李青,藍夢哲,宋光林,王大霞*,上官佳

1(廣電計量檢測(湖南)有限公司，湖南 長沙，410013) 2(廣州廣電計量檢測股份有限公司，廣東 廣州，510335) 3(貴州省分析測試研究院，貴州 貴陽，550002) 4(湖南省產(chǎn)商品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院，湖南 長沙，410007)

防腐劑是指天然存在或合成的化學(xué)物質(zhì)，能夠有效地延遲微生物生長或化學(xué)變化引起的腐敗，主要作用于食品、藥品、顏料、生物標(biāo)本等物質(zhì)[1-6]。我國已批準(zhǔn)32種可使用的食物防腐劑，最常用的有苯甲酸鈉、山梨酸鉀、脫氫乙酸[7-16]。各種防腐劑都有其自身不同的特點：苯甲酸鈉的毒性較強，在相同的酸度值下抑菌效力僅為山梨酸鉀的1/3，因此許多國家逐漸用山梨酸鉀代替苯甲酸鈉，但是它價格低廉，在碳酸飲料和果汁飲料中依舊被廣泛使用；山梨酸鉀抗菌力強，主要用于醬油、醋、飲料、糕點及面包；脫氫乙酸及鈉鹽類主要對霉菌及酵母菌有較強的抑制作用，在糕點中的應(yīng)用較為廣泛；對羥基苯甲酸酯類對細菌酶系有抑制作用，主要作用于水果飲料；納他霉素對真菌有較強的破壞能力，可以高效地防止食物發(fā)霉，主要作用于果醬、飲料和香腸?！妒称钒踩珖覙?biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》(GB 2760—2016)規(guī)定，山梨酸、脫氫乙酸在糕點中的最大使用量分別為1.0、0.5 g/kg，糕點中納他霉素的表面殘留量不得超過10 mg/kg，苯甲酸、對羥基苯甲酸酯類不得在糕點、面包等焙烤食品中使用。

目前防腐劑檢測方法主要有：氣相色譜法[17-18]、液相色譜法[19-20]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[21-24]。前處理過程一般沿用萃取、離心、沉淀等經(jīng)典方法[25-27]。本實驗主要對焙烤食品中防腐劑殘留量的檢測進行研究，在進行蛋白沉淀和油脂去除處理后，通過HLB固相萃取柱對樣液進行凈化濃縮，提高檢測精度，利用液相色譜的分離能力、質(zhì)譜的高靈敏度，建立了一種可同時測定8種防腐劑的方法，既能滿足各防腐劑的檢出限和定量限要求，又能對各防腐劑混合使用量的計算提供便捷。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇、乙腈、無水乙醇，均為色譜純，上海安譜實驗科技股份有限公司；亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、乙酸銨，均為分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

8種防腐劑標(biāo)準(zhǔn)品：苯甲酸、山梨酸、納他霉素、脫氫乙酸、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、對羥基苯甲酸丁酯，上海安譜實驗科技股份有限公司。

在市內(nèi)商場、小賣部、批發(fā)市場購買不同類型的面包、糕點、蛋糕、餅干、月餅、湘式擠壓糕點樣品，按照要求進行樣品的制備。

1.2 儀器與設(shè)備

AB 4500液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國AB Seiex公司；ME 204E電子天平，瑞士梅特勒公司；TTL-DCⅡ氮吹儀，北京同泰聯(lián)科技發(fā)展有限公司；AS30600BT超聲振蕩儀，天津奧特賽恩斯儀器公司；SBEQ-LG固相萃取儀，上海爭巧科學(xué)儀器公司；H1850高速離心機，湘儀離心機儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品前處理

分別取不同獨立包裝樣品3個以上，用四分法進行樣品分割，然后用粉碎機充分粉碎并攪拌均勻，粉碎效果不理想的樣品用精制機進一步粉碎。取其中200 g密封于4 ℃冰箱保存待測。

準(zhǔn)確稱取2 g樣品，加入10 mL正己烷后渦旋振蕩1 min，超聲提取10 min，4 000 r/min離心5 min后棄去正己烷，在殘留物中加入2 mL乙醇、2 mL亞鐵氰化鉀溶液、2 mL乙酸鋅溶液，渦旋混勻后加入15 mL超純水，超聲提取30 min，12 000 r/min離心3 min，轉(zhuǎn)移上清液至25 mL容量瓶，加水定容至刻度。取5 mL樣品溶液加至已用甲醇和水活化的HLB固相萃取柱上，用5 mL甲醇洗滌HLB柱，收集全部流出液，50 ℃氮吹至近干，加入1 mL體積分?jǐn)?shù)50%甲醇水溶液溶解殘留物，樣液過0.22 μm濾膜，取500 μL進行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定。

1.3.2 溶液的配制

亞鐵氰化鉀溶液0.25 mol/L：稱取106 g亞鐵氰化鉀，加入適量水溶解，用水定容至1 000 mL。

乙酸鋅溶液1.20 mol/L：稱取220 g乙酸鋅溶于少量水中，加入30 mL冰乙酸，用水定容至1 000 mL。

乙酸銨溶液(5 mmol/L)：稱取0.385 g乙酸銨，加入適量水溶解，用水定容至1 000 mL，經(jīng)0.22 μm水相微孔濾膜過濾后備用。

脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液：準(zhǔn)確稱取0.01 g脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)品(精確至0.1 mg)于10 mL容量瓶，用NaOH溶液(0.02 mol/L)溶解并用水定容，配成1.00 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

苯甲酸、山梨酸、納他霉素、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯、對羥基苯甲酸丁酯標(biāo)準(zhǔn)儲備液：分別稱取0.01 g的苯甲酸、山梨酸、納他霉素、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯、對羥基苯甲酸丁酯標(biāo)準(zhǔn)品(精確至0.1 mg)于10 mL容量瓶，用甲醇溶解并定容，配成1.00 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

苯甲酸、山梨酸混合中間工作液(10.00 μg/mL)：分別移取0.1 mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液于10 mL容量瓶，用甲醇溶解并定容。

脫氫乙酸、納他霉素、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯、對羥基苯甲酸丁酯混合中間工作液(1.00 μg/mL)：分別移取0.1 mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液于100 mL容量瓶，用甲醇溶解并定容。

混合標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別移取不同體積的混合中間工作液于10 mL容量瓶，用基質(zhì)空白溶液定容至刻度，配制成苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸為0.10、0.20、0.50、0.80、1.00 μg/mL，納他霉素、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯、對羥基苯甲酸丁酯為0.01、0.02、0.05、0.08、0.10 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3.3 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法的建立

1.3.3.1 液相色譜條件

色譜柱：C18(100 mm×2.1 mm，2.6 μm)；流動相A：5 mmoL/L乙酸銨溶液；流動相B：乙腈；流速0.2 mL/min；柱溫35 ℃；進樣量1.0 μL；流動相A的具體梯度洗脫條件：0～1 min，95%；1～3 min，95%～10%；3～6 min，10%；6～7 min，10%～95%；7～8 min，95%。

1.3.3.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源(electrospray ionization)；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測模式(multiple reaction monitoring)；氣簾氣壓力(curtain pressure)：30.0 (1 psi=6.895 kPa)；離子化電壓：正離子模式(ESI+)4 500 V，負離子模式(ESI-)-4 500 V；離子源溫度：550.0 ℃；噴霧氣：55.0 psi；輔助加熱氣：55.0 psi；Q1/Q3離子對、碰撞能量(collision energy)、去簇電壓(uncluster voltage)及離子模式見表1。

表1 八種防腐劑的Q1/Q3離子對、碰撞能量、去簇電壓及離子模式Table 1 Acids pairs, collision energy, declustering voltageand ion patterns of 8 preservatives

續(xù)表1

防腐劑母離子Q1子離子Q3去簇電壓碰撞能離子模式對羥基苯甲酸丙酯179.0179.092.0?136.0-50-50-33-20ESI-對羥基苯甲酸丁酯193.0193.092.0?136.0-160-60-28-25ESI-

注：*表示定量離子

儀器條件確定后，配制不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液進行測定，根據(jù)化合物的儀器響應(yīng)值，以3倍信噪比和10倍信噪比來確定物質(zhì)的檢出限和定量限。在檢出限和定量限確定后配制不同梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液進行測定，根據(jù)線性關(guān)系擬合確定其線性范圍。

1.3.4 線性范圍、標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限及定量限的確定

選擇月餅基質(zhì)空白溶液配制各物質(zhì)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在穩(wěn)定的儀器條件下測定其線性范圍及標(biāo)準(zhǔn)曲線，以分析物峰面積對其濃度建立線性關(guān)系，通過回歸方程Y=a+bX及線性關(guān)系(R2)確定各物質(zhì)的線性范圍，根據(jù)各物質(zhì)線性范圍及限值確定各物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度。以各物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線最低檢測濃度進行加標(biāo)實驗，平行測定20次，按信噪比S/N=3計算檢出限，按信噪比S/N=10計算定量限。

1.3.5 方法準(zhǔn)確度實驗

根據(jù)各物質(zhì)的線性范圍及其在面包、糕點、蛋糕、餅干、月餅、湘式擠壓糕點樣品中的最大允許使用量，以月餅為基質(zhì)，選擇高、中、低3個不同層次的濃度進行加標(biāo)，每個濃度平行測定3次進行準(zhǔn)確度實驗，通過平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation, RSD)來確定方法的準(zhǔn)確度是否滿足方法學(xué)的要求。

1.3.6 方法的實際應(yīng)用

在確立了各物質(zhì)的線性范圍、檢出限及定量限，并且方法準(zhǔn)確度實驗?zāi)軌驖M足方法學(xué)要求后，在市內(nèi)各商場、小賣部及批發(fā)市場隨機購買數(shù)量不等的面包、糕點、蛋糕、餅干、月餅、湘式擠壓糕點樣品，對樣品進行均勻地粉碎制備。按照所建立的檢測方法進行前處理及儀器測定，對檢測數(shù)據(jù)進行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器條件的確定

選擇乙腈-乙酸銨、甲醇-乙酸銨的流動相兩組組合進行比對，主要考察各目標(biāo)物的分離度，同濃度下的響應(yīng)值，在以乙腈-乙酸銨溶液為流動相時，各目標(biāo)物的分離度比以甲醇-乙酸銨溶液為流動相時效果更好，最終選擇乙腈-乙酸銨溶液作為本方法的流動相，具體數(shù)據(jù)如表2所示。

表2 同濃度下不同流動相相應(yīng)值數(shù)據(jù)Table 2 Response data of different mobile phases at the same concentration

2.2 樣品前處理優(yōu)化

焙烤食品中蛋白質(zhì)對防腐劑項目的檢測具有較大的干擾作用。亞鐵氰化鉀和乙酸鋅組合溶液是常用去蛋白試劑，在去除油脂和蛋白后選擇HLB固相萃取柱進行凈化操作，凈化效果和回收率都能滿足要求，糕點樣品2.00 mg/kg濃度加標(biāo)實驗中，各物質(zhì)的回收率在81.3%～97.4%之間。

2.3 線性范圍、標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限及定量限

選擇月餅基質(zhì)空白溶液配制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以分析物峰面積對其濃度建立線性關(guān)系，得到線性方程和線性范圍，檢出限按信噪比S/N=3，定量限按信噪比S/N=10計算。在0.02～2.00 mg/kg范圍內(nèi)納他霉素、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯、對羥基苯甲酸丁酯的線性關(guān)系良好，r2均在0.998以上，檢出限為0.01 mg/kg，定量限為0.04 mg/kg。在0.1～50.00 mg/kg范圍內(nèi)苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸的線性關(guān)系良好，r2均在0.998以上，檢出限分別為0.1、0.05、0.01 mg/kg，定量限分別為0.4、0.2、0.04 mg/kg。

2.4 方法準(zhǔn)確度實驗

將8種防腐劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液以高、中、低3個水平分別添加到面包、糕點、蛋糕、餅干、月餅、湘式擠壓糕點樣品中，按照本實驗前處理和儀器條件進行處理，驗證方法的準(zhǔn)確度。每個濃度平行測定3次，平均回收率在80.1%～101.2%之間，RSD在1.1%～6.7%之間(表3)。

表3 方法準(zhǔn)確度實驗數(shù)據(jù)(n=3)Table 3 Experimental data on method accuracy

續(xù)表3

化合物添加質(zhì)量濃度/(mg·kg-1)回收率/%RSD/%脫氫乙酸0.183.10.589.22.081.44.1對羥基苯甲酸甲酯0.190.20.594.32.098.64.2對羥基苯甲酸乙酯0.191.50.589.32.090.61.1對羥基苯甲酸丙酯0.189.40.5101.22.089.86.7對羥基苯甲酸丁酯0.187.00.588.22.097.35.6

2.5 樣品測定

從市場抽取112批次不同類型的樣品，按照本文前處理分別對面包、糕點、蛋糕、餅干、月餅、湘式擠壓糕點進行檢測，其中湘式擠壓糕點作為質(zhì)控樣，試驗結(jié)果(表4)表明：在15批次月餅、10批次糕點、12批次湘式擠壓糕點中有脫氫乙酸檢出，15批次糕點、5批次湘式擠壓糕點、15批次月餅中有山梨酸檢出，3批次面包中有納他霉素檢出，對羥基苯甲酸酯類和苯甲酸在樣品中均未檢出。

3 結(jié)論

本研究通過液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀建立了同時測定焙烤食品中8種防腐劑的方法。樣品經(jīng)去除脂肪和蛋白質(zhì)后進行HLB固相萃取柱的凈化，氮吹濃縮后經(jīng)液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進行含量的測定。本方法可同時對苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸、納他霉素、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯、對羥基苯甲酸丁酯的殘留量進行檢測，各物質(zhì)在0.01～50 mg/kg的區(qū)間內(nèi)有良好的線性，相關(guān)系數(shù)在0.998 67～0.999 84，檢出限在0.01～0.1 mg/kg，定量限在0.04～0.4 mg/kg，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.1%～

表4 樣品中防腐劑檢出數(shù)Table 4 Number of samples detected with preservatives

注：“-”表示未檢出

6.7%，均能滿足方法學(xué)的要求，也能夠滿足《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》GB 2760—2016。本方法測定的8種物質(zhì)均有防腐作用，對于監(jiān)測項目防腐劑混合使用時各自用量占其最大使用量的比例之和的檢測有著較大幫助，并且能夠?qū)Σ坏檬褂玫姆栏瘎┻M行確證和定量。