王德寶，馬文淑，王柏輝，張俊英，康連和，王莉梅，張園園，喬建敏，李星云，王曉冬，郭天龍*

1(內蒙古農牧業(yè)科學院，內蒙古 呼和浩特，010031) 2(內蒙古農業(yè)大學 食品科學與工程學院，內蒙古 呼和浩特，010031) 3(鄂爾多斯市食品檢驗檢測中心，內蒙古 鄂爾多斯，017000) 4(內蒙古鄂爾多斯生態(tài)環(huán)境職業(yè)學院，內蒙古 鄂爾多斯，017010)

發(fā)酵香腸是指將絞碎的瘦肉與丁狀脂肪及輔料混勻、腌制后灌入腸衣，經自然或添加外源發(fā)酵劑發(fā)酵成熟而制成一類pH值較低、色澤誘人、風味獨特、保藏時間長的發(fā)酵肉制品[1-2]。適宜發(fā)酵溫度和環(huán)境濕度下，微生物發(fā)酵劑快速繁殖、分解糖類生成乳酸、乙酸等有機酸[3]，促使香腸pH值迅速降低到安全pH 5.3以下。隨著環(huán)境溫度、濕度下降及酸度降低，肌球重鏈蛋白結合水分能力逐漸減弱[4]，促使香腸在成熟過程中水分快速蒸發(fā)，成品水分活度aw低于0.85，低酸度及水分活度抑制香腸中大腸菌群等腐敗、致病菌生長繁殖并降低其數量，提高香腸成品衛(wèi)生和安全質量[5]。發(fā)酵成熟過程中發(fā)酵劑分泌蛋白酶及脂酶，將蛋白、脂質分解為小分子游離氨基酸和脂肪酸，既為人體易吸收的營養(yǎng)素，也為香腸風味形成提供重要前體物質[4,6]。肉制品中60%風味物質來源于脂質氧化，脂質變化對肉制品風味形成具有決定性作用，也是風味物質形成的主要途徑[7]。干腌肉制品風味與脂質在加工成熟過程中有重要聯(lián)系，脂質降解是該類肉制品風味形成主要來源，TOLDRA等[6-12]對此進行了相關研究。確定發(fā)酵肉制品最佳成熟時間，對于降低香腸產品加工成本及提高香腸食用品質及風味感官具有重要意義。

本課題組以清酒乳桿菌和木糖葡萄球菌為復合發(fā)酵劑，制作燕麥羊肉發(fā)酵香腸，探究成熟時間對發(fā)酵羊肉香腸食用品質、脂質氧化及風味物質積累的影響，旨在為香腸生產及品質改善提供數據和理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與儀器

原料肉∶羊肉，肥肉和瘦肉，分別源自內蒙古錫林浩特市烏珠穆沁肉羊后腿及羊尾。腸衣：20～25 mm 膠原蛋白腸衣。熟制燕麥粉,呼和浩特東瓦窯市場。

發(fā)酵劑：清酒乳桿菌(Lactobacillussakei)、木糖葡萄球菌(Staphylococcusxylosus)，由內蒙古農業(yè)大學肉品科學技術團隊篩選、鑒定并保藏。

主要化學試劑：硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid，TBA)(分析純)，上海國藥集團。

主要儀器：HD-3A 智能水分活度測量儀，深圳市銀都科技有限公司；CR-410型色差計，日本柯尼卡美能達公司；TU-1800 紫外分光光度計，日本HMADZU公司；Master DHS 型動態(tài)頂空進樣器、GC-MS DSQ II 型單四極桿氣相色譜質譜聯(lián)用儀，美國 Thermo 公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 發(fā)酵香腸制作

試驗配方：羊后腿肉質量分數80%、羊尾肥膘質量分數15%、燕麥粉質量分數5%、蔗糖質量分數0.5%、食鹽 2.5%、亞硝酸鈉 70 mg/kg、葡萄糖質量分數0.5%、NaNO3100 mg/kg、抗壞血酸質量分數0.05%、發(fā)酵劑 107CFU/g(L.sakei∶S.xylosas=1∶2)。

工藝條件參照王德寶等[12]的方法并略作修改。

1.2.2 試驗設計

通過預試驗及單因素模擬試驗，將清酒乳桿菌與木糖葡萄球菌作為復合發(fā)酵劑制作發(fā)酵燕麥羊肉腸。試驗主要探究發(fā)酵成熟時間對燕麥羊肉香腸食用品質及感官的影響。分別于腌制后(0 d)、發(fā)酵結束(1 d)、成熟第一階段(1～4 d)、成熟第二階段(4～7 d)4個工藝點隨機取樣，測定不同階段香腸的食用品質、脂質氧化及特征風味變化。剩余樣品保存于-80 ℃。

表1 發(fā)酵香腸加工工藝條件Table 1 Processing conditions of fermented sausages

1.2.3 色差、水分活度(aw)、pH值、硫代巴比妥酸反應物(thiobarbituric acid reactive substance, TBARS)

參照GB 5009.237—2016 《食品pH值的測定》及BINGOL等[13-14]的方法測定香腸pH、TBARS值；使用智能水分活度儀、色差計測定香腸aw、亮度(L*)、紅度值(a*)、黃度值(b*)。

1.2.4 風味測定

參照羅玉龍等[15]的方法略作修改，在 20 mL 樣品瓶中加入 4 g 粉碎香腸樣，將老化的萃取頭插入樣品瓶使石英纖維頭暴露于樣品上部空間，在 60 ℃條件下吸附 40 min 后拔出，萃取頭在 GC 進樣口(250 ℃)下解吸附 3 min。

揮發(fā)性風味成分測定的 GC-MS條件。GC 條件：TR-5 型毛細色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，載氣為 He，載氣流速為1.0 mL/min，傳輸線溫度250 ℃，不分流進樣，進樣時間1 min；升溫程序：40 ℃保持3 min，以4 ℃/min升溫到150 ℃，保持1 min，再以5 ℃/min升溫到200 ℃，最后以20 ℃/min升至230 ℃，保持5 min。MS 條件：離子源溫度250 ℃，進樣口溫度250 ℃，質量掃描范圍(m/z)30～400。

質譜數據經與 MEANLIB、NISTDEMO 和 Wiley Library 檢索定性，將匹配度大于 800 作為鑒定依據。

1.3 數據處理

采用 Excel 和 SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件對數據進行統(tǒng)計處理和顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 成熟時間對香腸pH值的影響

不同成熟時間下發(fā)酵香腸的pH值變化如圖1所示。發(fā)酵成熟過程中，燕麥羊肉香腸pH值呈現先下降后上升再下降的變化規(guī)律。發(fā)酵1 d后香腸pH值由0 d時5.46降低到4.83，下降幅度達0.63。這是由于微生物發(fā)酵劑在發(fā)酵過程迅速繁殖，碳水化合物被利用和分解為乳酸、醋酸等小分子有機酸致使香腸pH值急劇下降，這與WANG等[16]研究結果相一致。成熟過程(1～4 d)香腸pH值呈現略微上升，這一結果可能是由于香腸中蛋白質逐漸被分解并伴隨著氨類等堿性物質的形成所致[17]。成熟第一階段(1～4 d)結束后，香腸pH值為4.89，顯著低于肉制品發(fā)酵酸度要求5.3(P<0.05)[18]。成熟第二階段(4～7 d)結束后，香腸pH值再次下降0.21，降為4.68，這可能由于成熟后期脂質等分解使香腸中脂肪酸等酸性物質增加所致[12]。

圖1 不同成熟時間對發(fā)酵香腸pH值的影響Fig.1 Effect of different ripening time on the pH value offermented sausages注：不同小寫字母表示具有顯著性差異(P<0.05)(下同)

2.2 成熟時間對香腸水分活度值(aw)的影響

aw與香腸中水分含量呈線性相關關系，其高低是衡量香腸保質期的一個重要柵欄技術因子。aw低于0.9時，食品中腐敗菌生長受到抑制；低于0.85時，酶活性大幅下降；低于0.6時，霉菌及耐鹽菌活性降到最低[19-20]。

如圖2所示，腌制結束(0 d)后，對應aw約為0.95。發(fā)酵結束(1 d)后，香腸aw仍為0.95，這可能是因為香腸pH值急劇下降改變肌球重鏈蛋白對水分束縛能力[4]，釋放的自由水彌補香腸中少量蒸發(fā)的水分。成熟第一階段(1～4 d)，香腸所處環(huán)境溫度、濕度分別由30 ℃、95%下調到15 ℃及80%～85%，使得香腸內部與外部形成較大水分梯度差，促使香腸中水分快速向外部遷移[21]。成熟第一階段(1～4 d)結束，香腸aw降到0.83，下降幅度近0.12。有研究報道，分別低于pH 5.3和aw0.85有利于抑制香腸中有害菌、腐敗菌的生長繁殖[5]，因此低pH值和aw值是保證香腸安全性能的重要指標。進入成熟第二階段，溫度下調到13～14 ℃，濕度下調為70%～75%，較第一階段濕度下調幅度達10%；成熟結束后香腸aw值下降到0.69，較第一階段下降近0.14。由上述結果可知，成熟2個階段下降幅度差異顯著(P<0.05)，成熟過程環(huán)境濕度和溫度變化是影響香腸aw值下降關鍵因素。

圖2 不同成熟時間對發(fā)酵羊肉香腸aw的影響Fig.2 Effect of different ripening time on the aw offermented sausage

2.3 成熟時間對香腸色澤的影響

衡量色澤指標包括亮度(L*)、紅度(a*)及黃度(b*)。亮度(L*)反應香腸白暗程度，值越大表示香腸表面越鮮亮；紅度(a*)表示香腸肉質鮮紅色程度。當香腸亮度及紅度值越高時，香腸肉質呈現誘人的玫瑰色澤。如表2所示，0～7 d香腸亮度值呈先下降后上升的趨勢，4 d時香腸亮度值降到最低，但與原料肉、發(fā)酵結束及7 d時差異不顯著(P>0.05)。香腸經發(fā)酵成熟后a*顯著上升，顯著高于原料肉a*(P<0.05)，表明發(fā)酵成熟工藝有助于改善香腸紅度，這可能與低 pH 值促使亞硝酸鹽與肌紅蛋白結合形成亞硝肌紅蛋白有關[22]。相比1、4、7 d 3個階段香腸紅度變化，1 d時a*最高，4 d時稍有下降，7 d時香腸a*較1 d時下降近4.5。0 d時，香腸b*值最低，顯著低于其他3個階段(P<0.05)，表明原料肉質較好；發(fā)酵1 d結束后，b*值達到最高，1～7 d成熟過程香腸b*呈下降趨勢。綜合香腸紅度和黃度值，經發(fā)酵結束后成熟3 d時(即4 d)香腸色澤好于其他階段。

表2 不同成熟時間對發(fā)酵香腸色澤的影響Table 2 Effect of different ripening time on the colorsof fermented sausages

注:同一列不同上標字母代表有顯著性差異(P<0.05)，相同則差異不顯著(P>0.05)(下同)

2.4 成熟時間對香腸脂質氧化(TBARS)值的影響

脂質氧化對肉制品風味形成和品控具有重要意義。脂質適度氧化可產生許多有利產品的特征風味物質，過度氧化則會給產品帶來不愉快的風味[23]。脂質過氧化產物丙二醛(malondialdehyde, MDA)是衡量脂質氧化程度和油脂酸敗的主要指標[24]，MDA含量變化與脂質氧化程度呈現正相關。

不同成熟時間下發(fā)酵燕麥羊肉香腸的TBARS結果見圖3。香腸TBARS值隨發(fā)酵成熟時間延長呈先上升后下降再上升的變化趨勢，各階段香腸TBARS值均低于0.5 mg MDA/kg且差異顯著(P<0.05)，表明香腸在整個成熟過程中脂質氧化分解處于正常范圍[25]。發(fā)酵1 d結束后，香腸TBARS值由0.38增加為0.49 mg MDA/kg，高于香腸其他加工階段。王瑞花等[26]與YOSHIDA等[27]研究高溫烹制對豬肉脂質氧化的影響，發(fā)現高溫長時烹制致使多不飽和脂肪酸含量下降、MDA含量增加，高溫是豬肉中MDA含量增加的主要因素，因而上述結果可能是發(fā)酵過程中溫度較高所致。1～4 d時，香腸TBARS值呈現下降趨勢，在4 d結束時TBARS值降為0.39 mg MDA/kg。SUN等[5]研究表明乳酸菌和葡萄球菌抗氧化活性和抑制脂質氧化能力高于其他菌株。LIN等[28]研究表明菌株呈現的潛在抗氧化能力與它們的抗氧化酶系統(tǒng)(超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶)及抑制物質(尿酸、谷胱甘肽、多糖、NADH和NADPH)有關。TBARS值下降的原因可能與發(fā)酵結束香腸中乳酸菌和木糖葡萄球菌數量急劇增加和抗氧化酶、抑制氧化物質生成有關。4～7 d時香腸中MDA含量又開始緩慢上升，這可能與此成熟過程中溫度及水分活度(aw)下降，以及有關酶活性降低和抑制物質形成有關系。

圖3 不同成熟時間對發(fā)酵香腸TBARS變化的影響Fig.3 Effect of different ripening time on the TBARS offermented sausages

2.5 成熟時間對香腸特征風味組成的影響

香腸中風味物質主要源于蛋白質及脂質氧化分解，如氨基酸Strecker降解、脂質氧化及Maillard反應是構成風味物質生成的主要途徑[29]。封莉等[30]研究表明腌制臘肉制品風味形成主要依賴于脂質降解及氧化，醛類和酮類是脂質氧化的主要特征風味產物。也有研究表明，大多數支鏈醛是來自于氨基酸的Strecker降解[31]，由表3可知，中式香腸中的支鏈醛含量較少，可見Strecker降解在中式香腸的生產過程中對風味的貢獻很微弱。

由表3可知，原料肉中檢出30種風味物質，其中醛類物質9種(41.27%)，醇類物質7種(17.71%)，酯類物質8種(15.66%)，酮類物質2種(1.03%)，酸類物質1種(1.12%)，其他物質占總揮發(fā)性物質峰面積比為23.21%?？梢娫先庵兄饕L味物質來自于醛類、醇類、酯類及其他萜烯類，其中醛類化合物是原料肉風味組成中主要成分。添加清酒乳桿菌及木糖葡萄球菌并經發(fā)酵成熟后，燕麥羊肉香腸中揮發(fā)性風味物質種類及含量呈現明顯變化。1、4、7 d香腸中風味物質種類分別增加到33、37、41。隨著成熟時間延長，香腸中風味物質含量呈現先上升后下降的趨勢，含量在4 d時達到最高，且顯著高于其他階段(P<0.05)，醛類及醇類變化成為主要貢獻源。綜上,成熟時間對發(fā)酵燕麥香腸中揮發(fā)性風味物質組成具有顯著影響。

表3 不同成熟時間對發(fā)酵香腸中風味組成的影響Table 3 Effects of different ripening time on the flavor composition of fermented mutton sausages

續(xù)表3

類別序號中文名英文名CAS號分子式保留時間峰面積(×107)0 d1 d4 d7 d占總揮發(fā)性物質峰面積百分比/% 15.669.804.028.66酮類384-羥基-2-丁酮4-Hydroxy-2-butanone590-90-9C4H8O211.530.09±0.01a—0.13±0.00a0.20±0.01a393,5-辛二烯-2-酮3,5-Octadien-2-one30086-02-3C8H12O14.560.24±0.02a——0.15±0.09a403-羥基-2-丁酮2-Butanone, 3-hydroxy-513-86-0C4H8O23.45———0.12±0.01總量0.33—0.130.57占總揮發(fā)性物質峰面積百分比/% 1.03—0.241.39酸類41乙酸Acetic acid64-19-7C2H4O21.860.36±0.04a0.47±0.13a1.58±0.17b1.89±0.10b總量0.360.471.581.89占總揮發(fā)性物質峰面積百分比/%1.121.512.964.6042β-蒎烯Bicyclo[3.1.1]heptane, 6,6-dimethyl-2-methylene-, (1S)-18172-67-3C10H1612.381.63±0.09b0.77±0.04a1.25±0.05ab0.94±0.02a萜類432-正戊基呋喃Furan, 2-pentyl-3777-69-3C9H14O12.712.93±0.22a2.68±0.19a5.79±0.60b3.47±0.10a及44D-檸檬烯D-Limonene5989-27-5C10H1613.531.53±0.20a1.53±0.16a1.52±0.19a1.53±0.01a其他45γ-松油烯γ-Terpinene99-85-4C10H1614.110.36±0.16ab0.29±0.06a0.22±0.02a0.43±0.03b46草蒿腦Estragole140-67-0C10H20O216.640.49±0.09b0.41±0.03b0.44±0.05b0.28±0.02a47茴香腦Anethole104-46-1C10H12O18.000.53±0.09a0.71±0.08a0.57±0.10a0.51±0.05a48α-蒎烯α-Pinene80-56-8C10H1611.25———0.32±0.01總量7.476.399.797.48占總揮發(fā)性物質峰面積百分比/% 23.2120.5918.3218.19

注：“—”表示未檢出峰

相比香腸中其他揮發(fā)性風味物質，醛類物質在成熟過程中占總揮發(fā)性風味達50%以上，這與西式干發(fā)酵香腸風味組成結果相一致[32]。低閾值并呈現廣泛香氣的醛類是發(fā)酵肉制品中重要特征風味物質[33]。特別是C6-C10的醛類是所有熟肉肉制品中重要風味物質[34]。由表3可知，含量最高的3種醛類分別是庚醛、壬醛和己醛。己醛具有青草味，庚醛和正壬醛呈現油脂香味，3 種醛類的前體是亞油酸和亞麻酸[35-36]。亞油酸自動氧化生成 C9-和 C13-的氫過氧化物，而C13-的氫過氧化物裂解產物為正己醛[37-38]。正己醛是脂質氧化標志性產物，其濃度代表脂肪氧化狀態(tài)及熟肉風味形成[39]。且4 d時正己醛、庚醛及壬醛含量高于1和7 d，因此選擇合適成熟時間有助于提高香腸中特征風味物質含量。有研究報道，支鏈氨基酸(如亮氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸等)通過Strecker降解可形成較多支鏈醛[40]。亮氨酸在微生物代謝作用下生成3-甲基丁醛，其閾值較低，低濃度條件下具有愉快的麥芽香氣和水果香氣[41]，對發(fā)酵肉制品風味有顯著貢獻，也可與含硫化合物進一步反應產生類似培根的風味[42]。而香腸中支鏈醛類僅在成熟7 d時檢出3-甲基丁醛且含量較低，可知Strecker降解對香腸風味貢獻較弱。

圖4 燕麥羊肉香腸中風味化合物離子流圖Fig.4 Ion flow diagram of flavor compounds in oatmeallamb sausage

相比醛類，醇類化合物閾值較高，較多不飽和醇類有很好的香味。香腸正己醇和乙醇含量較高，隨著成熟時間延長其含量逐漸下降，這可能是其與酸類結合生成酯類有關。其次，香腸中1-戊烯-3-醇和1-辛烯-3-醇又被稱為蘑菇醇，具有濃郁的蘑菇香味，主要是來自于前體物——花生四烯酸和亞油酸的脂質氧化[43]，其含量隨成熟時間延長而增加，為香腸中香味組成做出重要貢獻。苯甲醇也是重要芳香醇之一，常以酯類形式存在于玫瑰香油或香腸中。其他醇類為酯類的形成提供重要前體。香腸中酯類含量低于醇類，而酯類物質具有典型的水果香氣，其存在可使香腸因短鏈酸類帶來的尖刺感變得更加柔和，且高含量的乙酯類風味物質是中式香腸有別于其他肉制品風味的典型特征[44]。酯類含量隨香腸成熟時間呈現先下降后上升的趨勢，總含量在4 d時最低。且香腸中酯類主要以短鏈C3-C10為主，而C10酯類占總酯類百分比≤20%。說明隨著成熟時間延長有助于短鏈醇類向酯類轉變。酯類物質具有典型的水果香味，如己酸甲酯、己酸乙酯、己酸戊酯及辛酸甲酯和辛酸乙酯具有典型菠蘿香型的香氣，加工4 d時上述酯類風味物質含量均高于1和7 d時含量，說明加工時間對水果香型酯類風味物質在香腸積累具有重要影響。

酮類物質可賦予香腸水果香味、花香。發(fā)酵香腸中檢出 3-羥基-2-丁酮和 4-羥基-2-丁酮，原料肉僅檢出 4-羥基-2-丁酮。3-羥基-2-丁酮常被叫做乙偶姻，具有強烈的奶油、脂肪香味，高度稀釋后具有令人愉快的奶香味，僅在7 d時檢出。3-羥基-2-丁酮的生成是由于香腸中葡萄糖代謝產生二乙酸，最終轉化為3-羥基-2-丁酮[45]。檢出的酸類是經異型發(fā)酵而來的乙酸，香腸含量隨加工時間呈現上升趨勢，且4與7 d差異不顯著(P>0.05)。此外，發(fā)酵羊肉香腸中還檢出了β(α)-蒎烯、D-檸檬烯、γ-松油烯、2-正戊基呋喃、草蒿腦、茴香腦，并且總相對含量在4 d時達到最高為9.79。2-正戊基呋喃是亞油酸自動氧化的產物，是含脂食品中重要的香味物質[46]，且含量同樣在4 d時達到最高。綜上，成熟時間對發(fā)酵羊肉香腸風味積累具有影響作用，且在加工4 d時整體風味相對含量達到最高。

3 結論

以清酒乳桿菌與木糖葡萄球菌作為復合發(fā)酵劑，探究不同成熟時間對羊肉燕麥發(fā)酵香腸的理化性質以及風味物質的影響。發(fā)酵成熟4 d時香腸pH值(4.89)低于發(fā)酵肉制品安全酸度5.3；水分活度也降為0.83，達到抑制香腸中大部分微生物活性的水平，且此時香腸硬度較小。

4 d時香腸紅度值較高，與最高值46.05(發(fā)酵結束1 d)差異不顯著(P>0.05)；且4 d時TBARS降為0.39 mg MDA/kg。成熟時間為3 d有助于改善香腸色澤和抑制脂質過氧化。

除此之外，4 d時香腸中醛類、醇類及萜類等風味物質相對含量高于其他階段，且各種風味物質總量在加工4 d時也高于其他階段。總之，發(fā)酵1 d后成熟3 d時(即4 d)的工藝對半干香腸加工成本和品質的提高具有重要意義。