京)進(jìn)行操作。

1.3.2 過濾柱活化

過濾柱和濾膜萃取使用前需要進(jìn)行活化，其活化過程為：RP柱依次用5 mL甲醇、10 mL超純水通過，靜置活化30 min；0.22 μm濾膜用10 mL超純水通過，靜置活化30 min。

1.3.3 色譜條件的建立

使用Dionex IonPacTMAS11-HC RFICTMAnalytical型離子色譜分析柱(4 mm×250 mm)，配備Dionex IonPacTMAG11-HC RFICTMGuard型保護(hù)柱(4 mm×50 mm)。檢測條件為：柱溫30 ℃；抑制器電流149 mA；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量100 μL；KOH淋洗液，淋洗條件見表1。

表1 梯度淋洗條件Table 1 The conditions of eluting solution

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作及檢出限、定量限的確定

根據(jù)以上試驗(yàn)確定的最佳檢測條件，將硝酸鹽、亞硝酸鹽配制成系列濃度混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，其中硝酸根離子濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0 mg/kg，亞硝酸根離子濃度為0.02、0.04、0.06、0.08、0.1、0.15、0.2 mg/kg，上機(jī)檢測。以硝酸根及亞硝酸根離子質(zhì)量濃度(mg/kg)為橫坐標(biāo)(X)，峰面積(μS×min)為縱坐標(biāo)(Y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以此確定最佳線性范圍以及相關(guān)系數(shù)。本試驗(yàn)以3倍信噪比計(jì)算檢測限(limit of detection, LOD)，10倍信噪比計(jì)算定量限(limit of quantitation, LOQ)。

1.3.5 精密度和加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

將豬、牛、羊、雞、鴨5種畜禽肉攪碎后，分別添加低、中、高3個(gè)濃度水平的硝酸鹽及亞硝酸鹽的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。按1.3.1節(jié)方法進(jìn)行前處理，對同一濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品重復(fù)進(jìn)樣6次，計(jì)算其加標(biāo)回收率和精密度。

1.3.6 方法的實(shí)際應(yīng)用

選取市售畜禽肉制品14份，其中腌臘肉制品4份、醬鹵制品3份、肉干制品3份、燒烤制品1份、西式肉制品3份，其樣品前處理方法和檢測條件參照1.3.1、1.3.2和1.3.3節(jié)方法，以此評價(jià)該方法的實(shí)際應(yīng)用效果。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用美國Thermo Fisher Scientific公司的Chromeleon Client Program程序軟件分析數(shù)據(jù)，使用Microcal Origin 7.5(Microcal Software公司)軟件制圖。加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)平行測定6次，計(jì)算其RSD；樣品平行測定3次，計(jì)算其平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢出限、定量限和線性范圍

硝酸鹽和亞硝酸鹽的標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖見圖1，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以此來確定硝酸鹽及亞硝酸鹽的定量限、檢出限和線性范圍。由圖1和表2可知，硝酸鹽和亞硝酸鹽的分離度較好，定量限分別為0.3、0.2 mg/kg，檢出限分別為0.09、0.06 mg/kg。硝酸鹽在0.2～2.0 mg/kg，亞硝酸鹽在0.02～0.2 mg/kg范圍內(nèi)均呈良好的線性關(guān)系，其相關(guān)系數(shù)均為0.999。

圖1 硝酸鹽及亞硝酸鹽的離子色譜圖Fig.1 Ion chromatogram of nitrate and nitrite

表2 硝酸鹽及亞硝酸鹽的線性方程、線性系數(shù)、檢出限及定量限Table 2 Linear equation, linear coefficient, quantitative limit and detection limit of nitrate and nitrite

2.2 加標(biāo)回收率及精密度

由于自建和國標(biāo)方法檢測畜禽肉中硝酸鹽和亞硝酸鹽的本底值不同，本試驗(yàn)依據(jù)各樣品的本底值分別計(jì)算其加標(biāo)量(表3)。分別對豬、牛、羊、雞和鴨5種畜禽肉進(jìn)行回收率的檢測，結(jié)果如表3所示，在低、中、高3個(gè)濃度水平，自建方法所測得硝酸鹽和亞硝酸鹽的加標(biāo)回收率平均值分別在77.0%～106.1%、77.3%～101.0%、65%～97.5%、80.0%～103.3%、90.5%～99.2%，精密度分別在1.12%～8.75%、2.48%～7.05%、1.34%～6.83%、1.29%～7.70%、0.10%～8.20%。而國標(biāo)方法所測得硝酸鹽和亞硝酸鹽的加標(biāo)回收率平均值分別在30.8%～76.8%、16.7%～83.0%、51.7%～89.2%、25.4%～63.0%、50.3%～80.0%，精密度分別在1.82%～10.40%、1.02%～12.26%、2.41%～13.34%、1.14%～11.49%、2.36%～13.01%。這表明自建方法的回收率較高，精密度良好。

表3 自建與國標(biāo)方法加標(biāo)回收率和精密度比較(n=6)Table 3 Comparison of recovery and precision between improved method and GB (n=6)

2.3 方法的實(shí)際應(yīng)用

為評價(jià)自建方法的實(shí)際應(yīng)用效果，選取市售畜禽肉制品為研究對象，檢測其中的硝酸鹽及亞硝酸鹽結(jié)果如表4所示。選取的市售肉制品都含有一定量的硝酸鹽和亞硝酸鹽。硝酸鹽含量在0.518 9～37.062 9 mg/kg，其中僅有豬肉脯含量高于國家限定最大殘留量(30 mg/kg)。此外，醬牛肉、肉松和烤鴨中硝酸鹽含量也有檢出，但均未超標(biāo)。亞硝酸鹽含量在0.046 8～10.693 4 mg/kg，其中無淀粉火腿含量最高，但低于國家限定最大殘留量(30 mg/kg)。

表4 畜禽肉制品中硝酸鹽及亞硝酸鹽含量Table 4 Contents of nitrate and nitrite in livestock andpoultry products

續(xù)表4

序號樣品名稱檢測值/(mg·kg-1) NO-3NO-29五香味牛肉干0.518 90.046 810香酥肉松23.649 20.350 811烤鴨17.767 90.174 512烤腸1.427 07.199 913無淀粉火腿9.748 310.693 414燒烤風(fēng)味培根7.422 81.302 9

3 結(jié)論與討論

離子色譜法因其操作簡便、回收率穩(wěn)定，常被廣泛應(yīng)用于肉制品的檢測[21-22]。本試驗(yàn)改進(jìn)現(xiàn)行有效檢測方法《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》(GB 5009.33—2016)的前處理方法和色譜分析條件，建立的抑制型離子色譜法分離度良好，硝酸鹽和亞硝酸鹽的定量限和檢出限低于國標(biāo)規(guī)定的值，并分別在0.2～2.0、0.02～0.2 mg/kg濃度范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

本試驗(yàn)建立5種畜禽肉的檢測方法，與國標(biāo)方法相比，回收率高、精密度良好。究其原因可能是國標(biāo)方法在前處理時(shí)用濾紙過濾提取液，濾紙的使用會嚴(yán)重干擾硝酸鹽和亞硝酸鹽的檢測結(jié)果[23]。較之國標(biāo)和其他文獻(xiàn)報(bào)道[1,4-6,8-10,22-23]，本試驗(yàn)在前處理時(shí)加入二氯甲烷，可有效萃取畜禽肉制品中脂肪、蛋白質(zhì)等有機(jī)物，從而避免其污染色譜柱，降低柱效和干擾檢測結(jié)果[24-25]。此外，二氯甲烷低毒且價(jià)格便宜，容易去除。在檢測時(shí)還發(fā)現(xiàn)，國標(biāo)方法檢測雞肉的回收率偏低，究其原因可能是雞肉樣品基質(zhì)復(fù)雜，低濃度的檢測物質(zhì)易被干擾[26]。

在對市售畜禽肉制品抽樣檢測結(jié)果顯示，待測樣品中都含有一定量的硝酸鹽和亞硝酸鹽，其中亞硝酸鹽含量均未超標(biāo)。而豬肉脯中硝酸鹽含量為37.062 9 mg/kg，高于國家限定最大殘留量(30 mg/kg)。究其原因可能是生產(chǎn)者為增強(qiáng)消費(fèi)者的購買欲，在加工過程中過量加入硝酸鹽和亞硝酸鹽，使成品形成鮮艷的棕紅色[27]。

本試驗(yàn)建立一種可同時(shí)檢測畜禽肉及其制品中硝酸鹽和亞硝酸鹽含量的抑制型離子色譜法，該方法操作簡單、試驗(yàn)周期短、回收率較高、精密度良好，適用于肉類及其制品中硝酸鹽和亞硝酸鹽的快速測定。