李正堃 李慧瑾

摘 要

目的：構(gòu)建 HIF1α-shRNA表達(dá)載體并鑒定，為進(jìn)一步研究其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用奠定基礎(chǔ)。方法：設(shè)計(jì)合成兩條互補(bǔ)的編碼HIF1α-shRNA的DNA寡核苷酸單鏈，退火形成互補(bǔ)雙鏈，后將退火產(chǎn)物與酶切線性化的表達(dá)載體pG1.1連接后，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞DH5α中，提取重組質(zhì)粒并酶切鑒定，挑取克隆正確的重組質(zhì)粒去測序鑒定插入序列。結(jié)果：重組質(zhì)粒酶切結(jié)果顯示退火片段連接到pG1.1載體里，經(jīng)測序分析重組質(zhì)粒插入序列與合成的寡核苷酸序列一致。結(jié)論：HIF1α-shRNA表達(dá)載體構(gòu)建成功，為后續(xù)研究提供基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞

HIF1α;shRNA;載體構(gòu)建

中圖分類號(hào)： Q78;R378.11 ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

DOI：10.19694/j.cnki.issn2095-2457.2020.07.062

缺氧誘導(dǎo)因子-1（hypoxia-inducible factor-1， HIF-1）最初是從缺氧誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞Hep3B的細(xì)胞核中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，由氧敏感的α 亞基（HIF-1α）和持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)的β亞基（HIF-1β）以異源二聚體的形式組成，HIF-1α是調(diào)節(jié)亞單位，決定HIF-1的活性，HIF-1β則與穩(wěn)定HIF-1及其二聚化有關(guān)[1]。已經(jīng)證實(shí)，HIF-1可介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生一系列的缺氧適應(yīng)反應(yīng)，與腫瘤細(xì)胞的糖酵解途徑密切相關(guān)，使腫瘤細(xì)胞在相對(duì)缺氧的狀態(tài)下獲得更多的能量供應(yīng)，以維持存活、生長和分裂[2]。本研究將構(gòu)建HIF1α-shRNA表達(dá)載體，為進(jìn)一步研究其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用提供生物學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

表達(dá)載體pG1.1（武漢巴菲爾），限制性內(nèi)切酶BsaI、SacI （美國NEB），T4 DNA連接酶、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、感受態(tài)細(xì)胞DH5α（北京天根），DNA寡核苷酸由上海生工合成。

1.2 方法

1.2.1 序列設(shè)計(jì)合成

已驗(yàn)證有效干擾HIF1α表達(dá)的siRNA正義鏈序列為5'-GCCTCTTTGACAA

ACTTAA-3'，依據(jù)pG1.1載體的插入位點(diǎn)和接頭結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)合成兩條互補(bǔ)的編碼HIF1α-shRNA的DNA寡核苷酸單鏈，結(jié)構(gòu)為BsaI +Sense+Loop+Antisensecomplement+終止信號(hào)+SacI+BsaI，具體序列見表1。

1.2.2 載體酶切回收

用BSAI完全酶切pG1.1載體，1%瓊脂糖凝膠電泳回收大片段，即為線性化載體。酶切體系如下：pG1.1 2μg，BsaI 2μl，10×buffer 4μl，100×BSA 0.4μl，H2O補(bǔ)足40μl，37℃水浴酶切過夜，酶切結(jié)果見圖1。

1.2.3 退火形成雙鏈

分別用30μl annealing buffer溶解2OD兩條互補(bǔ)DNA寡核苷酸單鏈，各取2μl，加16μl annealing buffer混勻，94℃退火自然冷卻至室溫，各取1μl退火產(chǎn)物加99μl H2O做100倍稀釋。

1.2.4 載體連接轉(zhuǎn)化

連接反應(yīng)體系如下：稀釋退火片段1μl，線性化載體1μl，5×Ligase Buffer 2μl，T4 DNA Ligase 1μl，H2O 5μl，4℃反應(yīng)過夜。取10μl連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，涂布于含Kana抗性（終濃度為30ug/ml）的LB平板上，37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。從每個(gè)培養(yǎng)皿上挑取數(shù)個(gè)單克隆菌落接種于5ml含Kana抗性（終濃度為30ug/ml）的LB培養(yǎng)液中，37℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)過夜。

1.2.5 載體鑒定

提取重組質(zhì)粒并分別用SacI做酶切鑒定，酶切體系如下：DNA 8.5μl，10 ×Buffer 1μl，SacI 0.5μl，37℃水浴反應(yīng)2h，1%瓊脂糖凝膠電泳，挑取克隆正確的重組質(zhì)粒去測序鑒定插入序列。

2 結(jié)果

因?yàn)檩d體pG1.1里面本來只有一個(gè)SacI的酶切位點(diǎn)，但是重組質(zhì)粒能夠被SacI酶切出一條約900bp DNA條帶，說明退火片段連接到pG1.1載體里，酶切結(jié)果見圖2。經(jīng)測序分析重組質(zhì)粒插入序列與合成的寡核苷酸序列一致，HIF1α-shRNA表達(dá)載體構(gòu)建成功，測序比對(duì)結(jié)果見圖3。

3 討論

研究證明絕大多數(shù)實(shí)體腫瘤組織中存在缺氧微環(huán)境，這一刺激因素能增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞抗凋亡能力、促進(jìn)腫瘤血管生長、增加腫瘤對(duì)化療藥物耐受性，從多方面加速腫瘤的惡性進(jìn)展，尤為重要的是缺氧能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），并在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[3]。腫瘤細(xì)胞對(duì)缺氧刺激的反應(yīng)體現(xiàn)在下游靶基因的表達(dá)變化而影響細(xì)胞的生物學(xué)功能，而調(diào)控這些差異表達(dá)基因的最為重要的轉(zhuǎn)錄因子就是HIF[4]。

HIF轉(zhuǎn)錄因子包括HIF1、HIF2和HIF3，它們在缺氧環(huán)境中發(fā)揮各自不同的功能，其中HIF1已被證實(shí)參與調(diào)控腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移、血管形成、糖酵解等過程，并與卵巢癌、宮頸癌、肺癌、乳腺癌等多種腫瘤不良預(yù)后密切相關(guān)[5]。HIF1由α及β兩個(gè)亞基聚合活化后才能入核調(diào)控下游靶基因的表達(dá)。HIF1α蛋白的氧依賴性降解區(qū)（oxygen-dependent degradation domain，ODD）脯氨酸在常氧條件下會(huì)被羥基化，使得HIF1α蛋白進(jìn)入E3泛素連接酶VHL（Von Hippel Lindau）介導(dǎo)的泛素化降解途徑，而β亞基（也被稱為芳香烴受體核轉(zhuǎn)位蛋白，aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator，ARNT）為組成性表達(dá)，可穩(wěn)定存在。在缺氧條件下，穩(wěn)定的HIF1α與β亞基結(jié)合形成二聚體后入核，HIF1蛋白可作為轉(zhuǎn)錄因子募集CBP和p300結(jié)合到下游靶基因啟動(dòng)子或增強(qiáng)子中的HRE上，激活靶基因的轉(zhuǎn)錄[6]。因此，HIF1α的穩(wěn)定性決定了HIF1的生物學(xué)功能的發(fā)揮。

本研究構(gòu)建了HIF-1α-shRNA表達(dá)載體，經(jīng)酶切和測序鑒定證實(shí)構(gòu)建成功。該表達(dá)載體在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄生成shRNA后，通過Dicer酶剪切生成siRNA，從而干涉HIF-1α表達(dá)。該表達(dá)載體為后續(xù)研究HIF-1α的功能提供基礎(chǔ)，可以瞬時(shí)干涉HIF-1α進(jìn)一步篩選后得到穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株，觀察缺氧環(huán)境下腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移等改變，從而更深入認(rèn)識(shí)HIF-1α對(duì)腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)作用。

參考文獻(xiàn)

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[6]Greer SN， Metcalf JL， Wang Y， Ohh M. The updated biology of hypoxia-inducible factor. EMBO J，2012，31（11）：2448-2460.