汪小龍，咸靜女，陳剛，彭海波

中國海洋大學(xué) 海洋生命科學(xué)學(xué)院 生物工程系，山東 青島 266003

對于癌癥、病毒性感染等疾病，迄今臨床上仍缺少理想的特效藥物。隨著人類及重要模式生物基因組測序的完成，以及功能基因組學(xué)及蛋白質(zhì)組學(xué)研究的深入，與疾病相關(guān)的分子靶標(biāo)不斷被發(fā)現(xiàn)和認(rèn)識，為基因治療提供了前提。在過去的幾十年里，人工合成的寡核苷酸已經(jīng)廣泛應(yīng)用于靶向基因治療的研究，主要包括反義寡核苷酸(Antisense oligonucleotides, ASODN)、小干擾 RNA(Small interference RNA, siRNA)、轉(zhuǎn)錄因子誘餌(Decoy)、核酶 (Ribozyme)、脫氧核酶 (DNAzyme)、反基因 (Antigene)、CpG寡核苷酸和核酸適配體(Aptamer) 等。其中ASODN和siRNA是最常用的基因調(diào)控工具，獲得廣泛應(yīng)用，并已被開發(fā)為基因治療藥物。目前，寡核苷酸主要采用化學(xué)方法合成，其初產(chǎn)品純度低，難以純化，大量制備成本十分高昂，大大限制了寡核苷酸藥物的研究和應(yīng)用。本文綜述了寡核苷酸藥物的類別、作用原理及其特點(diǎn)，指出了寡核苷酸常規(guī)化學(xué)制備方法存在的問題，并介紹了新型核酸擴(kuò)增及寡核苷酸制備方法的研究進(jìn)展。

1 寡核苷酸藥物的類別及其作用原理

1.1 反義寡核苷酸

反義寡核苷酸 (Antisense oligonucleotides,ASODNs) 是指人工合成的、與特定基因互補(bǔ)的寡核苷酸 (DNA或 RNA) 及其類似物，長度為13?25個堿基的核酸片段，它可以通過堿基互補(bǔ)配對原則結(jié)合于靶基因或靶RNA上，從而抑制基因的表達(dá)[1]。很多遺傳性、代謝性和病毒性疾病都是由于基因表達(dá)異常引起的。反義寡核苷酸作為藥品的原理是利用堿基互補(bǔ)配對原則與特定的信使RNA (Messenger RNA，mRNA) 進(jìn)行配對，抑制其表達(dá)，阻斷遺傳信息從 DNA傳遞到蛋白質(zhì)。根據(jù)核酸雜交原理，反義寡核苷酸能與特定的基因、病毒核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物結(jié)合，特異性抑制致病基因或病毒基因的表達(dá)。通過反義寡核苷酸抑制致癌基因或病毒的關(guān)鍵編碼基因，可特異性抑制腫瘤細(xì)胞增殖生長并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[2]。靶向mRNA或 microRNA的反義寡核苷酸，已被廣泛用作分子生物學(xué)的研究工具，以特異性和選擇性地下調(diào)特定基因的表達(dá)?；虮磉_(dá)的產(chǎn)物是蛋白質(zhì)，傳統(tǒng)小分子藥物主要作用于致病蛋白質(zhì)，而反義寡核苷酸藥物則直接作用于致病基因本身，因此比小分子化學(xué)藥物更具選擇性，而且具有高效、低毒、穩(wěn)定有效、不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)，是理想的抗癌和抗病毒藥物[3]。第一個通過美國食品及藥品管理局 (Food and Drug Administration，F(xiàn)DA) 咨詢委員會認(rèn)證并應(yīng)用于臨床的反義核酸藥物是用于治療艾滋 (AIDS) 病人巨細(xì)胞病毒感染的視網(wǎng)膜炎的福米韋生 (Fomivirsen或Virtravene)[4]。然而，早先的實(shí)驗室或臨床研究中一些反義核酸穩(wěn)定性、特異性和有效性不高，并且存在嚴(yán)重的毒副作用，因此學(xué)術(shù)界一度對反義核酸藥物產(chǎn)生質(zhì)疑，并導(dǎo)致上世紀(jì)末反義核酸藥物的研發(fā)相對較為緩慢。

然而，近年來一些高效的新型反義核酸藥物的出現(xiàn)，使反義核酸藥物研究得以復(fù)興。反義寡核苷酸作為用于抗腫瘤、抗病毒治療的藥物，是目前最有應(yīng)用前景的基因靶向治療藥物。目前有數(shù)十種反義寡核苷酸藥物正在進(jìn)行臨床試驗或動物實(shí)驗，針對包括癌癥、肥胖、心血管疾病、精神病、代謝性疾病和病毒感染等。靶向作用于miRNA或 mRNA的反義寡核苷酸預(yù)計能用于治療多種人類疾病。2013年 1月美國 ISIS公司和Genzyme公司合作的一大成果——反義寡核苷酸藥物Mipomersen (商品名KYNAMRO?) 通過美國FDA認(rèn)證[5-6]。Mipomersen是合成的烷基修飾反義寡核苷酸輔助降脂藥物，通過抑制載脂蛋白ApoB-100的mRNA，以降低家族性高膽固醇血癥(HoFH) 患者的低密度脂蛋白膽固醇 (LDL-C)、載脂蛋白B (Apo B)、總膽固醇 (TC) 和非高密度脂蛋白膽固醇 (非高密度脂蛋白C)[7-9]。

如圖1所示，針對成熟mRNA，既可以設(shè)計反義寡核苷酸，使其與mRNA結(jié)合形成雜合體，利用RNase H識別并酶解DNA:RNA雜合體的作用，使mRNA降解，從而抑制基因表達(dá)；也可以針對mRNA 5′-非翻譯區(qū)設(shè)計反義寡核苷酸，使其翻譯受阻。另外，針對前體mRNA，還可以在內(nèi)含子與外顯子剪切位點(diǎn)處設(shè)計反義寡核苷酸，使其不能正常剪切，稱為剪切捕獲 (Splicing arrest)，此方法已經(jīng)成功應(yīng)用于杜氏肌營養(yǎng)不良 (Duchenne muscular dystrophy，DMD) 的基因治療[10-14]。DMD 是抗肌萎縮蛋白 (肌營養(yǎng)蛋白) 外顯子跳讀 (Exon skipping) 引起的。2016年9月19日，F(xiàn)DA批準(zhǔn)Sarepta Therapeutics公司的反義RNA藥物Eteplirsen (Exondys 51)，用于治療外顯子51跳讀型杜氏肌營養(yǎng)不良。Eteplirsen通過靜脈注射給藥，可幫助51號外顯子跳讀DMD患者合成一些抗肌萎縮蛋白，延緩疾病進(jìn)程，是FDA批準(zhǔn)的首個DMD藥物。

圖1 反義寡核苷酸設(shè)計原理示意圖Fig. 1 Schematic diagram of antisense oligonucleotide.

圖2 RNA干擾原理示意圖 (圖片引自文獻(xiàn)[15])Fig. 2 Schematic diagram of RNA interference[15].

1.2 小分子干擾RNA

小分子干擾RNA (Small interfering RNA, siRNA)是一類長度在20?25 bp的雙鏈RNA片段。siRNA通過與特定的核酸序列互補(bǔ)而影響特定基因的表達(dá)，在生物體內(nèi)許多代謝過程中扮演重要角色。RNA干擾的原理如圖2所示，siRNA通過結(jié)合到靶標(biāo) mRNA上使其降解或抑制其翻譯[15]。Hamilton等于1999年首先在Science雜志報道發(fā)現(xiàn)了 siRNAs在植物轉(zhuǎn)錄后基因沉默中的作用[16]。Lagos-Quintana等2003年在Nature雜志報道了化學(xué)合成的 siRNA可以在哺乳動物細(xì)胞中引起RNAi作用[17]。隨后一系列的發(fā)現(xiàn)激發(fā)了學(xué)術(shù)界和產(chǎn)業(yè)界應(yīng)用 RNAi技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)研究和藥物開發(fā)上的熱情。作為基因治療藥物研究的熱點(diǎn)，小分子干擾RNA研究方興未艾，然而至今尚未有siRNA藥物開發(fā)成功上市。究其原因，是由于siRNA與靶標(biāo)的結(jié)合并非一一對應(yīng)，而是具有一定的非特異性，容易產(chǎn)生脫靶效應(yīng)[18-19]。與反義寡核苷酸相比，siRNA既有級聯(lián)放大效應(yīng)帶來的作用顯著、需要劑量低的優(yōu)點(diǎn)，但又有穩(wěn)定性差、容易被降解和難以被輸送到靶細(xì)胞的缺點(diǎn)。

1.3 核酸適配體

核酸適配體 (Aptamer) 是一類由化學(xué)合成的單鏈RNA或單鏈DNA寡核苷酸組成的小分子核酸配基[20]。其原理如圖3所示，核酸適配體能夠折疊形成高級結(jié)構(gòu)，并通過識別特異的三維結(jié)構(gòu)，與其靶標(biāo)進(jìn)行相互作用，具有高特異性和親和性，故而又有化學(xué)抗體之稱。

與普通的蛋白抗體相比，核酸適配體有諸多優(yōu)點(diǎn)：一是由于其分子量較低 (8–25 kDa)，因此能夠快速滲透組織；二是適配體在體內(nèi)幾乎不會引起免疫反應(yīng)[21]；三是由于核酸適配體分子本質(zhì)上具有很強(qiáng)的熱穩(wěn)定性；四是核酸適配體識別范圍非常廣，能夠識別離子、藥物、毒素、蛋白質(zhì)[22]、病毒[23]、細(xì)菌[24]、癌細(xì)胞[25]，甚至腫瘤和組織[26-27]。

近年來，核酸適配體已被應(yīng)用于臨床研究，例如能與血管內(nèi)皮生長因子特異性結(jié)合的一種RNA適配體藥物Macugen已被美國FDA批準(zhǔn)用于老年濕性黃斑變性 (Wet age-related macular degeneration) 以及家族性滲出性玻璃體視網(wǎng)膜病變 (Familial exudative vitreoretinopathy) 的治療[28-30]。另外，如表1所示，目前還有多種適配體藥物處于臨床試驗階段。

表1 處于臨床試驗階段的治療性核酸適配體Table 1 Therapeutic aptamers in clinical trials stage

1.4 三股螺旋寡核苷酸

通過特異性識別 DNA雙螺旋中的多聚嘌呤或多聚嘧啶區(qū)域，寡核苷酸能夠與DNA雙螺旋的大溝或小溝結(jié)合形成局部三股螺旋結(jié)構(gòu)[31-33]，被稱為三股螺旋寡核苷酸 (Triplex-forming oligonucleotide,TFO)。如圖4所示，TFO能夠?qū)δ繕?biāo)基因有效定位及封鎖，在轉(zhuǎn)錄水平抑制基因表達(dá)[34]，或在人體細(xì)胞中直接對基因組 DNA進(jìn)行修飾以修復(fù)遺傳損傷[35]，有著重要應(yīng)用潛力和研究價值。

圖3 核酸適配體識別靶標(biāo)示意圖Fig. 3 Schematic diagram of aptamer binding to its target.

圖 4 三股螺旋寡核苷酸抑制轉(zhuǎn)錄延伸 (圖片引自文獻(xiàn)[34])Fig. 4 Triplex-forming oligonucleotide block the transcription elongation[34].

1.5 轉(zhuǎn)錄因子誘餌寡核苷酸

轉(zhuǎn)錄因子誘餌寡核苷酸 (Decoy ODN) 是新一代強(qiáng)有力的反義基因策略，用于治療多種疾病，并可確定某種特定基因表達(dá)的分子機(jī)制。如圖 5所示，誘餌寡核苷酸是雙鏈的，其序列與順式作用元件的序列是一致的，因此能夠通過競爭性結(jié)合抑制轉(zhuǎn)錄因子的功能作用。因此，用于轉(zhuǎn)染的雙鏈decoy ODN能夠減弱基因組中真正的順式作用元件和反式作用元件的相互作用，導(dǎo)致結(jié)合在內(nèi)生性順式元件上的反式因子被移除，控制目標(biāo)基因的表達(dá)，從而發(fā)揮基因治療作用[36]。

轉(zhuǎn)錄誘餌寡核苷酸已被試用于多種人類腫瘤和遺傳性疾病的基因治療。Morishita研究組以轉(zhuǎn)錄因子E2F的轉(zhuǎn)錄誘餌來抑制動脈粥樣硬化和動脈內(nèi)膜增生相關(guān)基因的表達(dá)，以治療冠心病和血管增殖性心血管疾病[36-38]。如表2所示，目前還有很多轉(zhuǎn)錄誘餌寡核苷酸正在進(jìn)行臨床研究，預(yù)期具有良好的應(yīng)用前景。

圖 5 誘餌寡核苷酸法抑制轉(zhuǎn)錄因子 (TF) 的功能(圖片引自文獻(xiàn)[36])Fig. 5 The decoy oligonucleotide approach to block the function of the transcription factor (TF)[36].

1.6 核酶和脫氧核酶

早在1981年，Zaug等發(fā)現(xiàn)四膜蟲rRNA的前體在沒有蛋白質(zhì)酶的催化作用下能專一性地催化寡核苷酸底物的連接與切割，證明RNA分子也具有催化活性，稱之為核酶 (Ribozyme)[39]。直到20世紀(jì)80年代末90年代初，核酶的結(jié)構(gòu)才有了初步的了解，是一種簡單的催化結(jié)構(gòu)域——錘頭結(jié)構(gòu) (Hammerhead ribozyme)[40]。核酶可以很容易地用化學(xué)方法合成，隨著對核酶功能以及結(jié)構(gòu)研究的不斷深入，核酶在抑制目的基因表達(dá)的研究過程中得到了廣泛的應(yīng)用。

由于核酶具有不穩(wěn)定性，且利用化學(xué)修飾的過程比較復(fù)雜，1997年Santoro等通過體外篩選的方法設(shè)計出了一種依賴Mg2+離子、可特異性切割RNA的脫氧核酶 (DNAzyme)[41]。如圖6所示，DNAzyme有兩條任意可變的結(jié)合臂 (armⅠ和armⅡ)，中間的催化中心含有 14–15個堿基的保守序列。其中10–23 DNAzyme對底物RNA的要求是切割部位核心序列含有RY (R=A/G, Y=C/U)。與核酶相比，DNAzyme更易合成，對化學(xué)物質(zhì)或核酸酶有較高的抵抗力，而且 DNAzyme對于DNA:RNA 雜合鏈與RNA:RNA 雙鏈在酶的評價指標(biāo)方面 (如底物的選擇性、靶向性、酶的轉(zhuǎn)換率、催化效率等)，與核酶相比均有所提高[41]。DNAzyme目前已經(jīng)廣泛用于治療肝炎[42]、艾滋病[43]、癌癥[44-46]等重大人類疾病的研究中。

2 寡核苷酸大規(guī)模制備技術(shù)存在的問題

規(guī)?；a(chǎn)是藥物開發(fā)的基礎(chǔ)，這一點(diǎn)對于反義寡核苷酸藥物尤為重要。反義寡核苷酸藥物是目前最為成熟的寡核苷酸藥物，但由于其沒有級聯(lián)放大作用，在臨床和動物實(shí)驗中使用劑量大，高達(dá) 25?50 mg/kg[47]或 800?1 000 mg/周[48]。因此，作為藥物的寡核苷酸必須能夠規(guī)?；a(chǎn)，合成克級甚至千克級的寡核苷酸，并要降低成本，才有可能開展臨床和動物實(shí)驗。目前寡核苷酸幾乎都是使用化學(xué)方法合成，即采用固相亞磷酰胺三酯法合成，并用高效液相色譜分離純化。常規(guī)的DNA合成儀只能合成毫克級的寡核苷酸，大規(guī)模DNA合成必須采用克級和千克級DNA合成儀，如GE Healthcare公司生產(chǎn)的?KTA OligoPilot系列。目前僅有少數(shù)大型國際生物制藥公司，如美國ISIS公司和丹麥的Santaris公司，才有能力合成千克級的寡核苷酸，開展反義藥物的大規(guī)模臨床研究。國內(nèi)僅有軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院王升啟等開展了寡核苷酸大規(guī)模合成及動物實(shí)驗[49]，但目前尚無核酸藥物上市或進(jìn)入臨床實(shí)驗。究其主要原因，大規(guī)模合成寡核苷酸，儀器設(shè)備成本過于高昂，一直是寡核苷酸藥物研究的瓶頸。

表2 用誘餌寡核苷酸作為基因治療的潛在靶標(biāo)轉(zhuǎn)錄因子Table 2 Transcription factors as potential therapeutic targets for gene manipulation by using decoy oligonucleotides

圖 6 兩種 DNAzyme (8–17和10–23) 與底物RNA結(jié)合和切割位點(diǎn)示意圖 (圖片引自文獻(xiàn)[41])Fig. 6 The binding and cleaving of the RNA substrates by two different (8–17 and 10–23) DNAzymes[41].

另外，化學(xué)合成寡核苷酸初產(chǎn)品被雜質(zhì)和截短的錯誤序列 (又叫失敗序列) 所污染，使產(chǎn)物純化十分困難。產(chǎn)生這些失敗序列的原因是在合成過程中脫三苯甲基 (Detritylation)、耦合 (Coupling)、硫化 (Sulfurization) 或保護(hù) (Capping) 等反應(yīng)不完全造成的，因此，必須對寡核苷酸粗產(chǎn)品進(jìn)行純化。然而合成寡核苷酸中最難以除去的雜質(zhì)是大量 (n–1) 缺失序列 (與完整長度為n的寡核苷酸相比僅相差一個核苷酸)。對于長度為18–21堿基對的寡核苷酸，用高效液相色譜法幾乎無法從產(chǎn)品中完全除去 (n–1) 缺失序列[50]。此外，合成過程需要采用多種有害化學(xué)試劑，例如去保護(hù)試劑——三氯乙酸 (TCA) 或二氯乙酸 (DCA)，必須溶解在鹵化溶劑中 (通常是二氯甲烷)。二氯甲烷具有高毒性、高揮發(fā)性和致癌性。因此，大規(guī)模的寡核苷酸生產(chǎn)不僅成本高昂，而且涉及到使用和處理危險化學(xué)品，對環(huán)境和人體存在潛在的威脅。

3 核酸擴(kuò)增技術(shù)應(yīng)用于制備寡核苷酸

寡核苷酸在現(xiàn)代分子生物技術(shù)和生物制藥研究中應(yīng)用十分廣泛。對具有特定序列的目標(biāo)寡核苷酸進(jìn)行擴(kuò)增，不僅是一個需要克服的技術(shù)難題，而且在生物醫(yī)藥科學(xué)研究中具有重要的應(yīng)用價值。商業(yè)化藥物生產(chǎn)需要大量 (以千克計) 的寡核苷酸。傳統(tǒng)的化學(xué)合成寡核苷酸不僅成本高昂，而且初產(chǎn)品純度低、難以純化，十分不利于臨床研究和大規(guī)模藥物生產(chǎn)。因此，開發(fā)一種簡單、經(jīng)濟(jì)和安全的寡核苷酸大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)方法已成為必要，而采用生物技術(shù)，用核酸擴(kuò)增方法制備寡核苷酸無疑是最佳方案。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (Polymerase chain reaction,PCR) 技術(shù)自誕生以來[51]，一直是核酸擴(kuò)增的主要方法。PCR和逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)在用于擴(kuò)增有足夠長度的DNA和RNA時簡單而有效。但無法用PCR技術(shù)直接擴(kuò)增短鏈寡核苷酸和siRNA。因為它們往往只有18–30個核苷酸的長度，無法設(shè)計一對特異性PCR引物。用PCR來擴(kuò)增寡核苷酸或 siRNA，首先必須設(shè)法將目標(biāo)延長 (如加接頭或使用通用引物)，如此不可避免地會在產(chǎn)物中引入非目標(biāo)序列。這在檢測分析方法中沒有問題，但對于制備方法而言，非常不利于后期分離純化。而且由于底物是修飾性dNTPs，價格非常昂貴，產(chǎn)物中如果含有非目標(biāo)序列，會造成底物 (dNTPs)的浪費(fèi)，是難以接受的。另外，更重要的是PCR只是將寡核苷酸引物延伸，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的分子數(shù)不可避免地受輸入寡核苷酸引物分子數(shù)的限制，因此PCR只能實(shí)現(xiàn)DNA分子量增加，而無法使寡核苷酸分子數(shù)目增加。因此，PCR技術(shù)不適合進(jìn)行短鏈寡核苷酸或siRNA的大量制備。

近年來，基于核酸擴(kuò)增技術(shù)的檢測和診斷方法已獲得廣泛應(yīng)用，給臨床診斷提供了快速、靈敏和準(zhǔn)確的方法。因此，國內(nèi)外眾多學(xué)者不斷致力于改進(jìn)和探索新型核酸擴(kuò)增技術(shù)，已經(jīng)建立了多種多樣的新型核酸擴(kuò)增方法。按照擴(kuò)增過程中溫度是否變化來劃分，核酸擴(kuò)增方法可分為熱循環(huán)擴(kuò)增和恒溫擴(kuò)增兩大類。熱循環(huán)擴(kuò)增主要包括經(jīng)典的核酸擴(kuò)增技術(shù)——PCR[51-52]和連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (Ligase chain reaction, LCR)[53-55]，而恒溫擴(kuò)增主要包括鏈置換擴(kuò)增 (Strand displacement amplification, SDA)[56-58]、滾環(huán)擴(kuò)增 (Rolling circle amplification, RCA)[59-61]、環(huán)介導(dǎo)擴(kuò)增 (Loop mediated amplification, LAMP)[62-63]、依賴解旋酶擴(kuò)增(Helicase-dependent amplification, HDA)[64-65]、依賴核酸序列的擴(kuò)增 (Nucleic acid sequence based amplification，NASBA)[66-67]，等等。

這些DNA擴(kuò)增技術(shù)和PCR一樣，都需設(shè)計并采用至少一對化學(xué)合成的寡核苷酸作為引物，不可避免地會在產(chǎn)物中引入非目標(biāo)序列。此外，這些方法只是將寡核苷酸引物延伸，其擴(kuò)增產(chǎn)物的分子數(shù)也同樣不可避免地受輸入寡核苷酸引物濃度的限制，二次擴(kuò)增必須加入新的寡核苷酸引物。因而一般也都不適合大量制備長度約20個堿基左右的寡核苷酸。

目前，已報道的專門用于擴(kuò)增和制備短寡核苷酸的方法極少。指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng) (EXPAR) 是一個極為快速的恒溫反應(yīng)[68]，能夠在10 min內(nèi)快速擴(kuò)增和制備目標(biāo)寡核苷酸。EXPAR依賴于切刻內(nèi)切酶Nt.BstNBI和具有鏈置換活性的DNA聚合酶，因此又被命名為切刻酶擴(kuò)增反應(yīng) (Nicking enzyme amplification reaction, NEAR)[69]。然而，目前EXPAR的應(yīng)用十分有限，因為據(jù)報道該反應(yīng)存在嚴(yán)重的非特異性擴(kuò)增[70]。此外，該反應(yīng)產(chǎn)物是單鏈的，僅對目標(biāo)鏈進(jìn)行擴(kuò)增，而其模板 (反義鏈)并未得到擴(kuò)增。并且，EXPAR反應(yīng)無法進(jìn)行二次擴(kuò)增，產(chǎn)量還是會受輸入模板分子數(shù)目的限制，因此也不適合大量制備寡核苷酸。另外，滾環(huán)復(fù)制 (Rolling circle replication, RCR) 方法已被用于擴(kuò)增環(huán)形DNA，可用于制備寡核苷酸[71]。然而，每輪 RCR擴(kuò)增之前都必須要進(jìn)行費(fèi)時費(fèi)力的人工酶切、連接和重新環(huán)化，使之不適合進(jìn)行自動化的大規(guī)模寡核苷酸制備。最近，Ducani等在Nature Method雜志報道改進(jìn)版的RCR方法，稱為 Monoclonal stoichiometric (MOSIC) 方法[72]。MOSIC方法依賴于具有鏈置換活性的Phi29 DNA聚合酶，以及特殊的內(nèi)切酶 BseGI，可按照預(yù)設(shè)的比例產(chǎn)生多個目標(biāo)序列的單鏈寡核苷酸，預(yù)期可用于 DNA納米材料的制備。但目前該方法尚未實(shí)現(xiàn)制備帶有修飾基團(tuán)的藥用寡核苷酸。

4 新型核酸擴(kuò)增方法——PEAR技術(shù)及其在寡核苷酸制備中的應(yīng)用

如前所述，現(xiàn)有核酸擴(kuò)增技術(shù)在應(yīng)用于寡核苷酸擴(kuò)增時均存在一定的困難。2010年Wang等研究開發(fā)了一種新型熱循環(huán)酶促生物化學(xué)反應(yīng)，稱為聚合酶-內(nèi)切酶擴(kuò)增反應(yīng) (PEAR)[73]，用于擴(kuò)增和大量制備寡核苷酸。PEAR技術(shù)采用含有重復(fù)目標(biāo)序列及酶切位點(diǎn)的雙鏈DNA作為“種子”，通過獨(dú)特的“滑動-切割機(jī)制”，用耐熱 DNA聚合酶延伸，耐熱限制性內(nèi)切酶切割，在熱循環(huán)控制下，使寡核苷酸等小分子核酸能夠像病毒一樣自我復(fù)制，擴(kuò)增特定的目標(biāo)寡核苷酸。PEAR擴(kuò)增產(chǎn)物的分子數(shù)能夠以指數(shù)模式持續(xù)增加，并且不受輸入初始“種子”寡核苷酸分子數(shù)的限制。PEAR產(chǎn)物無需經(jīng)過任何處理，無需加入新的引物和模板，直接作為“種子”進(jìn)行二次擴(kuò)增。

PEAR反應(yīng)DNA聚合酶和內(nèi)切酶的選擇范圍很大，可制備各種天然和修飾寡核苷酸。目前用PEAR技術(shù)已經(jīng)成功擴(kuò)增和制備了帶有硫代[74]和氟代[75]修飾基團(tuán)的寡核苷酸。經(jīng)高效液相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測，表明PEAR產(chǎn)物中目標(biāo)寡核苷酸所占比例很高。由于避免了產(chǎn)生 (n–1) 缺失序列，純化過程十分容易。對于雙鏈寡核苷酸而言，則無需進(jìn)行高效液相色譜分離，用普通柱層析純化后即可。因而，PEAR技術(shù)特別適合制備雙鏈寡核苷酸，如轉(zhuǎn)錄因子誘餌。

PEAR技術(shù)具有操作簡便、高效和穩(wěn)定的特點(diǎn)，能夠快速、準(zhǔn)確、穩(wěn)定地擴(kuò)增寡核苷酸，產(chǎn)物純度高。PEAR所采用的DNA聚合酶和內(nèi)切酶等主要原材料都是純生物制劑，生產(chǎn)過程安全無污染。并且，用PEAR方法制備寡核苷酸不需要昂貴的大規(guī)模 DNA合成儀，而是采用價格低廉的熱循環(huán)儀。因此，大規(guī)模生產(chǎn)的設(shè)備和材料費(fèi)用均可大大降低。PEAR作為一種簡單而高效的寡核苷酸擴(kuò)增和制備方法，能夠解決上述寡核苷酸生產(chǎn)中所存在的諸多問題。

5 結(jié)論

寡核苷酸藥物研究方興未艾，應(yīng)用前景廣闊。寡核苷酸通常采用化學(xué)方法合成，但化學(xué)合成寡核苷酸會出現(xiàn)錯誤，純度較低，而純化十分困難。而且，由于天然的寡核苷酸在體內(nèi)會被很快降解，具有一些毒副作用，因此作為藥物的寡核苷酸必須帶有修飾基團(tuán)，增強(qiáng)寡核苷酸在體內(nèi)的穩(wěn)定性。大規(guī)?；瘜W(xué)合成寡核苷酸的成本十分高昂，大大限制了寡核苷酸藥物的研究和應(yīng)用。目前已經(jīng)出現(xiàn)了多種核酸擴(kuò)增方法，但均不適用于大量制備寡核苷酸。新的寡核苷酸擴(kuò)增方法“聚合酶-內(nèi)切酶擴(kuò)增反應(yīng)” (PEAR) 使寡核苷酸等小分子核酸能夠在兩種耐熱酶的催化作用下，通過熱循環(huán)進(jìn)行自我復(fù)制，并實(shí)現(xiàn)指數(shù)擴(kuò)增。這種新的寡核苷酸生產(chǎn)方法具有很多優(yōu)點(diǎn)，能解決目前寡核苷酸制造中的諸多問題。該方法采用大容量熱循環(huán)儀生產(chǎn)寡核苷酸，設(shè)備成本低，適合大量生產(chǎn)修飾寡核苷酸。PEAR技術(shù)是擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的核酸擴(kuò)增技術(shù)，很有可能用于大量生產(chǎn)成分更純、成本低廉的寡核苷酸類藥物，有助于推動寡核苷酸藥物的研究和應(yīng)用。

附表1 各名詞全稱及縮寫歸納表Appendix 1 Abbreviations

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