任 彬，蒲小秋

（1.嶺南師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣東湛江 524048；2.湛江第一中學(xué)，廣東湛江 524038）

牡蠣（Oyster）俗稱蠔，是世界上第一大養(yǎng)殖貝類，也是我國(guó)四大養(yǎng)殖貝類之一，肉味鮮美，具有較高的食用價(jià)值和藥用價(jià)值[1]。牡蠣中富含糖原、維生素、不飽和脂肪酸和微量元素等多種營(yíng)養(yǎng)活性物質(zhì)，有消除疲勞、抗氧化、改善血液循環(huán)、促進(jìn)中樞神經(jīng)發(fā)育、預(yù)防糖尿病等功效，因此牡蠣食品廣受消費(fèi)者喜愛[2-5]。目前，我國(guó)水產(chǎn)品加工工藝和機(jī)械化水平較為落后，牡蠣加工副產(chǎn)品（如性腺等）未能有效利用，造成了一定的經(jīng)濟(jì)損失。

近年來(lái)，隨著生活水平不斷提高，調(diào)味品工業(yè)在我國(guó)得到了較快發(fā)展，功能單一的調(diào)味品已經(jīng)不能滿足所有消費(fèi)者的需要，人們對(duì)復(fù)合調(diào)味品尤其是蠔油、海鮮醬油等海鮮復(fù)合調(diào)味品頗為青睞[6]。天然牡蠣中含有豐富的肌苷酸、鳥苷酸、谷氨酸、琥珀酸等呈鮮物質(zhì)，是生產(chǎn)調(diào)味品的優(yōu)質(zhì)原料[7]。利用酶解工藝將牡蠣加工下腳料——性腺開發(fā)成美味的調(diào)味品，不僅可以提高牡蠣生產(chǎn)附加值、拓寬牡蠣類產(chǎn)品的消費(fèi)市場(chǎng)、減少污染浪費(fèi)，還可以為牡蠣的綜合利用和深度加工提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 原料與試劑

新鮮牡蠣，購(gòu)于湛江海鮮水產(chǎn)市場(chǎng)；胰蛋白酶（2.4×105U/g）、木瓜蛋白酶（2.4×105U/g）、氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品（2.5 μmol/mL），上海Sigma（中國(guó)） 有限公司提供；活性干酵母，湖北安琪酵母股份有限公司提供；食鹽、食醋、白砂糖、麥芽糖、醬油、味精，購(gòu)自成都永輝超市；肌苷酸鈉、羧甲基纖維素鈉（CMC-Na，食品級(jí)），滄州禧潤(rùn)食品配料有限公司提供；其余試劑，均為分析純，上海國(guó)藥集團(tuán)有限公司提供。

1.1.2 儀器

S220型酸度計(jì)，梅特勒－托利多國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司產(chǎn)品；NKY6120型顏色法凱氏定氮儀，上海望海環(huán)境科技有限公司產(chǎn)品；HI2003型多功能攪拌機(jī)，上海海菱有限公司產(chǎn)品；小型打漿機(jī)，九陽(yáng)股份有限公司產(chǎn)品；TLE104E型分析天平，梅特勒－托利多國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司產(chǎn)品；TGL-20M型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司產(chǎn)品；S-433D型全自動(dòng)氨基酸分析儀，德國(guó)Sykam（賽卡姆）公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 工藝流程

牡蠣性腺→預(yù)處理→酶解→滅酶→脫腥→調(diào)味料調(diào)配→過(guò)濾→灌裝→滅菌→成品。

1.2.2 操作要點(diǎn)

（1） 預(yù)處理。去殼取牡蠣性腺，用清水洗凈，塑料網(wǎng)篩瀝水，利用打漿機(jī)均勻絞碎組織后裝于封口袋中，-18℃下貯藏，使用前解凍。

（2）酶解。將牡蠣性腺加入1倍質(zhì)量的水，沸水浴10 min，冷卻至一定溫度后，在適宜條件下酶解。

（3） 滅酶。將酶解液加熱至100℃，保持10 min，冷卻至30℃以下。

（4） 脫腥。在滅酶后的酶解液中添加除腥劑，40℃下保溫50 min。

（5） 調(diào)配。將一定量的酶解液、醬油、食鹽、麥芽糖加入容器中混勻，再加入用少量熱水預(yù)先溶化的白砂糖，再依次加入CMC-Na、味精、肌苷酸鈉和醋，攪拌均勻。

（6）過(guò)濾。除去未溶解的原料及雜質(zhì)。

（7）裝瓶。過(guò)濾后的調(diào)味品裝入瓶中，封口。

（8）滅菌。滅菌，自然冷卻，貼商標(biāo)，即得成品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 分析方法

氨基氮總量按照GB 5009.124—2016甲醛滴定法測(cè)定，總氮量按照GB 5009.5—2016凱氏定氮法測(cè)定，感官評(píng)價(jià)按鄧嫣容[8]的方法進(jìn)行。

感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)見表1。

1.3.2 工藝優(yōu)化設(shè)計(jì)

（1）酶解工藝優(yōu)化。將牡蠣性腺分別用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、復(fù)合蛋白酶（胰蛋白酶∶木瓜蛋白酶=1∶1）進(jìn)行水解，以酶解液中游離氨基酸態(tài)氮含量為指標(biāo)，確定酶的種類。以水解度為指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇酶用量、pH值、酶解溫度進(jìn)行正交試驗(yàn)，優(yōu)化酶解條件。

表1 感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

（2）脫腥工藝優(yōu)化。參考劉艷[4]的研究采用活性炭聯(lián)合活性干酵母復(fù)合脫腥法對(duì)酶解液脫腥，以感官評(píng)分為指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇添加量、脫腥溫度、脫腥時(shí)間進(jìn)行正交試驗(yàn)，優(yōu)化脫腥條件。

（3）調(diào)配工藝配方參數(shù)。以產(chǎn)品感官品質(zhì)為指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn)，確定牡蠣性腺酶解液、食鹽、食醋、白砂糖、麥芽糖、醬油、味精、肌苷酸鈉和CMC-Na的最適添加量。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解工藝條件優(yōu)化

2.1.1 酶種類對(duì)酶解效果的影響

分別在其各自最適條件下用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、復(fù)合蛋白酶（胰蛋白酶∶木瓜蛋白酶=1∶1）3種酶進(jìn)行酶解，測(cè)定酶解液中游離氨基酸態(tài)氮含量。

不同種蛋白酶對(duì)酶解效果的影響見圖1。

圖1 不同種蛋白酶對(duì)酶解效果的影響

由圖1可知，這3種蛋白酶對(duì)牡蠣性腺的酶解能力不同，復(fù)合蛋白酶制備的酶解液氨基酸態(tài)氮含量較高，這與余杰等人[9]的研究結(jié)果相似，故選擇復(fù)合蛋白酶進(jìn)行酶解。

2.1.2 酶用量對(duì)酶解效果的影響

分別以 400，600，800，1000，1 200，1 400 U/g酶用量的復(fù)合蛋白酶，在pH值7.0，溫度60℃下水解6 h后測(cè)定水解度。

不同酶用量的酶解效果見圖2。

圖2 不同酶用量的酶解效果

由圖2可知，水解度隨著酶用量的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在酶用量為1 200 U/g時(shí)水解度最大，故酶用量選擇1 200 U/g。

2.1.3 pH值對(duì)酶解效果的影響

在復(fù)合蛋白酶酶用量為1 200 U/g下，調(diào)節(jié)pH值分別為6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，于60℃下酶解6 h后測(cè)定水解度。

不同pH值的酶解效果見圖3。

圖3 不同pH值的酶解效果

由圖3可知，隨著pH值的升高，水解度呈先增后降的趨勢(shì)，pH值為7.5時(shí)水解度最高。由文獻(xiàn)[1]可知胰蛋白酶和木瓜蛋白酶最適pH值分別為8.0和7.0，因此弱堿性條件下，這2種蛋白酶水解效果最好，酶解適宜pH值選擇7.5。

2.1.4 酶解溫度對(duì)酶解效果的影響

在復(fù)合蛋白酶酶用量為1 200 U/g，pH值7.5下，調(diào)節(jié)酶解溫度分別為40，45，50，55，60℃，酶解6 h后測(cè)定水解度。

不同酶解溫度的酶解效果見圖4。

圖4 不同酶解溫度的酶解效果

由圖4可知，隨著酶解溫度的升高，水解度呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)，當(dāng)酶解溫度達(dá)到55℃時(shí)，水解度最高，為38.89%。酶解溫度會(huì)影響酶解反應(yīng)速率與蛋白酶穩(wěn)定性，在適宜范圍內(nèi)，適當(dāng)提高溫度可以加快蛋白酶的催化反應(yīng)，而酶解溫度過(guò)高時(shí)，會(huì)導(dǎo)致蛋白酶變性失活。因此，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，酶解溫度選擇55℃。

2.1.5 最佳酶解條件的確定

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，研究復(fù)合蛋白酶用量、酶解pH值和酶解溫度對(duì)牡蠣性腺酶解效果的影響，以水解度作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行三因素三水平正交試驗(yàn)，優(yōu)化最佳酶解條件。

酶解工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 酶解工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果

由表2可知，酶用量（A）的極差最大，其次是pH值（B），最后是酶解溫度（C），影響酶解的主次因素為A＞B＞C，工藝參數(shù)最佳條件為A2B2C2，即復(fù)合蛋白酶用量1 200 U/g，pH值7.5，酶解溫度55℃。

2.2 脫腥工藝條件優(yōu)化

2.2.1 活性干酵母脫腥試驗(yàn)

根據(jù)參考文獻(xiàn)[4]，研究活性干酵母的添加量、脫腥時(shí)間和脫腥溫度對(duì)酶解液的脫腥效果有明顯的影響。以感官評(píng)分作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，設(shè)計(jì)了三因素三水平的正交試驗(yàn)。

活性干酵母脫腥效果正交試驗(yàn)結(jié)果見表3。

由表3可知，脫腥時(shí)間（B'）的極差最大，其次是酵母添加量（A'），最后是脫腥溫度（C'），影響脫腥效果的主次因素為B'＞A'＞C'，綜合考慮感官評(píng)分，活性干酵母脫腥最佳條件為A'2B'3C'3，即脫腥時(shí)間40 min，活性干酵母添加量2.0%，脫腥溫度40℃。

2.2.2 優(yōu)化活性炭聯(lián)合活性干酵母脫腥工藝條件

由于單獨(dú)使用活性干酵母脫腥后的酶解液會(huì)略帶異味，活性炭有多孔結(jié)構(gòu)，可以吸附異味小分子物質(zhì)，在脫腥的同時(shí)除去異味，故考慮采用活性炭聯(lián)用。以感官評(píng)分為指標(biāo)，先用2.0%活性干酵母，40℃脫腥40 min，再用活性炭脫腥。

活性炭聯(lián)合活性干酵母脫腥效果正交試驗(yàn)結(jié)果見表4。

表3 活性干酵母脫腥效果正交試驗(yàn)結(jié)果

由表4可知，活性炭添加量（A''）的極差最大，其次是脫腥時(shí)間（B''），最后是脫腥溫度（C''），影響脫腥效果的主次因素為A''＞B''＞C''，綜合考慮感官評(píng)分，活性干酵母脫腥最佳條件為A''2B''2C''2，即活性炭添加量4.0%，脫腥時(shí)間50 min，脫腥溫度45℃。

表4 活性炭聯(lián)合活性干酵母脫腥效果正交試驗(yàn)結(jié)果

2.3 調(diào)配工藝條件優(yōu)化

原輔料的添加量對(duì)調(diào)味品的感官品質(zhì)有重要影響，以感官評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行L27（39）正交試驗(yàn)。

調(diào)配工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果見表5。

表5 調(diào)配工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果

由表5可知，各個(gè)因素對(duì)感官評(píng)分的影響的主次排序?yàn)?C'''＞G＞B'''＞H＞E＞D＞J＞F＞A'''，綜合考慮感官評(píng)分，原輔料調(diào)配最佳條件為 A'''1B'''2C'''3D3E1F3G3H3J3，即各原輔料添加量分別為酶解液4%，食鹽15%，食醋8%，白砂糖6%，麥芽糖6%，醬油15%，味精0.30%，肌苷酸鈉0.15%，CMC-Na 0.30%。

3 結(jié)論

以水解度和感官評(píng)分為指標(biāo)，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，確定以牡蠣性腺為原料的新型牡蠣調(diào)味品生產(chǎn)工藝為采用胰蛋白酶∶木瓜蛋白酶=1∶1的復(fù)合蛋白酶，酶用量1 200 U/g，酶解pH值為7.5，酶解溫度為55℃；采用活性炭聯(lián)合活性干酵母脫腥，活性干酵母添加量為2.0%，40℃下脫腥40 min，活性炭添加量4.0%，45℃下脫腥50 min；原輔料添加量為酶解液4%，食鹽15%，食醋8%，白砂糖6%，麥芽糖6%，醬油15%，味精0.30%，肌苷酸鈉0.15%，CMC-Na 0.30%。試驗(yàn)開發(fā)的新型牡蠣調(diào)味品不僅感官品質(zhì)良好，還提高了牡蠣生產(chǎn)加工附加值，擁有廣闊的市場(chǎng)發(fā)展空間。